牦牛和普通牛DRB1 Intron 1-exon 2序列變異分析

田知利，陳 杰，胡 江，羅玉柱，劉 秀，李少斌，郭淑珍，牟永娟

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，甘肅蘭州 730070；2.甘南州畜牧科學研究所，甘肅合作 747000）

牦牛和普通牛DRB1Intron 1-exon 2序列變異分析

田知利1，陳 杰1，胡 江1，羅玉柱1，劉 秀1，李少斌1，郭淑珍2，牟永娟2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，甘肅蘭州 730070；2.甘南州畜牧科學研究所，甘肅合作 747000）

為揭示牦?？鼓嫘约翱共∮N積累更多的分子遺傳學資料，通過檢測DRB1基因在牦牛和普通牛群體中的變異，分析該基因檢測區(qū)域遺傳參數(shù)。以甘南牦牛、青海牦牛、天祝白牦牛、大通牦牛和普通牛為研究對象。應用PCR-SSCP方法檢測BoLA-DRB1基因第1內(nèi)含子及第2外顯子部分序列多態(tài)性。DRB1基因第1內(nèi)含子區(qū)檢測到4處SNPs及1處插入/缺失突變，第2外顯子區(qū)檢測到17處SNPs，兩區(qū)域均表現(xiàn)為高度多態(tài)；單倍型連鎖分析發(fā)現(xiàn)21種intron 1-exon 2單倍型組型且存在單倍型連鎖不平衡現(xiàn)象，A-A1、A-B1、B-A1和B-B1單倍型在牦牛和普通牛中頻率較高；聚類分析表明，牦牛DRB1基因第2外顯子區(qū)堿基序列與普通牛及山羊的同源性最高，系統(tǒng)進化情況與它們親緣關系遠近一致。牦牛和普通牛BoLA-DRB1基因第1內(nèi)含子及第2外顯子多態(tài)性豐富，可作為牦牛和普通牛BoLADRB1的遺傳標記。

牦牛；普通牛；DRB1基因；Intron 1；Exon 2；多態(tài)性

主要組織相容性復合體（Major histocompatibility comp lex，MHC），是由緊密連鎖的高度多態(tài)基因座組成的染色體上的一個遺傳區(qū)域，其編碼產(chǎn)物MHC抗原為一類細胞表面轉膜蛋白，在抗原識別與呈遞、免疫應答與調(diào)控等方面起著非常重要的作用，動物對許多疾病的抗病性均與MHC有關［1］。Amorena等［2］1978年首次報道牛MHC并命名為牛白細胞抗原系統(tǒng)（Bovine lymphocyte antigen，BoLA）。BoLA位于牛第23號染色體上，分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類基因，其中Ⅱ類基因a區(qū)包括有表達功能的DR和DQ基因家族，b區(qū)包括一些未知功能的DYA、DIB和DOB基因。牛BoLA與乳腺炎［3］、體細胞數(shù)［4］、持久性淋巴增多癥［5］、嗜皮菌?。?］及口蹄疫［7］等疫病相關。分析BoLA基因對某些疫病的影響是確定?？共⌒苑肿訕擞浀闹匾椒ㄖ弧?/p>

許多物種DRB1基因具有豐富的多態(tài)性。賴淑蘋等［8］在中國西北地區(qū)漢族、回族、維吾爾族、藏族人HLA-DRB1基因分別檢測到29，32，27，31種等位基因，Konnai等［9］在薩?？恕⑶芯S厄特、考力代綿羊DRB1基因第2外顯子區(qū)共發(fā)現(xiàn)35個等位基因，Gruszczyńska等［10］也發(fā)現(xiàn)Heath綿羊和Low land綿羊DRB1基因第2外顯子有明顯的多態(tài)性。DRB1基因在動物抗病育種、親緣鑒定、個體識別等領域具有廣泛應用，溫青娜等［11］研究表明新疆哈薩克羊DRB1基因突變與細粒棘球蚴病具有較強的相關性，李莉等［12］將HLA-DRB1基因分型芯片應用于法醫(yī)物證方面的研究。牛DRB1基因屬BoLA家族Ⅱ類基因，全長8 752 bp，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成。牛DRB1基因為假基因［13］，而對其研究報道較少。

牦牛是青藏高原及周邊高寒牧區(qū)特有牛種，也是當?shù)剞r(nóng)牧民的重要生產(chǎn)、生活資料。牦牛選育程度較低，生產(chǎn)性能不高，但其抗逆性強，對青藏高原高寒、少氧的環(huán)境有良好適應性。近年來，對牦牛分子遺傳方面的報道較多，但對其MHC遺傳及作用機理方向研究較少，DRB1基因研究未見報道。本試驗采用PCR-SSCP方法，檢測和分析不同牦牛類群BoLA-DRB1基因第1內(nèi)含子及第2外顯子區(qū)域部分序列的堿基突變，分析各群體該基因檢測區(qū)域分子遺傳特征及多態(tài)性，旨在為揭示牦?？鼓嫘约翱共∮N積累更多的分子遺傳學數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及血樣采集

試驗動物為甘南牦牛、青海牦牛、天祝白牦牛、大通牦牛和普通牛（秦川牛及其雜種牛），其中甘南牦牛421頭，天祝白牦牛174頭，青海牦牛95頭，大通牦牛36頭，普通牛82頭。頸靜脈采血，酸性檸檬酸葡萄糖溶液抗凝，-20℃凍存，部分血樣用FTA卡保存。

1.2 基因組DNA提取

凍存血樣采用常規(guī)苯酚-氯仿抽提法提取基因組DNA。FTA卡保存血樣參考Zhou等［14］兩步法提取基因組DNA。

1.3 引物設計和PCR擴增

參考普通牛DRB1基因序列（GenBank No：LOC_ 101903005），用Primer3軟件設計特異性引物P1和P2（表1），分別擴增牦牛及普通牛DRB1基因第1內(nèi)含子及第2外顯子部分區(qū)域，引物由北京六合華大生物科技有限公司合成。

表1 引物信息Tab.1 Prim er in form ation

PCR反應總體積20μL，各成分用量（終濃度）：基因組DNA（50 ng/μL）0.8μL（或FTA卡1.2 mm血樣圓片1個），Taq預混酶11μL，上下游引物（0.25μmol/L）各0.4μL，ddH2O為7.4μL（若用FTA卡血樣時，ddH2O為8.2μL）。

PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，63℃退火30 s（P1和P2引物退火溫度相同），72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于4℃保存。

1.4 PCR-SSCP檢測

PCR管內(nèi)加入PCR產(chǎn)物3μL，變性上樣緩沖液（98%去離子甲酰胺、0.025%二甲苯氰、0.025%溴酚藍、10 mmol/L EDTA）8μL，98℃變性10 min，迅速冰浴5 m in，上樣于非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr∶Bis=39∶1），0.5×TBE緩沖液電泳。電泳完成后用銀染法［15］染色并判定基因型。P1和P2引物最佳SSCP電泳條件見表2。

表2 SSCP電泳條件Tab.2 SSCP electrophoresis conditions

1.5 等位基因序列測定

檢測到的等位基因存在于純合型個體，應用其PCR擴增產(chǎn)物直接測序以確定相應等位基因序列；如檢測到的等位基因僅存在于雜合個體，參考Hu等［16］方法切膠測序。序列測定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

等位基因核苷酸序列比對應用DNAMAN軟件完成，基因型頻率、等位基因頻率、純合度（Ho）、有效等位基因數(shù)（Ne）和雜合度（He）用Popgene32軟件計算，利用PIC軟件計算多態(tài)信息含量。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

P1和P2引物分別擴增甘南牦牛、青海牦牛、天祝白牦牛、大通牦牛和普通牛DRB1基因第1內(nèi)含子及第2外顯子部分序列，擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠檢測結果見圖1。2對引物均獲得較好的擴增效果，產(chǎn)物片段大小均在預期的范圍內(nèi)，沒有出現(xiàn)非特異擴增條帶，可以進行SSCP檢測。

圖1 DRB1基因P1（A）和P2（A1）引物PCR產(chǎn)物瓊脂糖檢測Fig.1 Agarose gel check of the PCR am p licons of DRB1 gene w ith P1（A）and P2（A1）p rim ers

2.2 DRB1基因第1內(nèi)含子及第2外顯子SSCP檢測結果

各類群牦牛及普通牛DRB1基因P1及P2引物PCR產(chǎn)物PCR-SSCP檢測結果分別見圖2，3。P1引物擴增區(qū)域檢測到A、B、C和D這4種等位基因，對應AA、AB、BB、AC、BC、CC和DD 7種SSCP帶型（基因型）。P2引物擴增區(qū)域檢測到A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1、H1和I19種等位基因，對應11種SSCP帶型（基因型），其中等位基因E1和I1只存在于雜合子中。

圖2 DRB1基因P1引物擴增產(chǎn)物PCR-SSCP檢測Fig.2 SSCP analysis for PCR am p licons of P1 p rim ers

圖3 DRB1基因P2引物擴增產(chǎn)物PCR-SSCP檢測Fig.3 SSCP analysis for PCR am p licons of P2 prim ers

2.3 DRB1基因等位基因序列比對分析

各類群牦牛及普通牛DRB1基因P1及P2擴增區(qū)域等位基因序列比對分析結果分別見表3，4。同普通牛DRB1基因序列（GenBank No：LOC_101903005）比對，P1引物擴增區(qū)域檢測到4處SNPs及1處插入/缺失突變；P2引物擴增區(qū)域共檢測到17處SNPs，包括9處顛換、6處轉換和2處顛換和轉換共存位點。

表3 牦牛及普通牛DRB1基因P1引物擴增區(qū)域等位基因序列分析Tab.3 Variations of P1 am p lification in yak and cattle DRB1 gene

表4 牦牛及普通牛DRB1基因P2引物擴增區(qū)域等位基因序列分析Tab.4 Variations of P2 am p lification in yak and cattle DRB1 gene

2.4 DRB1基因遺傳多態(tài)性分析

2.4.1 基因型頻率和基因頻率 牦牛及普通牛DRB1基因第1內(nèi)含子和第2外顯子基因型頻率和等位基因頻率分別見表5-7。

在牦牛及普通牛群體中，P1引物在第1內(nèi)含子區(qū)檢測到等位基因B頻率0.361～0.481為優(yōu)勢等位基因；甘南牦牛、青海牦牛、天祝白牦牛和普通?；蛐虰B頻率0.236～0.391為優(yōu)勢基因型，而大通牦?；蛐虯B頻率0.472為優(yōu)勢基因型；與其他牦牛群體相比，大通牦牛未檢測到BC基因型個體。

表5 牦牛及普通牛DRB1基因第1內(nèi)含子基因型頻率和等位基因頻率Tab.5 Genotype and allele frequency in intron 1 of DRB1 in yak and cattle

表6 牦牛及普通牛DRB1基因第2外顯子基因型頻率Tab.6 Genotype frequency in exon 2 of DRB1 gene in yak and cattle

P2引物在DRB1基因第2外顯子區(qū)檢測到等位基因在牦牛及普通牛群體間分布不均衡，甘南牦牛、青海牦牛、天祝白牦牛和普通牛檢測到9種等位基因A1～I1，而大通牦牛沒有檢測到等位基因C1；大通牦牛未檢測到C1C1、G1G1和H1H1基因型個體，甘南牦牛和青海牦牛未檢測到G1G1基因型個體。青海牦牛、天祝白牦牛等位基因A1頻率0.188和0.279分別為優(yōu)勢等位基因，而甘南牦牛、大通牦牛及普通牛等位基因B1頻率0.251～0.285為優(yōu)勢等位基因；除天祝白牦牛A1A1頻率0.184和青海牦牛F1G1頻率0.189為優(yōu)勢基因型外，其他各類群牦牛和普通牛A1B1頻率0.175～0.266為優(yōu)勢基因型。

表7 牦牛及普通牛DRB1基因第2外顯子等位基因頻率Tab.7 A llele frequency in exon 2 of DRB1 gene in yak and cattle

2.4.2 DRB1基因純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量 DRB1基因P1和P2引物擴增區(qū)域純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量分別見表8-9。通常用遺傳雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）來評價群體的遺傳變異，遺傳參數(shù)不同，相應的群體遺傳特征也會有差別。P1引物擴增區(qū)域各類群牦牛及普通牛遺傳雜合度為0.218～0.583，PIC值0.575～0.651為高度多態(tài)，甘南牦牛和青海牦?？ǚ街稻_到顯著水平，偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.01）。P2引物擴增區(qū)域各類群牦牛和普通牛群體遺傳雜合度0.357～0.639，PIC值0.790～0.860為高度多態(tài)，甘南牦牛、青海牦牛、天祝白牦牛和普通?？ǚ街稻_到顯著水平，偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.01）。大通牦牛DRB1基因兩擴增區(qū)域卡方值均未達到顯著水平，即處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

表8 牦牛及普通牛DRB1基因第1內(nèi)含子多態(tài)信息量、純合度、雜合度和有效等位基因數(shù)Tab.8 PIC，Ho，He and Ne in intron 1 of DRB1 gene in yak and cattle

表9 牦牛及普通牛DRB1基因第2外顯子多態(tài)信息量、純合度、雜合度和有效等位基因數(shù)Tab.9 PIC，Ho，He and Ne in exon 2 of DRB1 gene in yak and cattle

表10 牦牛與其他6個物種DRB1基因第2外顯子核苷酸序列同源性比較Tab.10 Hom ology com paring of nucleotide acid sequence of DRB1 exon 2 between yak and other 6 species %

2.5 不同物種DRB1基因第2外顯子核苷酸序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

牦牛、普通牛、山羊等7個物種DRB1基因第2外顯子核苷酸序列同源性分析見表10。牦牛與普通牛、山羊的同源性分別為97.49%，96.06%，與人、野豬、馬和兔子同源性依次為87.46%，83.87%，80.65%，77.78%。7個物種DRB1基因第2外顯子核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹見圖4，牦牛與普通牛和山羊親緣關系最近，與人、野豬、馬和家兔親緣關系依次漸遠。不同物種DRB1基因核苷酸序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹與動物分類學一致。

圖4 七個物種DRB1基因第2外顯子核苷酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phy logenetic trees of nucleotide sequences from exon 2 of DRB1 gene am ong 7 species

表11 牦牛及普通牛DRB1基因intron 1-exon 2單倍型及頻率Tab.11 Hap lotype frequency of DRB1 intron 1-exon 2 in yak and cattle

2.6 牦牛及普通牛DRB1基因第1內(nèi)含子與第2外顯子單倍型連鎖分析

牦牛及普通牛DRB1基因第1內(nèi)含子與第2外顯子單倍型連鎖分析見表11。單倍型連鎖分析發(fā)現(xiàn)21種單倍型組型，少于理論上該組型（P=4× 9=36），說明DRB1基因第1內(nèi)含子與第2外顯子存在連鎖不平衡現(xiàn)象。各組單倍型中，B-B1頻率最高為0.127，其次為單倍型A-A1、A-B1和B-A1分別為0.112，0.101，0.098，頻率最低的單倍型D-G1為0.007。4種主要單倍型頻率在各類群牦牛和普通牛有所不同（表12）。

表12 牦牛及普通牛DRB1基因4種主要單倍型頻率Tab.12 Four m ain hap lotypes frequency of DRB1 gene in yak and cattle

3 討論與結論

牦牛及普通牛DRB1基因多態(tài)性豐富。本試驗在各類群牦牛和普通牛群體中，DRB1基因第1內(nèi)含子區(qū)發(fā)現(xiàn)4個SNPs及1處插入/缺失突變，第2外顯子區(qū)檢測到17個SNPs位點，第1內(nèi)含子及第2外顯子區(qū)均為高度多態(tài)。李少斌［17］報道藏綿羊DRB1基因第2外顯子發(fā)現(xiàn)31個等位基因，70個核苷酸多態(tài)位點。溫青娜等［11］報道新疆哈薩克綿羊DRB1基因第2外顯子發(fā)現(xiàn)15個等位基因和37種基因型。王佳泰等［18］報道河西絨山羊DRB1基因第2外顯子發(fā)現(xiàn)26個等位基因，存在71個核苷酸變異位點。以上試驗均與本試驗對牦牛該基因的檢測結果類似。

DRB1基因第2外顯子多態(tài)性在不同物種間差別較大。楊清芳等［19］檢測了人、野豬、狗、駝鹿、綿羊5個物種DRB1基因第2外顯子突變，發(fā)現(xiàn)不同物種的多態(tài)位點也不相同，其中野豬DRB1基因核苷酸變異最大，人類次之。陳月娥等［20］發(fā)現(xiàn)綿羊和人類的DRB1基因第2外顯子均存在豐富的多態(tài)性且有14個SNPs位點相同，但人類的多態(tài)性比綿羊豐富。賈斌等［21］對多浪羊和中國美利奴羊DRB1基因多態(tài)性進行研究，發(fā)現(xiàn)兩者多態(tài)性并不完全一致。

牛DRB1基因為假基因。假基因常位于基因家族中，序列上與活性基因相似，但不能轉錄或翻譯生成成熟mRNA或蛋白質(zhì)，或產(chǎn)生過早終止的無活性肽鏈，或由于錯誤的閱讀框架形成無活性的蛋白質(zhì)。目前研究發(fā)現(xiàn)假基因存在于多種生物基因組中，但基因數(shù)目在不同物種間存在明顯差異，哺乳動物基因組中分布較多，特別是人類基因組中存在的假基因有上萬條［22-23］。假基因不但具有調(diào)控同源功能基因的表達、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯和干預基因沉默機制等功能，而且假基因仍保持著真核生物的基因組流動性，對確定物種親緣關系和進化距離有重要作用。另外，假基因大部分不能轉錄，導致其不能像正常基因一樣經(jīng)歷進化選擇，從而逃避了選擇壓力，往往容易積累突變。牛DRB1基因作為不表達的假基因，具有豐富多態(tài)性，為進一步研究其在基因表達調(diào)控、基因組進化、親緣關系等方面的作用奠定理論基礎。

DRB1基因第1內(nèi)含子和第2外顯子間存在單倍型連鎖不平衡現(xiàn)象。單倍型連鎖分析發(fā)現(xiàn)21種intron 1-exon 2單倍型組型，其數(shù)量少于理論值，且單倍型頻率分布不平衡。Hick ford等［24］報道了綿羊MHC classⅡ區(qū)DQA1與DQA2基因存在單倍型連鎖現(xiàn)象。成述儒［25］對藏綿羊DQA1、DQA2和DRB3基因多態(tài)性進行研究，發(fā)現(xiàn)這3種基因兩兩之間及三者之間的單倍型數(shù)均低于理論值，而且單倍型頻率分布極不均勻，表明DQA1、DQA2和DRB3基因間存在單倍型連鎖不平衡現(xiàn)象。張洪波等［26］對西北地區(qū)漢族群體HLA-A、-B、-DRB1基因座進行單倍型研究，發(fā)現(xiàn)三者之間組成的單倍型數(shù)低于理論值，且分布不均勻。上述試驗均與本試驗結果類似。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，牦牛與普通牛、山羊在DRB1基因第2外顯子區(qū)域同源性為97.49%和96.06%，與人、野豬、馬和家兔親緣關系依次漸遠，符合郭松長等［27］將牦牛歸為牛屬中的一個亞屬或一個種的結論。

牦牛及普通牛BoLA-DRB1基因多態(tài)性豐富，第1內(nèi)含子區(qū)檢測到4處SNPs及1處插入/缺失突變，第2外顯子區(qū)檢測到17處SNPs，兩區(qū)域存在21種單倍型組型且表現(xiàn)為單倍型連鎖不平衡。但因牛BoLA-DRB1基因為假基因，對其遺傳特征研究較少，且缺乏牦牛疫病及抗逆性表型數(shù)據(jù)，因此該基因突變對牦?？鼓嫘约捌渌誀畹挠绊懭孕柽M一步研究。

［1］ 孫東曉，張 沅.反芻家畜主組織相容性復合體的研究進展［J］.中國畜牧雜志，2002，38（5）：46-47.

［2］ Amorena B，Stone W H.Serologically defined（SD）locus in cattle［J］.Science，1978，201（4351）：159-160.

［3］ Park Y H，Joo Y S，Park J Y，et al.Characterization of lymphocyte subpopulations and major histocompatibility complex haplotypes of mastitis-resistant and susceptible cows［J］.Journal of Veterinary Science，2004，5（1）：29-39.

［4］ Wu X X，Yang Z P，Wang X L，et al.Restriction fragment length polymorphism in the exon 2 of the BoLA-DRB3 gene in Chinese Holstein of the South China［J］.Journal of Biomedical Science and Engineering，2010，03（02）：221-225.

［5］ Aida Y，Takeshima SN，Matsumoto Y，et al.Bovine MHC class IIDr molecule plays a key role in Bovine leukemia virus（BLV）-induced lymphoma［J］.Retrovirology，2011，8（1）：1-1.

［6］ Maillard JC，Berthier D，Chantal I，et al.Selection assisted by a BoLA-DR/DQ haplotype against susceptibility to bovine dermatophilosis［J］.Genetics，Selection，Evolution，2003，35（l 1）：193-200.

［7］ Pandya M，Rasmussen M，Hansen A，et al.A modern approach for epitope prediction：identification of foot-andmouth disease virus peptides binding bovine leukocyte antigen（BoLA）class I molecules［J］.Immunogenetics，2015，67（11/12）：691-703.

［8］ 賴淑蘋，任惠民，胡海濤，等.中國西北地區(qū)漢、回、維、藏民族HLA-DRB基因多態(tài)性的研究［J］.遺傳學報，1999，26（5）：447-457.

［9］ Konnai S，Nagaoka Y，Takeshima S，et al.Sequences and diversity of 17 new Ovar-DRB1 alleles from three breeds of sheep［J］.European Journal of Immunogenetics，2003，30（4）：275-282.

［10］ Gruszczyńska J，Brokowska K，Charon K M，et al.Restriction fragment length polymorphism of exon 2 Ovar-DRB1 gene in Polish heath sheep and Polish lowland sheep［J］.Journal of Applied Genetics，2005，46（3）：311-314.

［11］ 溫青娜，賈 斌，申 紅，等.哈薩克綿羊MHC-DRB1基因SSCP多態(tài)性與細粒棘球蚴病遺傳抗性關聯(lián)分析［J］.中國人獸共患病學報，2010，26（9）：805-809.

［12］ 李 莉，李成濤，柳 燕，等.HLA-DRB1基因分型芯片的法醫(yī)物證學應用價值研究［J］.法醫(yī)學雜志，2004，20（2）：81-84，87.

［13］ 亢孝珍，額爾敦木圖，姜建強，等.主要組織相容性復合體（MHC）基因研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（5）：28-33.

［14］ Zhou H，Hickford JG，F(xiàn)ang Q.A two-step procedure for extracting genomic DNA from dried blood spots on filter paper for polymerase chain reaction amplification［J］. Analytical Biochemistry，2006，354（1）：159-161.

［15］ Byun SO，F(xiàn)ang Q，Zhou H，et al.An effectivemethod for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels［J］.Analytical Biochemistry，2009，385（1）：174-175.

［16］ Hu J，Zhou H T，Smyth A，et al.Polymorphism of the bovine ADRB3 gene［J］.Molecular Biology Reports，2010，37（7）：3389-3392.

［17］ 李少斌.放牧型羔羊肉生產(chǎn)優(yōu)化雜交組合篩選和藏綿羊DRB1基因第2外顯子多態(tài)性分析［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2010：45-47.

［18］ 王佳泰，王繼卿，胡 江，等.河西絨山羊GOLA-DRB1基因第2外顯子變異特征分析［J］.生物技術通報，2011（12）：132-138.

［19］ 楊清芳，李祥龍，周榮艷，等.不同物種MHC-DRB1基因外顯子2生物信息學分析［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010（13）：11-13.

［20］ 陳月娥，李建華，茍亞峰，等.綿羊和人主要組織相容性復合體DRB1基因外顯子2多態(tài)性及生物信息學分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（4）：66-70.

［21］ 賈 斌，申 紅，余智勇，等.多浪羊和中國美利奴羊MHC-DRB1基因多態(tài)性與包蟲病的遺傳易感性［J］.中國人獸共患病學報，2007，23（10）：1004-1008，1012.

［22］ Harrison PM，Hegyi H，Balasubramanian S，et al.Molecular fossils in the human genome：identification and analysis of the pseudogenes in chromosomes 21 and 22［J］. Genome Research，2002，12（2）：272-280.

［23］ Zhang Z，Harrison PM，Liu Y，et al.M illions of years of evolution preserved：a comprehensive catalog of the processed pseudogenes in the human genome［J］.Genome Research，2003，13（12）：2541-2558.

［24］ Hickford J，Zhou H，F(xiàn)ang Q.Haplotype analysis of the DQA genes in sheep：Evidence supporting recombination between the loci［J］.Journal of Animal Science，2007，85（3）：577-582.

［25］ 成述儒.藏綿羊DQA1、DQA2和DRB3基因多態(tài)性與單倍型連鎖分析［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2010.

［26］ 張洪波，賴江華，李生斌.西北地區(qū)漢族人群HLA-A、-B、-DRB1基因座單倍型分析［J］.中華醫(yī)學遺傳學雜志，2005，22（4）：464-466.

［27］ 郭松長，劉建全，祁得林，等.牦牛的分類學地位及起源研究：mtDNA D-loop序列的分析［J］.獸類學報，2006，26（4）：325-330.

Sequence Variation at BoLA-DRB1Intron 1-exon 2 in Yak and Cattle

TIAN Zhili1，CHEN Jie1，HU Jiang1，LUO Yuzhu1，LIU Xiu1，LIShaobin1，GUO Shuzhen2，MU Yongjuan2
（1.Faculty of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology，Lanzhou 730070，China；2.Institute of Animal Husbandry Science of Gannan Prefecture，Hezuo 747000，China）

To accumulate more molecular genetics materials for revealing stress resistance and disease resistance breeding by testing the sequence variation at DRB1 gene and analyzing genetic parameters in detecting regionin in yak and cattle.Gannan yak，Qinghai yak，Tianzhu white yak，Datong yak and Cattle were used in this study.The polymorphism of intron 1 and exon 2 in BoLA-DRB1 gene were analyzed using PCR-single-strand conformational polymorphism.The results showed that 4 SNPs and 1 insertion/deletion mutation were detected in intron 1，and 17 SNPs were detected in exon 2，and they were highly polymorphism；Between these two regions，twenty-one haplotypes and the linkage disequilibrium phenomenon were found，and haplptypes A-A1，A-B1，B-A1and B-B1were most common in yak and cattle.The cluster analysis of DRB1 gene exon 2 showed that yak and other 6 species，cattle and goat were the highest on homology and the phylogenetic distance consistent with their genetic relationship. DRB1 gene intron 1 and exon 2 have high of sequence polymorphism，itmight be used as genetic marker in yak and cattle.

Yak；Cattle；DRB1 gene；Intron 1；Exon 2；Polymorphism

Q78 文獻標識碼：A 文章編號：1000-7091（2016）03-0072-08

10.7668/hbnxb.2016.03.011

2016-03-10

甘肅省杰出青年科學基金項目（1210RJDA008）；甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術研究與應用開發(fā)項目（GNSW-2013-9）作者簡介：田知利（1989-），男，山東成武人，在讀碩士，主要從事動物遺傳育種與生產(chǎn)研究。

胡 江（1975-），男，甘肅秦安人，副教授，博士，主要從事牛遺傳育種與生產(chǎn)研究。