盾葉半夏凝集素基因的克隆及功能分析

楊在君，劉玲玲，2，彭正松

（1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川南充 637009；2.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044）

盾葉半夏凝集素基因的克隆及功能分析

楊在君1，劉玲玲1，2，彭正松1

（1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川南充 637009；2.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044）

為克隆盾葉半夏凝集素基因，并對(duì)其功能進(jìn)行分析。采用RACE技術(shù)從盾葉半夏中克隆得到盾葉半夏凝集素基因的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為ppl。同時(shí)，構(gòu)建了ppl基因的原核表達(dá)載體，并成功實(shí)現(xiàn)了33 kDa重組蛋白在E.coli BL21中的表達(dá)。純化后的重組蛋白PPL用于凝血和體外抗癌試驗(yàn)。該基因的全長(zhǎng)cDNA序列為1 504 bp，其中開放性閱讀框（ORF）813 bp，編碼270個(gè)氨基酸，具有3個(gè)甘露糖結(jié)合識(shí)別位點(diǎn)。PPL具有凝血活性，這種凝血活性可受甘露糖抑制。PPL對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞（CNE）、人宮頸癌細(xì)胞（Hela）及人乳腺癌細(xì)胞（Bcap-37）的生長(zhǎng)均具有抑制作用，其中對(duì)Hela細(xì)胞的抑制效果最好。為進(jìn)一步研究PPL蛋白的功能奠定了理論基礎(chǔ)。

盾葉半夏；凝集素；基因克隆；功能分析

盾葉半夏（Pinellia peltata Pei）為天南星科（Araceae）半夏屬（Pinellia）多年生草本植物。直徑為1.0～2.5 cm近球形的塊莖，葉2～3片，葉片盾狀著生，與本屬其他任何種都不同；葉片呈深綠色，全緣，卵形或長(zhǎng)圓形；漿果卵圓形，銳尖；種子球形。產(chǎn)于浙江溫州、文成、福建松政等地，為我國(guó)所特有［1］草本植物。目前，盾葉半夏在我國(guó)分布數(shù)量極少，在《瀕危植物紅皮書》中被列為瀕危（E）級(jí)，被我國(guó)政府確定為國(guó)家二級(jí)保護(hù)野生植物。盾葉半夏的塊莖可消腫止痛、散瘀解毒，用于乳癰、腫毒、毒蛇咬傷、跌打損傷等疾病［2］。

凝集素是Stillmark在蓖麻（Ricinus communis L.）籽萃取物中首次發(fā)現(xiàn)的，李燕娥等［3］研究表明，植物凝集素含有一個(gè)或多個(gè)非催化性位點(diǎn)，可與單糖或多糖可逆結(jié)合，在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段，以不同的方式保護(hù)植物免受病蟲害的侵害，可以抵御細(xì)菌、真菌、病毒等病原體的入侵。目前成功的用于植物抗病蟲害基因工程的植物凝集素基因主要有半夏凝集素、雪花蓮凝集素基因等。半夏凝集素是一類專一結(jié)合甘露糖的蛋白質(zhì)，屬于單子葉植物甘露糖凝集素家族，具有顯著的抗蟲活性［4-5］。同時(shí)半夏凝集素能凝集羊、豬、狗、貓、鼠等的血紅細(xì)胞，而且能和生長(zhǎng)旺盛的肝癌細(xì)胞結(jié)合，并使其凝集，顯示出在治療肝癌上的應(yīng)用前景［6］。Yao等［7］首次克隆了半夏凝集素基因的cDNA，并將該基因成功轉(zhuǎn)到水稻、玉米、小麥、煙草等植物中，試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)褐飛虱、二化螟、麥蚜、桃蚜等均具有顯著抑制作用［8-11］。掌葉半夏和滴水珠凝集素基因cDNA也相繼被成功克隆，并表現(xiàn)出明顯的抗蟲性［12-14］。西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的趙靜等［15］利用半夏凝集素的核心保守序列設(shè)計(jì)引物成功克隆出盾葉半夏的核心序列。

本試驗(yàn)根據(jù)趙靜等［15］克隆出的盾葉半夏核心序列，利用3′RACE和5′RACE獲得了盾葉半夏凝集素ppl的cDNA全長(zhǎng)序列，同時(shí)分析了ppl基因的特征。并對(duì)原核表達(dá)出的重組蛋白PPL的凝血活性、單糖抑制活性和體外抗癌活性進(jìn)行了研究，以期為后續(xù)深入研究PPL蛋白的功能提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物樣品

本試驗(yàn)所用盾葉半夏（P.peltata）采自浙江溫州雁蕩山，現(xiàn)種植于西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院試驗(yàn)田中。選取健康幼嫩的葉片用于RNA提取。

1.2 菌株和載體及試劑

植物總RNA提取試劑盒EZgeneTMPlant Easy Spin RNA Miniprep Kit購自BIOMIGA公司（BIOMIGA，美國(guó)圣地亞哥）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV Reverse Transcriptase、大腸桿菌DH5α、pMD19-T載體、pET-28a載體、大腸桿菌BL21、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和Hin dⅢ購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa，中國(guó)大連）；3′RACE試劑盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購自Clontech公司（Clontech，美國(guó)加州）；5′RACE試劑盒5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0購自Invitrogen公司（Invitrogen，美國(guó)加利福尼亞）；引物合成和測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成（Sangon Biotech，中國(guó)上海）；Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司（CWBIO，中國(guó)北京）；CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（Solarbio，中國(guó)北京）。

1.3 RNA提取與cDNA合成

盾葉半夏總RNA的提取采用BIOMIGA公司的EZgeneTMPlant Easy Spin RNA Miniprep Kit植物總RNA提取試劑盒，按試劑盒的說明書提取總RNA，利用Nano-Drop 2000C分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度并評(píng)估RNA的質(zhì)量，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。按照TaKaRa公司的M-MLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ppl基因的克隆

根據(jù)本試驗(yàn)前期克隆的盾葉半夏凝集素核心保守序列［15］，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE反應(yīng)所需引物：3′RACE Outer，3′RACE Inter；5′RACE Outer，5′RACE Inter（表1）。3′RACE和5′RACE分別按照Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA Amp lification Kit試劑盒和Invitrogen公司的5′RACE System for Rapid Amp lification of cDNA Ends，Version 2.0試劑盒的說明書操作。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收和純化后，將目的片段連接到pMD19-T載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將PCR驗(yàn)證的陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。最后，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接確定該全長(zhǎng)序列的開放閱讀框（Open reading frame，ORF）。

表1 試驗(yàn)所用引物Tab.1 Prim ers used in this study

根據(jù)ppl的ORF，設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物ppl1-R和ppl1-F（表1），經(jīng)PCR擴(kuò)增，回收純化后，將目的片段連接到pMD19-T載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將PCR驗(yàn)證的陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.5 pp l基因的生物信息學(xué)分析

利用在線工具ORF find（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/gorf/gorf.htm l）和ProtParam（http：// web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)ppl的開放性閱讀框（ORF）、等電點(diǎn)和分子量。利用DNAMAN 5.0進(jìn)行不同物種間凝集素同源序列比對(duì)，用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 PPL重組蛋白的原核表達(dá)及純化

根據(jù)盾葉半夏的ppl基因序列設(shè)計(jì)特異性酶切引物ppl2-R和ppl2-F（表1），克隆ppl cDNA序列，將目的片段連接至載體pET-28a，測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。將PCR驗(yàn)證后的重組菌接種于1.5 m L的含Kan+的LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜；從過夜培養(yǎng)物中取200μL接種到20 m L LB培養(yǎng)液中（含Kan+），振蕩培養(yǎng)至吸光度A600= 0.5；加入IPTG，使終濃度為1 mmol/L，培養(yǎng)0～4 h，10 000 r/m in離心3 min，收集菌體；菌體沉淀用PBS懸浮，沸水浴4 m in，使蛋白質(zhì)變性。取10μL樣品用于SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

按照Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（康為世紀(jì)）操作手冊(cè)純化帶（His）6標(biāo)簽的目的蛋白，洗脫的蛋白質(zhì)溶液再經(jīng)透析純化獲得純的PPL蛋白。

1.7 PPL凝血活性及單糖抑制試驗(yàn)

采兔血和雞血用于本試驗(yàn)，采血后立即加抗凝劑（檸檬酸三鈉溶液），顛倒混勻，冷凍離心機(jī)在4℃下，2 000 r/m in離心5 m in。血液分層，然后吸掉上層和中間層，留最下層的紅細(xì)胞。用生理鹽水洗滌4～5次。最后，吸取洗滌后的紅細(xì)胞加入到生理鹽水中，配制成2%（V/V）的紅細(xì)胞懸液。

用雙重稀釋法檢測(cè)凝集素凝血活性［16］，在96孔板上，先在1～12孔中分別加入25μL生理鹽水，再在第1孔中加入25μL PPL溶液（濃度為300 μg/m L，生理鹽水稀釋），然后取出25μL對(duì)2～12孔進(jìn)行稀釋，然后每孔中加入兔血或雞血球懸浮液25μL，混合均勻，室溫下放置1 h后再利用高倍鏡（40×）檢查紅細(xì)胞的凝集情況。每次觀察設(shè)3組平行試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果取平均值，能使紅細(xì)胞凝集的最低有效終濃度即為凝集滴度。

選擇以下糖類：葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖、D-果糖、D-半乳糖用兔血球緩沖液配制成濃度為0.1 mol/L的不同糖溶液，將糖溶液在96孔板上進(jìn)行倍比稀釋，室溫靜置1 h后，用40倍顯微鏡觀察結(jié)果。糖的抑制能力即為抑制凝血作用所需要的最小糖濃度［16］。

1.8 PPL抗癌活性研究

采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)期時(shí)，將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔200μL，細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/m L，然后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿孔底部，則可加入不同濃度的重組PPL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入CCK-8，孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值。根據(jù)吸光值計(jì)算PPL對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞（CNE）、人宮頸癌細(xì)胞（Hela）及人乳腺癌細(xì)胞（Bcap-37）生長(zhǎng)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 ppl基因的克隆及分子特征

采用3′RACE方法經(jīng)2輪巢式PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)生的目的條帶如圖1-A所示，測(cè)序長(zhǎng)度為519 bp；采用5′RACE方法，擴(kuò)增出的目的條帶如圖1-B所示，測(cè)序長(zhǎng)度為540 bp；將擴(kuò)增出的3′RACE片段、5′RACE片段和之前西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室克隆出的核心片段拼接獲得ppl的cDNA全長(zhǎng)為1 504 bp，利用NCBI在線工具ORF finder確定該基因的ORF為813 bp，編碼270個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)（PI）為7.65，分子量為29.48 kDa，5′-UTR和3′-UTR分別為402，289 bp。以ppl1-R和ppl1-F為引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)生單一條帶（圖1-C），測(cè)序表明該序列與拼接結(jié)果一致，表明已成功獲得ppl全長(zhǎng)cDNA。

圖1 盾葉半夏ppl基因3′-RACE、5′-RACE和ORF序列PCR擴(kuò)增Fig.1 3′-RACE，5′-RACE and ORF am p lifications of ppl gene in P.peltata

經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫中BlastP檢索，發(fā)現(xiàn)PPL與天南星科多種植物凝集素蛋白的序列相似。其中，PPL與滴水珠（Pinellia cordata N.E.Br）的凝集素PCA相似性最高，為88%，其次為半夏（Pinellia ternata（Thunb.）Breit.）的PTA和掌葉半夏（Pinellia pedatisecta Schott）的PPA等。由此可以斷定，試驗(yàn)所得的基因?qū)儆谀丶易寤颉Ｓ肈NAMAN軟件將 PPL與同源性較高的滴水珠 PCA（ABK88277）、半夏PTA（AAR27794）和掌葉半夏PPA（AGV40779）的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些蛋白都具有3個(gè)α-D-甘露糖結(jié)合識(shí)別位點(diǎn)QXDXNXVXY（QDNVY）［17］，其中第1個(gè)位點(diǎn)和第2個(gè)位點(diǎn)的保守程度較高，氨基酸的序列完全一致，第3個(gè)位點(diǎn)在不同物種中變化較大（圖2）。

圖2 PPL蛋白與半夏屬其他植物的凝集素蛋白序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 M ultip le sequence alignm ent of PPL w ith lectin protein sequence from other p lants in Pinellia

2.2 PPL的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法（Neigh-bourjoining，NJ）構(gòu)建PPL與天南星科其他植物凝集素氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，這些序列包括：滴水珠PCA（ABK88277）、半夏PTA（AAR27794）、掌葉半夏PPA（AGV40779）、天南星AHA（AAP50524）、海芋AML（ABC69036）、花南星ALA（AAS66304）、東北天南星AAL（ABY91323）、犁頭尖TDA（ABM68041）和巖芋RVA（ACH41914）。聚類結(jié)果表明：天南星科植物的凝集素可聚為3類（圖3），第1類除天南星的凝集素AHA外，其余都是半夏屬植物的凝集素，包括：PPA、PCA、PPL和PTA；第2類包括：ALA、AAL、AML和RVA；第3類只包括TDA。盾葉半夏凝集素PPL聚在第一類，與半夏凝集素PTA親緣關(guān)系最近。

圖3 PPL與其他植物凝集素氨基酸序列的進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of PPL and lectin am ino acid sequences from other p lan ts

2.3 PPL重組蛋白的表達(dá)及純化

將ppl基因的重組子轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)大腸桿菌表達(dá)了33 kDa的蛋白質(zhì)（包括組氨酸標(biāo)簽），隨著誘導(dǎo)時(shí)間的推移，蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加，3～4 h達(dá)到最大值。提取的蛋白質(zhì)在經(jīng)過2 mol/L尿素洗脫以后，上柱純化，純化洗脫液電泳后可觀察到單一目的條帶（圖4），說明純化效果較好，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖4 PPL的原核表達(dá)及純化Fig.4 Prokaryotic exp ression and pu rification of PPL

2.4 PPL的凝血活性及單糖抑制試驗(yàn)

凝血活性測(cè)定結(jié)果表明，PPL對(duì)兔血紅細(xì)胞有凝集活性，而對(duì)雞血紅細(xì)胞無凝集活性。PPL對(duì)兔血紅細(xì)胞的凝集滴度為54μg/m L。糖抑制試驗(yàn)的結(jié)果表明，PPL凝集兔血紅細(xì)胞的能力能被甘露糖完全抑制，抑制能力為5.4μg/m L。葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、D-果糖、D-半乳糖對(duì)PPL沒有抑制作用。

2.5 PPL抗癌活性

從圖5可以看出，PPL對(duì)CNE、Hela和Bcap-37細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有抑制作用，且PPL對(duì)CNE、Hela及Bcap-37細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均具有劑量依賴性。其中對(duì)Hela細(xì)胞的抑制效果最好，當(dāng)PPL濃度達(dá)到200μg/mL時(shí)對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率可以達(dá)到72.31%。

圖5 PPL對(duì)CNE、Hela和Bcap-37細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用Fig.5 The effect of PPL on the grow th of CNE，Hela and Bcap-37 cells

3 討論

近年來，植物凝集素在細(xì)胞凝集［18］、抗蟲［19-22］、抗動(dòng)物病毒［23］、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬［24］以及抗腫瘤［25］等方面的研究受到越來越多的重視。特別是凝集素在癌癥的治療和診斷中起到了越來越重要的作用。大量研究數(shù)據(jù)表明，凝集素對(duì)細(xì)胞間的黏著、靶細(xì)胞的識(shí)別、細(xì)胞定位、癌細(xì)胞的有絲分裂、跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、宿主免疫防御、細(xì)胞毒性及細(xì)胞死亡等均具有重要的調(diào)控作用。據(jù)王海燕等［26］報(bào)道歐洲槲寄生提取物在臨床上可作癌癥患者化療佐劑。其中槲寄生凝集素（ML）被認(rèn)為是最重要的活性成分。刀豆凝集素ConA具有自噬型細(xì)胞毒性和免疫調(diào)節(jié)的雙重功能，在小鼠肝癌原位模型中，定期和定量的ConA飼喂，能使腫瘤組織明顯萎縮［27］。半夏凝集素PTA能體外凝集惡性腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［6］。加利福尼亞大學(xué)的L ubli等［28］的研究也表明，凝集素可以有效地抑制癌癥的早期發(fā)展。

本試驗(yàn)成功地從盾葉半夏中克隆出盾葉半夏凝集素基因ppl的全長(zhǎng)cDNA序列。該基因全長(zhǎng)cDNA為1 504 bp，編碼270個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)（PI）和分子量分別為7.65，29.48 kDa。同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)ppl與半夏屬其他物種如滴水珠、掌葉半夏和半夏的凝集素基因cDNA序列具有較高的同源性。聚類分析同樣證實(shí)盾葉半夏凝集素PPL與半夏凝集素PTA親緣關(guān)系最近。對(duì)該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，PPL具有3個(gè)α-D-甘露糖結(jié)合識(shí)別位點(diǎn)，其中第1，2位點(diǎn)與半夏屬其他物種的凝集素蛋白如：PCA、PTA和PPA的序列完全一致，第3個(gè)位點(diǎn)存在一定的變異。已有研究表明，槲寄生凝集素不同亞型MLI和MLIII B之間氨基酸序列不同，對(duì)糖結(jié)合的特異性也發(fā)生了變化［29］。凝集素的抗蟲活性與它和糖類可逆性結(jié)合能力密切相關(guān)。Zhu等［30］通過定點(diǎn)突變技術(shù)，使豆科植物的凝集素GASⅡ喪失與糖結(jié)合的能力，結(jié)果該凝集素喪失了抗蟲活性。因此，盾葉半夏ppl基因這種結(jié)構(gòu)上的差異是否是由于物種上的差別引起的，以及這種差別對(duì)甘露糖結(jié)合效力和抗蟲作用的影響如何，還需要利用分子突變等方法進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

通過ppl基因的原核表達(dá)和蛋白純化，獲得了重組PPL蛋白，凝血活性結(jié)果表明，重組PPL蛋白對(duì)兔血紅細(xì)胞有凝集活性，而對(duì)雞血紅細(xì)胞無凝集活性。糖抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，PPL凝集兔血紅細(xì)胞的能力能被甘露糖完全抑制。因此，PPL是一種甘露糖結(jié)合凝集素。PPL體外抗癌活性試驗(yàn)研究結(jié)果表明，PPL對(duì)CNE、Hela和Bcap-37細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有抑制作用，其中對(duì)Hela細(xì)胞的抑制效果最好，當(dāng)PPL濃度達(dá)到200μg/m L時(shí)對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率可以達(dá)到72.31%。

本試驗(yàn)通過盾葉半夏凝集素基因的克隆、原核表達(dá)和蛋白純化，獲得了半夏凝集素基因ppl的全長(zhǎng)cDNA序列和重組PPL蛋白。同時(shí)對(duì)PPL蛋白的凝血活性和單糖抑制活性及體外抗癌活性進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步開展盾葉半夏凝集素對(duì)癌細(xì)胞表面糖抗原表型作用以及對(duì)癌細(xì)胞侵染轉(zhuǎn)移的影響和甘露糖型凝集素的抗腫瘤研究奠定了理論基礎(chǔ)。

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C loning and Functional Analysis of the Lectin Gene in Pinellia peltata

YANG Zaijun1，LIU Lingling1，2，PENG Zhengsong1
（1.College of Life Science，China West Normal University，Key Laboratory of Southwest China W ildlife Resources Conservation，Ministry of Education，Nanchong 637009，China；2.Bioengineering College，Chongqing University，Key Laboratory of Biorheological Science and Technology，Ministry of Education，Chongqing 400044，China）

To clone a lectin gene from Pinellia peltata and analyze its bioactivity.A lectin gene，designated as ppl，was cloned by using RACE in Pinellia peltata.The open reading frame（ORF）of P.peltata lectin（ppl）was constructed into the pET-28a vector.A recombinant protein about33 kDa in the Escherichia coli BL21 was induced. The purified recombinant protein was used blood coagulation experiment and anticancer experiment in vitro.The full-length cDNA of ppl was1 504 bp，and contained an 813 bp ORF with a deduced amino acid sequence of270 residues.The putative PPL protein contained three mannose binding site.The PPL had clotting activity，and this activity could be inhibited by mannose.The result of anticancer experiment in vitro showed that the PPL could inhibit the growth of nasopharyngeal carcinoma cell（CNE），human cervical carcinoma cell（Hela）and human breast cancer cell（Bcap-37）.These results were useful for further determination of the function of P.peltata lectin protein（PPL）.

Pinellia peltata；Lectin；Gene cloning；Functional analysis

Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-7091（2016）03-0032-06

10.7668/hbnxb.2016.03.005

2016-03-12

西華師范大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（11B017）

楊在君（1981-），男，四川南充人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物資源與分子生物學(xué)研究。楊在君、劉玲玲為同等貢獻(xiàn)作者。