松墨天牛寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B的克隆與表達(dá)分析

蔡紫玲，吳華俊，林 同

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東廣州 510642）

松墨天牛寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B的克隆與表達(dá)分析

蔡紫玲，吳華俊，林 同

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東廣州 510642）

為闡明松墨天牛寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和在不同蟲(chóng)態(tài)、成蟲(chóng)的不同部位以及幼蟲(chóng)組織中的表達(dá)情況，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和快速擴(kuò)增cDNA末端（RACE）技術(shù)克隆松墨天牛STT3B基因cDNA，命名為MaSTT3B，其GenBank登錄號(hào)為KT362368。序列分析顯示其長(zhǎng)度為2 552 bp，其中開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)2 322 bp，編碼773個(gè)氨基酸。MaSTT3B的氨基酸序列與赤擬谷盜相似性最高，為93%，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的同一個(gè)分支上。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析MaSTT3B的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明：STT3B在蛹中的表達(dá)量高于成蟲(chóng)；在成蟲(chóng)足的表達(dá)量最高；在幼蟲(chóng)各組織中，體壁的相對(duì)表達(dá)量最高。

松墨天牛；STT3B；基因克?。籖T-qPCR

真核寡糖基轉(zhuǎn)移酶（OST）位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）腔內(nèi)，參與多肽N-糖基化的催化，是一種高度保守的蛋白質(zhì)［1］。一系列的研究發(fā)現(xiàn)酵母和脊椎動(dòng)物的OST包含了7或8個(gè)亞基（酵母：Ost1p、Ost2p、Ost3p/Ost6p、Ost4p、Ost5p、Stt3p、Wbp1p和Swp1p；脊椎動(dòng)物：ribophorin I、DAD1、N33/IAP、OST4、STT3A/STT3B、Ost48和ribophorin II）［2］。其中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的催化亞基STT3A和STT3B是一組輔助單元［3］，其酶動(dòng)力學(xué)特性和底物都不同，但在N-糖基化時(shí)有部分功能重疊［4］。STT3A緊鄰蛋白易位通道，保證NXT/S位點(diǎn)的共翻譯糖基化，STT3B則修正STT3A遺漏的受體位點(diǎn)［5］。

松墨天牛（Monochamus alternatus Hope），又名松褐天牛，屬于鞘翅目（Coleoptera），天?？疲–erambycidae），是重要檢疫性有害生物松材線蟲(chóng)（Bursaphelenchus xylophilus（Steiner&Buhrer））的主要傳播媒介［6-7］。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)酵母、植物、人類和哺乳動(dòng)物的OST及其各亞基的克隆、表達(dá)和功能結(jié)構(gòu)等研究較多，而昆蟲(chóng)STT3B的研究未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)松墨天牛STT3B基因進(jìn)行克隆及表達(dá)分析，為研究STT3B在昆蟲(chóng)中的功能奠定基礎(chǔ)理論，為糖基化修飾研究提供有力支持。

1 材料和方法

1.1 供試天牛

松墨天牛采集于廣州市從化區(qū)馬尾松次生林，使用人工飼料飼養(yǎng)［8］。分別收集交配期成蟲(chóng)的頭（去除觸角）、胸、足、翅、觸角、腹節(jié)等樣品；以及松墨天牛的3齡幼蟲(chóng)及其體壁、脂肪體、血淋巴、中腸、馬氏管等樣品；同時(shí)收集10 d蛹及羽化3 d的松墨天牛成蟲(chóng)。樣品置于液氮中迅速冷卻后，放于-80℃冰箱保存。

1.2 主要試劑

E.Z.N.A.TMTotal RNA KitⅡ總RNA提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品；IPTG、X-Gal等試劑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；PrimeScript RT reagent Kit W ith gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase試劑盒、pMD20-T Vector試劑盒、E.coli DH5αCompetent Cells、SYBR Premix Ex TaqTM實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒等試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品；通用型DNA純化回收試劑盒購(gòu)自天根生物有限公司。

1.3 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

采用RNA抽提試劑盒說(shuō)明書的方法來(lái)提取松墨天牛各樣本的總RNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，以及微量紫外分光光度儀（Nanodrop 2000）對(duì)RNA濃度進(jìn)行檢測(cè)后，確定RNA質(zhì)量和濃度符合試驗(yàn)要求，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。按PrimeScript RT reagent KitW ith gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA，稀釋10倍用作實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）的模板。

1.4 引物設(shè)計(jì)

從昆蟲(chóng)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的松墨天牛cDNA文庫(kù)［9］中篩選出一段糖基轉(zhuǎn)移酶亞基基因STT3B序列，以此序列為基礎(chǔ)，利用Primer prem ier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，Outer：5′-GAGTTGGTGGGATT ATGGG-3′和Inner：5′-AGGACATTAGGGAAAGCG-3′用于3′RACE；設(shè)計(jì)引物Forward（正向）：5′-CATA CGGAAGCGATGGAACT-3′和Reverse（反向）：5′-CC CATAATCCCACCAACTCA-3′，用于RT-qPCR。引物合成由上海生物工程有限公司完成。

1.5 松墨天牛STT3B的3′RACE擴(kuò)增及序列分析

1.5.1 3′RACE擴(kuò)增 以合成的cDNA為模板，加入10×Ex Taq聚合酶反應(yīng)緩沖液2.5μL（含Mg2+），正向和反向引物各0.5μL（10μmol/L），dNTP 2μL（2.5μmol/L），Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL（5 U/μL），加ddH2O至25μL，混勻離心（3 000 r/min 10 s）后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

將特異性引物Outer及試劑盒中提供的通用引物1進(jìn)行第1輪PCR，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃30 s，55℃30 s，58℃30 s，72℃1 m in，20個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 m in。特異性引物Inner及通用引物2進(jìn)行第2輪PCR。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 m in，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 m in。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5.2 基因克隆及序列測(cè)定 3′RACE產(chǎn)物通過(guò)回收純化后進(jìn)行pMD20-T克隆載體連接過(guò)夜，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)重組質(zhì)粒12 h，經(jīng)氨芐青霉素和藍(lán)白斑進(jìn)一步篩選，挑取白斑質(zhì)粒培養(yǎng)3 h后，提取白斑質(zhì)粒進(jìn)行DNA檢測(cè)。測(cè)序交給上海生物工程有限公司完成。

1.5.3 核苷酸序列及其編碼氨基酸序列分析 測(cè)定序列拼接完成后，先用Blast程序（http：//blast.stva.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行相似性比對(duì)分析，并用ORF Finder程序（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/projects/gorf/）搜索開(kāi)放閱讀框（ORF），獲得一條帶有完整ORF且與昆蟲(chóng)寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B同源的序列；用ProtParam tool（http：//web. expasy.org/protparam/）計(jì)算蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)與分子量，NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/）分析磷酸化位點(diǎn)，SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽，DictyOGlyc 1.1 Serve（http：// www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/）預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)，ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質(zhì)的疏水性，Coils（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.htm l）預(yù)測(cè)卷曲結(jié)構(gòu)。

1.5.4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 從NCBI（http：//www. Ncbi.nlm.Nih.gov/）GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索昆蟲(chóng)STT3B的氨基酸序列，用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性比對(duì)；用ClustalX和MEGA 4.0軟件構(gòu)建昆蟲(chóng)STT3B系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（NJ法）。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以微管蛋白（β-actin）基因?yàn)閮?nèi)參基因，無(wú)菌超純水為陰性對(duì)照，以松墨天牛STT3B在成蟲(chóng)的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)參量來(lái)測(cè)定其在各蟲(chóng)態(tài)和成蟲(chóng)各部位的表達(dá)量，以松墨天牛STT3B在幼蟲(chóng)的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)參量來(lái)測(cè)定其在幼蟲(chóng)各組織的表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為10.0μmol/L的上、下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，10.0μL SYBR Premix Ex-Taq，加入ddH2O至20μL；設(shè)置ddH2O為陰性對(duì)照，每個(gè)樣本3次重復(fù)。放入LightCycler480熒光定量PCR儀擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃復(fù)性20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；40℃冷卻30 s。反應(yīng)結(jié)束后采集目標(biāo)基因的Ct值和2個(gè)內(nèi)參基因的Ct平均值，利用2-ΔΔCT相對(duì)定量法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 松墨天牛STT3B基因序列分析

本試驗(yàn)克隆了松墨天牛糖基轉(zhuǎn)移酶基因cDNA，命名為MaSTT3B（GenBank登錄號(hào)：KT362368），全長(zhǎng)2 552 bp（圖1），其中包含開(kāi)放閱讀框（ORF）2 322 bp， 230 bp的3′端非編碼區(qū)，ORF編碼773個(gè)氨基酸殘基，推測(cè)的分子式為C4061H6171N1013O1091S25，分子量為87.442 3 kDa，等電點(diǎn)為8.91，穩(wěn)定系數(shù)為63.14，為穩(wěn)定蛋白。疏水性最大值為3.933，最小值為-3.001，是親水蛋白。MaSTT3B有8個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，26個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，10個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，無(wú)糖基化位點(diǎn)、螺旋卷曲和信號(hào)肽。

2.2 序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

將MaSTT3B氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的17種昆蟲(chóng)STT3B的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)（圖2），其中，STT3B與赤擬谷盜相似性最高，為93%，與內(nèi)華達(dá)古白蟻的相似性為84%，與其他昆蟲(chóng)的相似性都大于75%。大多數(shù)膜翅目昆蟲(chóng)的STT3B亞基由約800個(gè)氨基酸組成，而雙翅目、鞘翅目、半翅目昆蟲(chóng)則由約770個(gè)氨基酸組成。本研究克隆的松墨天牛STT3B的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)2 322 bp，能編碼773個(gè)氨基酸殘基，而其親緣關(guān)系最近的赤擬谷盜STT3B的編碼區(qū)能編碼了776個(gè)氨基酸。

圖1 MaSTT3B的核苷酸及其編碼氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and encoding am ino acid sequences of MaSTT3B

圖2 松墨天牛與其他16種昆蟲(chóng)STT3B編碼氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Am ino acid sequence alignm ent of STT3B from M.alternatus and other insects

圖3 基于昆蟲(chóng)寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic relationships of insects based on STT3B am ino acids

基于18種昆蟲(chóng)的寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示（圖3）：松墨天牛與赤擬谷盜（Tribolium castaneum）遺傳距離最近，在同一分支；與歐洲熊蜂（Bombus terrestris）等遺傳距離較遠(yuǎn)。

2.3 松墨天牛STT3B的表達(dá)分析

用熒光定量RCR法分析了STT3B在松墨天牛不同蟲(chóng)態(tài)、成蟲(chóng)各部位和幼蟲(chóng)各組織的表達(dá)模式。MaSTT3B在蛹的表達(dá)量最高，幼蟲(chóng)的表達(dá)量最低，蛹和幼蟲(chóng)的相對(duì)表達(dá)量分別是成蟲(chóng)的1.10，0.17倍，基因表達(dá)在三者之間差異顯著（P＜0.05）（圖4）。成蟲(chóng)各部位的表達(dá)模式為：足的表達(dá)量最高，為對(duì)照（對(duì)照值為1）的11.55倍，翅膀的表達(dá)量最低，為對(duì)照的0.12倍，頭、胸、腹、觸角分別為對(duì)照的2.60，2.79，2.13，0.53倍，成蟲(chóng)各部位MaSTT3B基因表達(dá)有顯著差異（P＜0.05）（圖5）。幼蟲(chóng)各組織的表達(dá)模式為：體壁的表達(dá)量最高，為對(duì)照的30.27倍，中腸的表達(dá)量最低，為對(duì)照的0.10倍，脂肪體、血淋巴、馬氏管分別為對(duì)照的3.58，1.14，0.30倍，幼蟲(chóng)各組織MaSTT3B基因表達(dá)有顯著差異（P＜0.05）（圖6）。圖4-6中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

圖4 STT3B在松墨天牛不同蟲(chóng)態(tài)的表達(dá)Fig.4 The expression of STT3B in various instars of M.alternatus

圖5 STT3B在松墨天牛成蟲(chóng)不同部位的表達(dá)Fig.5 The exp ression of STT3B in different parts of M.alternatus adu lt

圖6 STT3B在松墨天牛幼蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)Fig.6 The exp ression of STT3B in various tissues of M.alternatus larvae

3 討論

STT3是一個(gè)高度保守的亞基，它含有一個(gè)Ncyt-Clum拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和11個(gè)跨膜螺旋［11］，3′端有WWDYG與DK 2個(gè)保守的基序［12］，可分為STT3A和STT3B 2個(gè)亞基。本試驗(yàn)采用RACE技術(shù)獲得了松墨天牛一段完整序列，通過(guò)Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)比對(duì)的序列都為STT3B，其中以已測(cè)定基因組的赤擬谷盜最為相似，相似性達(dá)到93%，與其他昆蟲(chóng)氨基酸序列的相似性在75%以上，因此可確定該序列為STT3B，命名為MaSTT3B。大多數(shù)膜翅目昆蟲(chóng)的STT3B亞基由約800個(gè)氨基酸組成，而雙翅目、鞘翅目、半翅目昆蟲(chóng)則由約770個(gè)氨基酸組成。本試驗(yàn)克隆的松墨天牛STT3B的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)2 322 bp，能編碼773個(gè)氨基酸殘基，而其親緣關(guān)系最近的赤擬谷盜STT3B的編碼區(qū)能編碼了776個(gè)氨基酸。

N-糖基化有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的作用，更有少數(shù)蛋白需要N-糖基化才可表達(dá)其正常功能，比如內(nèi)肽酶［13］、GD3合酶（α-2，8-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶）［14］、GM2合酶（β-1，4-N乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶）［15］和高親和性免疫球蛋白E受體等［16］。寡糖基轉(zhuǎn)移酶（OST）作為參與蛋白質(zhì)糖基化過(guò)程的多種酶之一，含有7或8個(gè)亞基，但僅有催化亞基STT3A和STT3B有催化功能，能催化核心寡糖由多萜醇二磷酸核心寡糖轉(zhuǎn)移至新合成肽鏈的NXS/T序列中的天冬酰胺殘基上形成N-糖苷鍵。NXS/T序列是蛋白質(zhì)N-糖基化的標(biāo)志，分別為天冬氨酸-X-絲氨酸/蘇氨酸（Asn-X-Ser/Thr），X可以是除了脯氨酸（Pro）外的任何氨基酸。Malaby等［17］發(fā)現(xiàn)在糖基化過(guò)程中，如果NXS位點(diǎn)含有大量的疏水性和帶負(fù)電荷的殘基，STT3A和STT3B就無(wú)法作用這些位點(diǎn)。

鑒于糖基化的重要性，OST亞基STT3B一直是研究的熱點(diǎn)。但目前，STT3B的研究集中在結(jié)構(gòu)和功能上，多以酵母、小鼠等為試材，并未有涉及昆蟲(chóng)領(lǐng)域。在糖基化過(guò)程中，糖鏈不僅需要糖基轉(zhuǎn)移酶的作用，還要具有位點(diǎn)特異的性質(zhì)，也即是要有糖基化位點(diǎn)［18-19］。那么STT3B本身是否含有糖基化位點(diǎn)呢？經(jīng)分析，MaSTT3B無(wú)糖基化位點(diǎn)、信號(hào)肽。比較本試驗(yàn)中的其他16種昆蟲(chóng)的STT3B，除了麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）在438位的絲氨酸含有一個(gè)糖基化位點(diǎn)外，其他都無(wú)糖基化位點(diǎn)和信號(hào)肽，可見(jiàn)STT3B在結(jié)構(gòu)上比較保守，一般不含糖基化位點(diǎn)和信號(hào)肽，這可能跟其功能相適應(yīng)。

STT3B能修飾STT3A在糖基化過(guò)程中的遺漏位點(diǎn)，特別是蛋白序列C末端。Shrimal等［20］表明糖基化氨基酸序列的C端和內(nèi)部的糖基化位點(diǎn)（NXT/NXS）功能相同，一般由STT3B修飾，而不是STT3A。同時(shí)，STT3B參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的降解途徑，但其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步分析。

本試驗(yàn)克隆了MaSTT3B基因，分析了該基因編碼氨基酸序列特征，并采用RT-PCR技術(shù)對(duì)其在松墨天牛各發(fā)育時(shí)期和各組織的表達(dá)差異性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)MaSTT3B在蛹、足、體壁等的表達(dá)量較高。蛹是幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)變?yōu)槌上x(chóng)的過(guò)渡狀態(tài)，體內(nèi)組織發(fā)生各種生理活動(dòng)，新陳代謝比幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)更快。足是運(yùn)動(dòng)器官，肌肉發(fā)達(dá)，含有大量蛋白質(zhì)。體壁起著保護(hù)作用，含較多的幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)。因此，筆者猜測(cè)是由于在這三者中蛋白質(zhì)合成代謝較為活躍，需要更多的STT3B參與N-糖基化。當(dāng)然，STT3B在松墨天牛中的具體功能還需要更進(jìn)一步地深入研究。

［1］ Dumax-vorzet A，Roboti P，High S.OST4 is a subunit of the mammalian oligosaccharyltransferase required for efficient N-glycosylation［J］.Journal of Cell Science，2013，126（12）：2595-2606.

［2］ Kelleher D J，Gilmore R.An evolving view of the eukaryotic oligosaccharyltransferase［J］.Glycobiology，2006，16（4）：47R-62R.

［3］ Kelleher D J，Karaoglu D，Mandon E C，et al.Oligosaccharyltransferase isoforms that contain different catalytic STT3 subunits have distinct enzymatic properties［J］.Molecular Cell，2003，12（1）：101-111.

［4］ Ruiz-canada C，Kelleher D J，Gilmore R.Cotranslational and posttranslational N-glycosylation of polypeptides by distinct mammalian OST isoforms［J］.Cell，2009，136（2）：272-283.

［5］ Shrimal S，Trueman S F，Gilmore R.Extreme C-terminal sites are posttranslocationally glycosylated by the STT3B isoform of the OST［J］.The Journal of Cell Biology，2013，201（1）：81-95.

［6］ Zhao G B，F(xiàn)utai，Sutherland J R，et al.Pine wilt disease［M］.Tokyo：Springer，2008.

［7］ Maehara N，Aikawa T，Kanzaki N.Relationship between pine wilt disease development in asymptomatic carrier trees of Bursaphelenchus xylophilus（Nematoda：Apelenchoididae）and their use by Monochamusalternatus（Coleoptera：Cerambycidae）［J］.Applied Entomology And Zoology，2015，50（1）：33-39.

［8］ 徐金華，黃秀鳳，徐華潮，等.松墨天牛室內(nèi)人工飼養(yǎng)及其生物學(xué)特性觀察［J］.浙江林業(yè)科技，2009，29（4）：86-88.

［9］ 韋春梅，羅淋淋，吳華俊，等.松墨天牛幼蟲(chóng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及EST分析［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2014，33（1）：113-120.

［10］ Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using Real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod［J］.Methods，2001，25（4）：402-408.

［11］ Whitley P，Nilsson IM，Von heijne G.A nascent secretory protein May traverse the ribosome/endoplasmic reticulum translocase complex as an extended chain［J］.The Journal of Biological Chem istry，1996，271（11）：6241-6244.

［12］ Nilsson I，Kelleher D J，Miao Yiwei，et al.Photocrosslinking of nascent chains to the STT3 subunit of the oligosaccharyltransferase complex［J］.The Journal of Cell Biology，2003，161（4）：715-725.

［13］ Kadowaki T，Tsukuba T，Bertenshaw G P，et al.N-Linked oligosaccharides on themeprin ametalloprotease are important for secretion and enzymatic activity，but not for apical targeting［J］.The Journal of Biological Chemistry，2000，275（33）：25577-25584.

［14］ Martina J A，Daniotti J L，Maccioni H J.Influence of N-glycosylation and N-glycan trimming on the activity and intracellular traffic of GD3 synthase［J］.The Journal of Biological Chemistry，1998，273（6）：3725-3731.

［15］ Haraguchi M，Yamashiro S，F(xiàn)urukawa K，et al.The effects of the site-directed removal of N-glycosylation sites from beta-1，4-N-acetylgalactosaminyltransferase on its function［J］.The Biochem ical Journal，1995，312（Pt 1）：273-280.

［16］ Letourneur O，Sechi S，W illette-brown J，et al.Glycosylation of human truncated Fc epsilon RI alpha chain is necessary for efficient folding in the endop lasmic reticulum［J］.The Journal of Biological Chemistry，1995，270（14）：8249-8256.

［17］ Malaby H L，Kobertz W R.The middle X residue influences cotranslational N-glycosylation consensus site skipping［J］.Biochemistry，2014，53（30）：4884-4893.

［18］ 周 蕾，顧建新.N-糖基化位點(diǎn)鑒定方法和非經(jīng)典N-糖基化序列［J］.生命科學(xué)，2011（06）：605-611.

［19］ Mari o K，Bones J，Kattla J J，et al.A systematic approach to protein glycosylation analysis：a path through the maze［J］.Nature chemical biological，2010，6（10）：713-723.

［20］ Shrimal SG，Losfeld M E.Mutations in STT3A and STT3B cause two congenital disorders of glycosylation［J］.Human Molecular Genetics，2013，22（22）：4638-4645.

Cloning and Expression Analysis of STT3B of O ligosaccharyltransferase from Monochamus alternatus

CAIZiling，WU Huajun，LIN Tong
（College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

In order to analyze the structure characteristics of MaSTT3B and its expression in the different development stages，different parts of adults and different tissues in larvae，we cloned the STT3B gene of Monochamus alternatus named MaSTT3B（GenBank accession number：KT362368）using the technology including reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）and rapid amplification（RACE）.The total sequence length of MaSTT3B is 2 552 bp，including 2 322 bp open reading frame encoding 773 am ino acids.The am ino acid sequence of MaSTT3B has 93%similarity to Tribolium castaneum，and both of them are in the same branch of phylogenetic tree based on insect STT3B.The result of RT-qPCR indicated that MaSTT3B was expressed higher in pupae than in adults，in adult′s legs than in other parts of adults，and highest in body wall of among larvae tissues.The relative expression levels of MaSTT3B was detected by RT-qPCR indicated that MaSTT3B was expressed higher in pupae than in adults，in adult′s legs than in other parts of adults，and highest in body wall of among larvae tissues.

Monochamus alternatus；STT3B；Gene cloning；RT-qPCR

Q966；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-7091（2016）03-0080-08

10.7668/hbnxb.2016.03.012

2016-03-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470653）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1414050001666）

蔡紫玲（1992-），女，廣東茂名人，在讀碩士，主要從事昆蟲(chóng)分子生物學(xué)研究。

林 同（1969-），男，黑龍江通河人，副教授，博士，主要從事昆蟲(chóng)分子生物學(xué)研究。