斜帶石斑魚Frizzled 4基因的克隆及表達(dá)分析

陳華譜，洪　廣，鄧思平，朱春華，李廣麗，陳　燕，黃　海，李水生

(1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境湛江市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江 524088；2.海南熱帶海洋學(xué)院，海南 三亞 572022； 3.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

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斜帶石斑魚Frizzled4基因的克隆及表達(dá)分析

陳華譜1，洪廣1，鄧思平1，朱春華1，李廣麗1，陳燕2，黃海2，李水生3

(1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境湛江市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江 524088；2.海南熱帶海洋學(xué)院，海南 三亞 572022； 3.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

摘要：利用同源克隆和RACE的方法，從斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)卵巢中克隆了Frizzled4(gFZD4)的全長cDNA序列.gFZD4 的cDNA序列全長2 033bp，其中開放閱讀框1 596bp、編碼531個(gè)氨基酸.氨基酸序列比對和系統(tǒng)樹分析顯示，gFZD4的結(jié)構(gòu)十分保守，斜帶石斑魚與鱸形目羅非魚的親緣關(guān)系最近.RT-PCR分析表明，gFZD4基因在斜帶石斑魚組織中廣泛表達(dá)，其中腦、腎臟、心臟和腮組織的表達(dá)量較高.熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，gFZD4基因的表達(dá)水平在胚胎發(fā)育的早期較低、在桑葚期顯著升高、在囊胚期最高，其后除了肌節(jié)形成期外均基本與桑葚期的表達(dá)水平相似；gFZD4基因在卵巢發(fā)育過程中表達(dá)水平較低，而在性逆轉(zhuǎn)的精巢發(fā)育過程中表達(dá)水平顯著升高，表明gFZD4介導(dǎo)的Wnt信號通路在石斑魚的性逆轉(zhuǎn)過程中可能發(fā)揮了重要作用.

關(guān)鍵詞：斜帶石斑魚； 卷軸受體4； 性腺發(fā)育； 性逆轉(zhuǎn)

Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是機(jī)體重要的信號通路之一，參與生長發(fā)育、免疫和生殖等重要生命活動(dòng)[1]，需要細(xì)胞表面的Frizzled(FZD)介導(dǎo)[2].FZD基因最早是從果蠅的突變體中被發(fā)現(xiàn)和鑒定出來的，其突變會(huì)破壞成年果蠅表皮細(xì)胞的極性[3]，后來在許多動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)了FZD基因.FZD是多亞型基因家族，在果蠅中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4種亞型，在秀麗隱桿線蟲中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3種，在人類中已經(jīng)克隆鑒定了10種，通過基因比對預(yù)測斑馬魚中可能存在9種FZD基因亞型.FZD基因的生理功能目前尚不十分清楚[4].

FZD4 是FZD家族中最受關(guān)注的成員之一.早期的研究已經(jīng)證實(shí)FZD4在眼睛和血管系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮十分重要的作用[5]，其突變會(huì)引起家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變(familialexudativevitreoretinopathy，F(xiàn)EVR)[6].隨著生理功能研究的不斷深入，更多的關(guān)注集中于FZD4在生殖調(diào)控中的作用.研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZD4mRNA在人卵巢的粒層細(xì)胞中大量表達(dá)[7]；FZD4在嚙齒動(dòng)物卵巢中的表達(dá)受雌激素調(diào)控，并廣泛存在于懷孕和產(chǎn)后的老鼠、兔子的粒層細(xì)胞、成長中的卵泡以及黃體細(xì)胞中，缺失FZD4基因的小鼠喪失了生育功能，具體表現(xiàn)為黃體形成和功能上的不正常，表明了FZD4基因在生殖發(fā)育中的關(guān)鍵性作用[8].因此，F(xiàn)ZD4基因被認(rèn)為是高等脊椎動(dòng)物中介導(dǎo)Wnt信號在生殖調(diào)控中的主導(dǎo)受體亞型[9]，但是，尚無研究表明其在魚類生殖調(diào)控中起著類似的生理功能.

本研究以我國南方重要的海水養(yǎng)殖魚類斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)為研究對象，利用Smart-RACE方法克隆鑒定斜帶石斑魚Frizzled4(gFZD4)基因的cDNA全長序列，進(jìn)行序列比對分析，并檢測gFZD4在斜帶石斑魚的組織器官、不同發(fā)育時(shí)期的胚胎以及正常卵巢和性逆轉(zhuǎn)過程中卵巢的表達(dá)水平，為后續(xù)的FZD4介導(dǎo)Wnt信號通路在石斑魚生殖發(fā)育過程中的生理功能及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究奠定初步基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)魚分子克隆及組織表達(dá)分析用的斜帶石斑魚取自廣東海洋大學(xué)東海島養(yǎng)殖基地.實(shí)驗(yàn)魚被深度麻醉后，將其全腦、垂體、肝臟、卵巢、心臟、腎臟、脾臟、胃、腸、鰓和肌肉等組織器官取出，立即置于液氮保存.不同發(fā)育時(shí)期的性腺和不同發(fā)育時(shí)期的胚胎樣本取自海南省陵水養(yǎng)殖基地，液氮保存.

1.1.2試劑總RNA提取試劑使用的TrizolReagent購于Life公司(USA)，DNaseⅠ和theReverTraAce-αfirst-strandcDNASynthesisKit試劑盒購于TOYOBO公司，Smart-RACE試劑盒購自TakaraClontech公司(Japan)，Taq酶和載體pTZ7R/T購于MBIFermentas公司，質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒購自東盛公司, 其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2方法

1.2.1引物根據(jù)NCBIGenBank中其他物種FZD4基因的cDNA序列的保守序列設(shè)計(jì)克隆斜帶石斑魚FZD4基因保守部分的簡并引物，擴(kuò)增中間片段序列，進(jìn)而根據(jù)測序后的序列設(shè)計(jì)用于RACE擴(kuò)增、開放閱讀框擴(kuò)增、熒光定量PCR等的引物(表l).

表1 斜帶石斑魚gFZD4基因克隆與定量分析所用引物

1.2.2總RNA提取利用注射器抽提或研磨等方法進(jìn)行組織勻漿，總RNA的提取根據(jù)Trizol?reagent試劑盒說明書操作.總RNA的濃度和純度用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性.

1.2.3分子克隆與序列分析用卵巢的總RNA作為模板，根據(jù)Smart-RCAE試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成FZD4基因5’端和3’端的第一鏈cDNA.克隆獲得部分序列后進(jìn)行3’-RACE和5’-RACE，進(jìn)而通過拼接得到全長；然后設(shè)計(jì)開放閱讀框全長驗(yàn)證特異引物擴(kuò)增，最終獲得驗(yàn)證的FZD4基因cDNA全長序列.利用DNAtools6.0 軟件預(yù)測斜帶石斑魚gFZD4基因的開放閱讀框(ORF)和相應(yīng)的氨基酸序列，用DNASTAR軟件對不同生物的FZD4序列進(jìn)行同源性分析.用SignalP3.0 在線分析gFZD4基因的信號肽，用TMHMMServerv. 2.0分析蛋白的跨膜區(qū)，并用Mega4.0的鄰位相鄰法構(gòu)建蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹[10-11].

1.2.4組織分布取待測組織器官的總RNA各1μg，分別經(jīng)DNaseⅠ去除基因組DNA后，按照FirstStrandcDNASynthesisKitReverTraAce-α(TOYOBO,Japan)的說明書進(jìn)行cDNA的合成；然后用斜帶石斑魚FZD4的特異檢測引物(gFZD4-QF和gFZD4-QR)進(jìn)行FZD4基因在各組織中的半定量檢測，以18srRNA基因作為內(nèi)參，反應(yīng)體系為20μL；循環(huán)反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2min，94 ℃變性20s，55 ℃退火20s，72 ℃延伸20s,40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸1min.取5μL的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，天能Tanon2500R全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照與半定量表達(dá)分析.

1.2.5性腺組織學(xué)分析在取樣的過程中，除了液氮保存的樣本之外，還取一部分性腺組織于波恩氏液中固定過夜，經(jīng)脫水、透明和石蠟包埋之后，進(jìn)行組織超薄切片及蘇木素-伊紅染色.普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照.

1.2.6熒光定量PCR構(gòu)建斜帶石斑魚gFZD4和18srRNA基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品，將質(zhì)粒按10倍的梯隊(duì)逐級稀釋，建立質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線.按照SYBR?GreenRealtimePCRMasterMix(TOYOBO,Japan)試劑盒說明書反應(yīng)體系、用RocheLightCycler480realtimePCRsystem進(jìn)行熒光定量PCR；循環(huán)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1min， 95 ℃變性5s，55 ℃退火10s，72 ℃延伸20s，84 ℃收集熒光10s，40個(gè)循環(huán).每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線相對應(yīng)的域值(Cp)獲得cDNA拷貝數(shù).數(shù)據(jù)采用SPSS1.8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2結(jié)果

2.1斜帶石斑魚FZD4 基因的全長cDNA序列斜帶石斑魚gFZD4的cDNA序列全長2 053bp，開放閱讀框(ORF)編碼多肽有531個(gè)氨基酸，其中5’端的26個(gè)氨基酸為信號肽(圖1).經(jīng)Expasytools預(yù)測，gFZD4基因編碼的前體蛋白分子量約為59.1kDa.用InterProScan對斜帶石斑魚gFZD4氨基酸序列進(jìn)行分析結(jié)果顯示，gFZD4屬于G蛋白偶聯(lián)型受體蛋白家族，該基因的幾個(gè)關(guān)鍵的蛋白功能結(jié)構(gòu)域在不同物種中具有高度的保守性：1)細(xì)胞外部分有一個(gè)富含半胱氨酸的N-末端(cysteinyl-richDomain，CRD)，半胱氨酸分別位于FZD4成熟肽的第10、18、55、64、71、82、86、93、110、123、146、165、169位；其后有8個(gè)跨膜螺旋的疏水部分.2)細(xì)胞內(nèi)部分包括由八次跨膜而形成的4個(gè)環(huán)(Loop1、Loop2、Loop3和Loop4)，保守的K-T-X-X-W結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C-末端.

信號肽用下劃線標(biāo)示，N-糖基化位點(diǎn)用“★”標(biāo)示，富集區(qū)的13個(gè)半胱氨酸用圓圈標(biāo)示，八個(gè)跨膜

斜帶石斑魚gFZD4氨基酸序列與已知的其他生物的FZD4序列進(jìn)行同源性分析顯示(圖2)，斜帶石斑魚gFZD4與羅非魚FZD4的氨基酸同源性最高、為95%，與斑馬魚FZD4的氨基酸同源性也高達(dá)80.8%，與其他哺乳類的FZD4的氨基酸序列同源性相對較低.

2.2斜帶石斑魚gFZD4的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析利用MEGA4.0 的鄰位相連算法(neighbor-joiningmethod)構(gòu)建斜帶石斑魚等動(dòng)物FZD基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果(圖3)顯示：魚類的FZD4基因聚類為獨(dú)立的分支，其中石斑魚的gFZD4基因與同為鱸型目的羅非魚的親緣關(guān)系最近，與牛和人類等哺乳動(dòng)物的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn).以斑馬魚的FZD亞型為參照分析表明FZD4與FZD9的進(jìn)化關(guān)系最近，而與FZD6 和FZD3的關(guān)系最遠(yuǎn).FZD4前體氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與傳統(tǒng)的動(dòng)物分類基本一致.

2.3斜帶石斑魚FZD4基因的組織表達(dá)差異性RT-PCR半定量的方法分析gFZD4在斜帶石斑魚全腦與外周組織(垂體、肝臟、卵巢、心臟、腎臟、脾臟、胃、腸、鰓和肌肉)的表達(dá)結(jié)果顯(圖4)示，gFZD4在腦、心臟、腎臟和鰓中mRNA的表達(dá)量很高，在垂體、卵巢、肝臟和脾臟中也有較高的表達(dá)水平，而在胃、腸和肌肉中沒有檢測到FZD4mRNA.

2.4斜帶石斑魚胚胎發(fā)育過程中g(shù)FZD4基因的表達(dá)模式熒光定量PCR分析斜帶石斑魚FZD4基因在胚胎發(fā)育不同時(shí)期的相對表達(dá)量結(jié)果(圖5)顯示，F(xiàn)ZD4的mRNA含量在不同的胚胎發(fā)育時(shí)期呈現(xiàn)顯著的差異性.從未受精卵開始，到受精卵、2-細(xì)胞期、4-細(xì)胞期、8-細(xì)胞期、多細(xì)胞期，F(xiàn)ZD4基因的表達(dá)量相近、且表達(dá)水平相對很低；gFZD4在囊胚期和肌節(jié)形成期表達(dá)水平很高，在其他發(fā)育時(shí)期維持在較高的表達(dá)水平.

2.5斜帶石斑魚性腺發(fā)育過程中g(shù)FZD4基因的表達(dá)根據(jù)石斑魚雌雄同體、先雌后雄的性腺發(fā)育特征， 結(jié)合本次樣本的性腺切片的組織學(xué)分析，可以將斜帶石斑魚卵巢發(fā)育時(shí)期及天然性逆轉(zhuǎn)時(shí)期分別表示為雌性早期、雌性中期、雌性晚期、兼性時(shí)期及雄性時(shí)期共5個(gè)代表性發(fā)育時(shí)期(圖6)：1)雌性早期——初級卵母細(xì)胞(primary-growthstageoocyte，O1)的卵巢時(shí)期，約為1齡；2)雌性中期——皮層小泡卵母細(xì)胞(cortical-alveolusstageoocyte，O2)的卵巢時(shí)期，約為2齡；3)雌性晚期——卵黃形成卵母細(xì)胞(vitellogenicstageoocyte，O3)的成熟卵巢時(shí)期，約為3齡；4)兼性時(shí)期——初級卵母細(xì)胞及精子細(xì)胞(spermatidcyst，SC)的性腺時(shí)期；5)雄性時(shí)期—精子(spermatozoa,SZ).

熒光定量PCR檢測這5個(gè)斜帶石斑魚性腺發(fā)育時(shí)期gFZD4基因的表達(dá)結(jié)果顯示，斜帶石斑魚gFZD4基因的mRNA在卵巢發(fā)育時(shí)期(即雌性早期至雌性晚期)的表達(dá)水平相對較低，在隨后的雌性向雄性變化的性逆轉(zhuǎn)過程中，表達(dá)水平顯著升高，而且雄性時(shí)期性腺中g(shù)FZD4基因的mRNA的水平也顯著高于兼性時(shí)期(圖7).

3討論

氨基酸序列比對分析表明，斜帶石斑魚gFZD4基因具有Frizzled家族成員保守的分子結(jié)構(gòu)和功能區(qū)[4], 顯示出較高的保守性.斜帶石斑魚gFZD4屬于G蛋白偶聯(lián)型受體蛋白家族，但具有8個(gè)疏水性的跨膜區(qū)，區(qū)別于傳統(tǒng)的7個(gè)跨膜區(qū)的膜蛋白.斜帶石斑魚gFZD4基因的胞內(nèi)部分均含有K-T-X-X-W和S/T-X-V結(jié)構(gòu)域[12]，其中K-T-X-X-W結(jié)構(gòu)域是FZD蛋白參與Wnt/β-Catenin經(jīng)典信號通路的特異結(jié)構(gòu)域[13]，而S/T-X-V結(jié)構(gòu)域能則與帶有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相互作用，介導(dǎo)Wnt非經(jīng)典信號通路[14].因此，斜帶石斑魚gFZD4基因同時(shí)具有介導(dǎo)Wnt信號通路的經(jīng)典與非經(jīng)典途徑，暗示其具有更廣泛的介導(dǎo)功能.

斜帶石斑魚gFZD4基因的mRNA在腦、腎臟、心臟和腮中的表達(dá)水平很高，在垂體、肝臟、卵巢和脾臟中也有較高水平的表達(dá)，但是在胃、腸和肌肉中沒有被檢測到，這與FZD4基因的mRNA在人類組織中的表達(dá)特征相類似[15].斜帶石斑魚gFZD4在與生殖調(diào)控相關(guān)組織中的高表達(dá)，表明FZD4基因在生殖調(diào)控中的保守功能[7-9].

斜帶石斑魚gFZD4基因mRNA的表達(dá)水平在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期存在顯著的差異性，在胚胎發(fā)育的早期表達(dá)量均較低，在囊胚期的表達(dá)量最高，這表明該基因參與了胚胎早期的發(fā)育，F(xiàn)ZD具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的不對稱分布和參與原腸胚形成的功能[16].斜帶石斑魚gFZD4在囊胚期之后均維持較高的表達(dá)水平，表明斜帶石斑魚gFZD4在此后的胚胎發(fā)育過程中持續(xù)發(fā)揮作用，但是其具體的功能目前尚不清楚.

斜帶石斑魚是雌雄同體、先雌后雄的重要經(jīng)濟(jì)海水魚類，其鮮明的性別轉(zhuǎn)換特性使其成為了研究性別調(diào)控機(jī)制的重要生物模型.哺乳類動(dòng)物的研究結(jié)果顯示，敲除FZD4基因時(shí)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的生殖缺陷和不育，表明FZD4在哺乳動(dòng)物的生殖調(diào)控中扮演了十分重要的角色.gFZD4在斜帶石斑魚性別轉(zhuǎn)換的過程中和雄性性腺中表達(dá)量很高，而在雌性性腺中表達(dá)量顯著較低，因而FZD4可能與雄性性腺的發(fā)育形成有關(guān).本研究的結(jié)果豐富了魚類Frizzled基因的相關(guān)知識，有助于后續(xù)闡明Wnt信號通路在魚類性別調(diào)控中的分子機(jī)理.

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收稿日期：2016-02-17

基金項(xiàng)目：廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)(A201408A06)；海南省科技合作專項(xiàng)(KJHZ2015-08); 海南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(20130119)；廣東省自然科學(xué)基金(2015A030313069)

作者簡介：陳華譜(1983-)，男，廣東湛江人，講師，研究方向：魚類生理與繁殖，E-mail:chpjwx@163.com 通信作者： 黃海(1974-)，男，海南三亞人，博士，研究員，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖，E-mail:huanghai74@126.com； 李廣麗(1967-)，女，吉林延邊人，博士，教授，研究方向：魚類生理，E-mail:guangli211@163.com

文章編號：1004-1729(2016)02-0177-08

中圖分類號：S 917.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2016.0027

Molecular Cloning and Expression Analysis of Frizzled 4 inOrange-spottedGrouper, Epinephelus coioides

Chen Huapu1,Hong Guang1,Deng Siping1,Zhu Chunhua1,Li Guangli1，Chen Yan2,Huang Hai2，Li Shuisheng3

(1.ZhanjiangCityStateKeyLaboratoryofMarineEcologyandEnvironment,FisheriesCollege,GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang524088,China; 2.HainanTropicalOceanUniversity,Sanya572022,China； 3.SchoolofLifeSciences,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510275,China)

Abstract：In the study, the rapid-amplification of cDNA ends (RACE) was used to isolate the cDNA sequences of Frizzled 4 (gFZD4) of orange-spotted grouper(Epinephelus coioides). The full length gFZD4 cDNA sequence is 2 033 bp. There are 1 596 bp nucleotides in the open reading frame (ORF), and which encodes a putative protein of 531 amino acids. Amino acid alignment analyses results showed that the gFZD4 amino acid sequence was relatively conserved in different vertebrates; according to the phylogenetic analysis, gFZD4 of E. coioides was more closely related to that of Tilapia nilotica L. The tissue distribution analysis by RT-PCR showed that the high expression of gFZD4 was observed in brain, kidney, heart and gill. The expression levels of the gFZD4 during the embryonic development were detected by quantitative real-time PCR analysis. The results showed that gFZD4 were lowly expressed during the early stage of embryonic development, reached the peak during blastula stage, and kept the moderate mRNA level during the subsequent embryonic stages. The expression of gFZD4 during the ovarian and natural sexual change processes were analyzed, the results indicated that the expression level of gFZD4 was low during the ovarian stages, and kept high transcription during the sex change process, which suggested that gFZD4 mediated Wnt pathway play the important roles in sex change of orange-spotted grouper.

Keywords：Epinephelus coioides; Frizzled 4; embryonic development; ovarian development; sex change