復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑的制備及質(zhì)量控制

周愛(ài)媚，汪 妍，方圓圓，陳 菲

（金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華 321007）

復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑的制備及質(zhì)量控制

周愛(ài)媚，汪 妍*，方圓圓，陳 菲

（金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華 321007）

目的 制備復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑，并用高效液相（HPLC）法測(cè)定復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑中白鮮堿的含量。方法 以白鮮堿為指標(biāo)成分控制含量，用閃式提取法提取白鮮皮和苦參混合物濃縮液，確定了以1.0%卡波姆-940、1.0%冰片、10%甘油、5%乙醇、0.2%聚山梨酯80、0.1%羥苯乙酯、1.35%三乙醇胺為處方組成，通過(guò)外觀和穩(wěn)定性觀察實(shí)驗(yàn)確定復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑制備工藝。結(jié)果 凝膠劑外觀性狀為淡黃色晶瑩透明狀膠體，氣微清香；pH值約為6.7；穩(wěn)定性試驗(yàn)表明本品各指標(biāo)均無(wú)明顯改變，皮膚刺激性試驗(yàn)表明本品對(duì)皮膚無(wú)明顯刺激，手足癬主要致病真菌的抑菌試驗(yàn)表明該制劑對(duì)皮膚表面自然菌的除菌率為71.8%。結(jié)論 本制備方法簡(jiǎn)便可行，分析方法可用于控制白鮮皮抗菌凝膠劑中有效成分的含量。

復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑；制備；質(zhì)量控制

白鮮皮為蕓香科白鮮屬植物白鮮Dictamnus dasycarpus Turcz.的干燥根皮，是一種常用中藥，為歷代本草及《中國(guó)藥典》收載。白鮮皮屬于多年生草本，根皮外表面呈淡灰黃色、內(nèi)表面類白色，肉質(zhì)脆，味微苦，寒。具有清熱燥濕、祛風(fēng)止癢、解毒之功效，臨床上用于治療濕熱瘡毒、濕風(fēng)疹、疥癬瘡癩、風(fēng)濕熱痹、神經(jīng)性皮炎等慢性頑固性皮膚病[1]等，并對(duì)心血管及血液病有一定療效，特別是對(duì)皮膚類疾病有很好的治療作用，如對(duì)皮膚瘙癢，濕熱瘡瘍，陰部腫痛等病癥都有一定的功效?；瘜W(xué)研究表明，其中的白鮮堿和梣酮是主要有效成分，具有顯著活性[2]。目前西醫(yī)臨床上主要用抗真菌軟膏類藥物來(lái)治療手足癬，但由于合成的抗真菌藥物不良反應(yīng)多，易產(chǎn)生耐藥性，還有一定的毒副作用，真菌感染治療仍然面臨許多挑戰(zhàn)[2]。鑒于中藥副作用小，來(lái)源廣，價(jià)格低廉，較少出現(xiàn)耐藥性，因此從天然藥物中尋找安全性好、抗菌譜廣、療效高的抗真菌抗細(xì)菌成分已成為重要的研究方向[3]。因而本實(shí)驗(yàn)篩選出具有清熱祛濕、涼血解毒、殺蟲(chóng)止癢等功效的中藥白鮮皮和苦參作為復(fù)方藥材，以白鮮堿為指標(biāo)成分提取其濃縮液，并將復(fù)方白鮮皮濃縮液制備為凝膠劑[4]。本文經(jīng)過(guò)對(duì)復(fù)方白鮮皮進(jìn)行高效液相（HPLC）法含量控制，驗(yàn)證其有效成分的含量，從而促進(jìn)復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑的臨床應(yīng)用。

1儀器與試藥

1.1儀器

閃式提取器（河南金鼎科技發(fā)展有限公司）、F1004型電子天平（上海天平儀器廠）、高速藥材粉碎機(jī)（浙江金華華盛實(shí)業(yè)有限公司）、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州恒德儀器制造有限公司）、BC-R501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海盛玻儀器有限公司產(chǎn)品）、Waters2487高效液相色譜儀、2487紫外分光檢測(cè)器、Breeze色譜工作站、DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海和呈儀器制造有限公司）、LDZX-75KBS高壓滅菌器（上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）、凈化工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、酸堿測(cè)試儀、研缽等。

1.2試劑

白鮮皮、苦參（購(gòu)自金華三溪堂國(guó)藥館）、甘油、卡波姆-940（青島美生源生物科技有限公司）、乙醇（深圳市天時(shí)化工有限公司）、聚山梨酯80（上海山浦化工有限公司）、三乙醇胺（上?；瘜W(xué)試劑有限公司）、稀鹽酸（無(wú)錫陽(yáng)山生化有限責(zé)任公司）、羥苯乙酯（上海山浦化工有限公司）、冰片（天津市化學(xué)試劑公司）、色譜級(jí)甲醇（北京京科瑞達(dá)有限公司）、去離子純化水等。金黃色葡萄球菌（Staphy lococcus aureus）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、石膏樣小孢子菌（Microsporum gypseum）、犬小孢子菌（Microsporum canis）、紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum）、須癬毛癬菌（Trichophyton mentagrophytes）、絮狀表皮癬菌（Epidermophyton floccosum）由金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3對(duì)照品

白鮮堿標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所）。

2方法與結(jié)果

2.1復(fù)方白鮮皮濃縮液制備

將白鮮皮和苦參（3∶1）打碎磨粉后稱取40 g于閃式提取器中，以1∶10的料液比加入80%的乙醇溶液，提取電壓為60 V，提取時(shí)間為2 min，過(guò)濾，收集濾液，濃縮和真空冷凍干燥，用80%乙醇溶解并定容至200 mg.ml-1備用。取復(fù)方白鮮皮提取液200 ml（白鮮皮∶苦參=3∶1），用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，遺留殘?jiān)?0%乙醇液20 ml溶解，過(guò)濾，濾液用80%乙醇定容至20 ml，制成每1 ml含2 g藥材的溶液。

2.2凝膠劑的制備

2.2.1凝膠基質(zhì)處方基質(zhì)處方組成：卡波姆-940[5，6]1.0 g，甘油10 g，乙醇5 g，聚山梨酯80 0.2 g，羥苯乙酯0.1 g，三乙醇胺1.35 g，蒸餾水加至100 ml。

制備方法：將卡波姆-940播撒入甘油表面，用研磨法使其充分浸潤(rùn)完全后，再加10 ml蒸餾水研磨細(xì)膩，加50 ml水，使之充分溶脹。將三乙醇胺、聚山梨酯80溶于5 ml水后加入上液研磨，再將羥苯乙酯溶于乙醇逐漸加入攪勻，加蒸餾水至全量，攪拌均勻即得。

結(jié)果觀察：呈膠凍狀，透明清亮細(xì)膩，光澤度好，長(zhǎng)時(shí)間放置穩(wěn)定。

2.2.2復(fù)方白鮮皮凝膠劑制備（1）處方設(shè)計(jì)：冰片[7]1.0 g，復(fù)方白鮮皮濃縮液5 ml，卡波姆-940 1.0 g，甘油10 g，乙醇5 g，聚山梨酯80 0.2 g，羥苯乙酯0.1 g，三乙醇胺1.35 g，蒸餾水加至100 g。

（2）制備工藝的優(yōu)化。制備方法一：將卡波姆-940 1.0 g播撒入10 g甘油表面，用研磨法使其充分浸潤(rùn)完全后，加入復(fù)方白鮮皮濃縮液5 ml和5 ml溶有冰片和羥苯乙酯的乙醇溶液；再加50 ml蒸餾水研磨細(xì)膩，使之充分溶脹；將三乙醇胺、聚山梨酯80溶于10 ml水后加入上液研磨，再加蒸餾水至全量，攪拌均勻即得。

制備方法二：將卡波姆-940 1.0 g播撒入10 g甘油表面，用研磨法使其充分浸潤(rùn)完全后，加10 ml蒸餾水使之充分溶脹；加入復(fù)方白鮮皮濃縮液5 ml和5 ml溶有冰片和羥苯乙酯的乙醇溶液，再加40 ml蒸餾水研磨細(xì)膩；將三乙醇胺、聚山梨酯80溶于10 ml水后加入上液研磨，再加蒸餾水至全量，攪拌均勻即得。

制備方法三：將卡波姆-940 1.0 g播撒入10 g甘油表面，用研磨法使其充分浸潤(rùn)完全后，再加50 ml蒸餾水研磨細(xì)膩，使之充分溶脹；將三乙醇胺、聚山梨酯80溶于10 ml水后加入上液研磨；加入復(fù)方白鮮皮濃縮液5 ml和5 ml溶有冰片和羥苯乙酯的乙醇溶液，再加蒸餾水至全量，攪拌均勻即得。

2.2.3結(jié)果考察（見(jiàn)表1）通過(guò)對(duì)3個(gè)成品進(jìn)行外觀性狀觀察和長(zhǎng)時(shí)間放置穩(wěn)定性觀察兩個(gè)指標(biāo)確定制備方法的優(yōu)劣，經(jīng)過(guò)綜合評(píng)價(jià)，制備方法二被篩選為實(shí)驗(yàn)最佳制備方法。

表1 各制備方法考察結(jié)果

2.3凝膠劑含量測(cè)定

2.3.1色譜條件色譜條件：以Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱；以甲醇—水（V/V=70∶30）為流動(dòng)相；流速：0.5 ml/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm；靈敏度：0.5AUFS；進(jìn)樣量：20 μl。理論塔板數(shù)以白鮮堿計(jì)不低于5 000。

2.3.2供試品溶液的制備 取凝膠劑樣品5 g，精密稱定，置于50 ml錐形瓶中，加流動(dòng)相（甲醇∶水=70∶30）約15 ml，超聲20 min，放置至室溫，轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度。搖勻，離心10 min，取其上清液過(guò)0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.3對(duì)照品溶液的制備 稱取白鮮堿標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于100 ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.664 mg/ml的白鮮堿對(duì)照品溶液。

2.3.4測(cè)定方法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 精密吸取白鮮堿對(duì)照品用流動(dòng)相依次稀釋定容，配制成1.05、4.2、8.4、16.8、33.2、66.4 μg·ml-1系列濃度，分別進(jìn)樣，以白鮮堿對(duì)照品質(zhì)量濃度X對(duì)白鮮堿色譜峰面積Y做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為：y=740 444.85x+ 2 265 470.91，r2=0.999 3（n=6）。即呈良好線性關(guān)系。

2.3.6精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液20 μl，注入高效液相色譜儀，連續(xù)測(cè)定5次，記錄峰面積積分值，并以峰面積計(jì)算RSD值。結(jié)果表明，該儀器精密度良好，可靠性強(qiáng)。

2.3.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑供試品溶液20 ul，按照上述色譜條件分別于0、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，并以峰面積計(jì)算RSD值。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h基本穩(wěn)定，RSD值為2.54%。

2.3.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液20 μl，依法測(cè)定，重復(fù)測(cè)定5次。結(jié)果表明5批樣品的白鮮堿含量平均為8.8 μg/g，RSD為1.57%。

2.3.9回收率試驗(yàn) 精密稱取復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑3批次樣品各1份，每份分別加入白鮮堿對(duì)照品溶液適量，制備成高、中、低3個(gè)濃度各3份，計(jì)算每個(gè)濃度的平均加樣回收率，平均回收率103.85%，RSD=2.24%（n=3），說(shuō)明方法回收率良好。

2.3.10樣品含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液20 μl，進(jìn)樣測(cè)定，3批樣品中白鮮堿的平均含量為8.75 μg/g，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　各批號(hào)樣品含量測(cè)定結(jié)果（μg/g）

2.4皮膚刺激性試驗(yàn)

2.4.1方法 選用健康家兔4只，體重在4.0～5.0 kg之間，在給藥前24 h將兔背部脊柱兩側(cè)對(duì)稱脫毛（每側(cè)大約5 cm×5 cm）。以每只兔子左邊為試驗(yàn)組，右邊為對(duì)照組。每次在背脊右側(cè)涂空白凝膠劑0.3 g，背脊左側(cè)涂含藥凝膠劑0.3 g，每日重復(fù)給藥2次，連續(xù)給藥1周，觀察皮膚變化。

2.4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果 觀察比較對(duì)照組和試驗(yàn)組在給藥過(guò)程中及給藥1周內(nèi)的皮膚情況。結(jié)果表明基本無(wú)發(fā)生皮膚紅斑及水腫現(xiàn)象，說(shuō)明本制劑對(duì)皮膚基本無(wú)刺激。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.5.1離心試驗(yàn) 取凝膠劑樣品10 g，裝入離心試管中，以2 500 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，結(jié)果凝膠劑未出現(xiàn)分層和沉淀現(xiàn)象。

2.5.2耐熱試驗(yàn) 取凝膠劑樣品10 g，置于60℃恒溫水浴放置6 h，結(jié)果凝膠劑未出現(xiàn)分層和沉淀現(xiàn)象。

2.5.3耐寒試驗(yàn) 取凝膠劑樣品10 g，置于-15℃冰箱放置24 h，結(jié)果凝膠劑未出現(xiàn)分層及凍結(jié)現(xiàn)象。

2.6抑菌試驗(yàn)

2.6.1懸液定量法 吸取樣品凝膠劑原液放入5.0 ml的滅菌試管中，20℃恒溫5 min。吸取試驗(yàn)菌液（濃度約為1×104～9×104cfU/ml）0.1 ml加入到凝膠劑樣品中，迅速混勻，并立即計(jì)時(shí)，作用至30 min后，取試驗(yàn)菌與樣品混合液1 ml，加入到含5.0 ml經(jīng)滅菌的PBS試管中，充分混勻。置10 min后，吸取混勻后的樣液1 ml，置于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)樣液接種兩個(gè)滅菌平皿。用涼至40℃~45℃的培養(yǎng)基15 ml做傾注，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，當(dāng)試驗(yàn)菌是金黃色葡萄球菌或綠膿桿菌時(shí)，置37℃恒溫箱培養(yǎng)16～18 h；當(dāng)試驗(yàn)菌是紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌、石膏樣小孢子菌或犬小孢子菌時(shí)，置26℃恒溫箱培養(yǎng)7天，做活菌菌落計(jì)數(shù)；以PBS代替試驗(yàn)樣品，同時(shí)按以上步驟操作，作為對(duì)照樣品，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求其平均值。

抑菌率=（對(duì)照樣品平均菌落數(shù)—試驗(yàn)樣品平均菌落數(shù)）÷對(duì)照樣品平均菌落數(shù)。

懸液定量法結(jié)果表明：復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑對(duì)紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌、石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的抑菌率均在70%以上。

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，抑菌率大于50%的抑菌型制劑屬于B2級(jí)以上級(jí)。說(shuō)明復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑抑菌試驗(yàn)均達(dá)到了國(guó)家QBT2850-2005抑菌型制劑抑菌標(biāo)準(zhǔn)。

2.6.2使用前后菌落數(shù)比較試驗(yàn)隨機(jī)選定40名足癬患者志愿受試者。采樣者用無(wú)菌棉拭子在含有10 ml無(wú)菌蒸餾水試管中浸濕，在左腳指屈面從指尖到指根往返涂擦2遍采樣，作為使用復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑前對(duì)照。用無(wú)菌棉拭子蘸取復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑對(duì)左腳指屈面從指尖到指根往返涂擦2遍進(jìn)行擦拭，作用5 min，用無(wú)菌棉拭子按上述方法進(jìn)行采樣，作為試驗(yàn)組樣本。對(duì)所有采樣標(biāo)本經(jīng)充分振蕩洗脫，取洗脫液進(jìn)行培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算自然菌減少對(duì)數(shù)值。結(jié)果表明：使用前志愿受試者腳上平均菌落數(shù)為195 cfu/cm2，用復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑后，腳上殘存的平均菌落數(shù)為55 cfu/cm2，說(shuō)明用該凝膠劑對(duì)皮膚表面自然菌的除菌率為71.8%。

3小結(jié)

（1）采用現(xiàn)代提取工藝80%乙醇閃式提取白鮮皮的抗菌成分，與傳統(tǒng)的水煎法相比，有提取完全、濃縮方便、藥液不易發(fā)霉等優(yōu)點(diǎn)；與回流提取法相比，有提高提取效率、縮短提取時(shí)間、減少溶劑使用量等優(yōu)點(diǎn)。

（2）本研究結(jié)合臨床和民間治療手足癬的經(jīng)驗(yàn)，篩選出治療手足癬的中藥復(fù)方制劑。中藥白鮮皮多制成洗液或者乳劑進(jìn)行使用，而制成凝膠制劑的甚少。凝膠劑制備操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低。

（3）目前市場(chǎng)上個(gè)人洗護(hù)產(chǎn)品很多，但據(jù)調(diào)查對(duì)手部和足部癬菌有一定治療作用的護(hù)理產(chǎn)品幾乎沒(méi)有。而本制劑能克服西藥產(chǎn)生耐藥性及有一定毒副作用的弊端，有較好的治療作用，且安全、方便，能滿足消費(fèi)者追求產(chǎn)品綠色化與安全的消費(fèi)心理，有產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)效益的前景。

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（*通訊作者：汪妍）

R944.1+5

B

1671-1246（2016）13-0094-03

注：本文系2015年浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目（2015R468001）