植物細胞固定化條件對海南粗榧細胞生產(chǎn)三尖杉酯堿的影響

潘亞華，蔣旋嫻，李永成

(海南大學(xué) 食品學(xué)院，海南 ?？?70228)

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植物細胞固定化條件對海南粗榧細胞生產(chǎn)三尖杉酯堿的影響

潘亞華，蔣旋嫻，李永成

(海南大學(xué) 食品學(xué)院，海南 ?？?70228)

摘要：為了研究海南粗榧細胞的固定化條件及其對細胞的生長和三尖杉酯堿合成的影響，本研究利用海藻酸鈉凝膠包埋法對海南粗榧懸浮細胞進行固定化，并改變了其固定化條件，同時測定了生物量、PAL酶活性、凝膠球硬度、蔗糖含量和三尖杉酯堿產(chǎn)量等指標，結(jié)果顯示：海南粗榧固定化細胞的生長周期為40 d，其中，在0～15 d其細胞生長停滯，在15～30 d其細胞生長緩慢，而30～40 d為緩慢衰亡期；海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)的最佳產(chǎn)物提取時間為第15 d；包埋過程中CaCl2的最適質(zhì)量濃度為0.023 g/mL；鮮重細胞的最適接種量為10%.由此得出結(jié)論： 海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)抑制了細胞的生長，延長了細胞的生長周期，但縮短了細胞生產(chǎn)三尖杉酯堿的周期.

關(guān)鍵詞：海南粗榧； 固定化； 海藻酸鈉； 三尖杉酯堿

海南粗榧(CephalataxusmanniiHook.f.)，為三尖杉科(Cephalotaxaceae)，三尖杉屬(Cephalotaxus)植物，主產(chǎn)于海南.海南粗榧的根、莖、葉和果實中含有抗癌功效的生物堿，其中三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿已在臨床被廣泛應(yīng)用[1].但是，由于受到氣候、地理、季節(jié)等的影響，海南粗榧的生長較為緩慢，自然資源有限，因此，使用海南粗榧細胞培養(yǎng)技術(shù)是實現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿等產(chǎn)物的有效途徑.目前，陳林[2]等建立了海南粗榧懸浮細胞培養(yǎng)體系，獲得的產(chǎn)物產(chǎn)量為1.4mg/L；李永成[3-4]、龍曉娟[5]等通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)海南粗榧懸浮細胞來合成三尖杉酯堿等的研究也取得了一定的進展.然而，在海南粗榧細胞的懸浮培養(yǎng)中也存在一些問題，例如放大培養(yǎng)困難，細胞的生長速度慢以及在培養(yǎng)過程中不穩(wěn)定等.

就培養(yǎng)方式而言，植物細胞固定化是一種有前途的培養(yǎng)方式[6].它是通過提高單位重量細胞的生產(chǎn)率來提高三尖杉堿類的產(chǎn)量[7].與懸浮培養(yǎng)相比，植物細胞固定化培養(yǎng)具有很多優(yōu)點，如提高抗剪切能力、保持細胞活力、促進次級代謝產(chǎn)物的合成與分泌[8]、可重復(fù)使用并能提高生產(chǎn)效率、易于生產(chǎn)后處理等[9].如今，國內(nèi)外研究者已建立了包括銀杏、長春花、紅豆杉等藥用植物在內(nèi)的50余種植物細胞的固定化培養(yǎng)系統(tǒng).Gillet等[10]通過煙草組織固定化培養(yǎng)來生產(chǎn)東莨菪苷的研究發(fā)現(xiàn)，煙草細胞固定化培養(yǎng)比懸浮培養(yǎng)的產(chǎn)量更高.目前，還未見有關(guān)通過海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)來生產(chǎn)三尖杉酯堿類生物堿的報道.為此，本研究以工業(yè)化生產(chǎn)三尖杉酯堿為目標，嘗試了將海南粗榧細胞的固定化培養(yǎng)作為生產(chǎn)次生代謝物的新途徑.本試驗采用植物細胞固定化法來培養(yǎng)海南粗榧細胞，并主要探討了海南粗榧細胞的固定化方法、條件以及其對細胞的生長與次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)周期的影響，旨在為進一步的擴大培養(yǎng)提供理論與技術(shù)基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1植物材料將王成韜誘導(dǎo)[11]的、實驗室繼代培養(yǎng)的海南粗榧愈傷組織均勻分散在改良的MS液體培養(yǎng)基中，并按陳林的方法[2]進行培養(yǎng)來獲得海南粗榧懸浮細胞，最終選用繼代3次以上的海南粗榧懸浮細胞系來進行試驗和研究.

1.2海南粗榧細胞固定化凝膠珠的制備取一定質(zhì)量(鮮重)的海南粗榧細胞與質(zhì)量濃度為20g·L-1的無菌海藻酸鈉溶液混勻，用滴管吸取海藻酸鈉-海南粗榧細胞混合液，并將其一滴一滴地均勻滴入無菌CaCl2溶液中，靜置30～60min后，將其制成直徑為4～5mm的均勻包埋有海南粗榧細胞的固定化凝膠珠.最后，用無菌新鮮液體培養(yǎng)基沖洗固定化凝膠珠2次，待用[12].

1.3海南粗榧細胞固定化凝膠珠的培養(yǎng)方法在無菌條件下，將洗滌干凈的海南粗榧細胞固定化凝膠珠轉(zhuǎn)入改良的MS培養(yǎng)基中，搖瓶振蕩，并進行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為120r·min-1.

1.4產(chǎn)物提取海南粗榧固定化細胞胞外三尖杉酯堿的提取：將海南粗榧固定化細胞培養(yǎng)液抽濾，用氨水將濾液pH調(diào)至8.0，并用與濾液等體積的三氯甲烷萃取3次，接著，將三氯甲烷提取液于45 ℃下真空濃縮，直至完全蒸干，再用1mL色譜級甲醇復(fù)溶，在過孔徑為0.22μm的濾膜后，待測.

海南粗榧細胞固定化凝膠球及細胞內(nèi)三尖杉酯類堿的提取：將海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)液抽濾，將包埋有海南粗榧細胞的海藻酸鈣凝膠球混合石英砂，待研磨至糊狀后加入三氯甲烷60mL，在超聲30min后浸提12h，然后抽濾，并于45 ℃下將濾液濃縮，直至三氯甲烷完全蒸干，再用1mL色譜級甲醇復(fù)溶，在使用孔徑為0.22μm的濾膜過濾后，待測.

采用高效液相色譜法分析三尖杉酯類堿量，測定條件與李永成設(shè)定的方法[3]一致.采用Agilent1200高效液相色譜儀，條件為：色譜柱為XDB-C18柱(50mm×4.6mm×10μm)；流動相配比為V0.02mol·L-1乙醇銨∶V甲醇=55 ∶45；柱溫為25 ℃；檢測波長為288nm；進樣量為10μL；流速為0.8mL·min-1.

1.5指標測定生長曲線的測定按萬曉琦等的方法[13]進行.將海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)后，每隔5天取大小相同的固定化細胞凝膠球15粒，將凝膠球放入0.1mol·L-1，pH=7.8的磷酸緩沖液中振蕩，待凝膠球破碎溶解后過濾，過濾后的殘渣即為海南粗榧的鮮重細胞，并依據(jù)細胞鮮重的測定結(jié)果繪制海南粗榧的生長曲線.

培養(yǎng)基含糖量的測定按李永成所采用的苯酚硫酸法[14]進行.

苯丙氨酸解氨酶(PAL酶)活性的測定[3].將海南粗榧細胞固定化凝膠球與50mmol·L-1pH8.8的Tris-HCl緩沖液(包含15mmol·L-1的β-硫基乙醇)均勻混合，冰浴研磨，將研磨液在10 000r·min-1和4 ℃下離心30min，收集上清液得PAL酶粗提液.將10mmol·L-1的L-苯丙氨酸、0.4mL的蒸餾水、PAL酶粗提液混合，在30 ℃下反應(yīng)30min[15]，然后添加0.1mL6mol·L-1的HCl來終止反應(yīng).在290nm波長處測定反應(yīng)產(chǎn)物吸光度，并以每小時OD值在290nm處變化0.01為一個單位.

培養(yǎng)基游離Ca2+濃度的測定：使用Sigma鈣離子檢測試劑盒(CalciumColorimetricAssay)，并參照說明書中的測定方法進行.分別將10μL樣品和10μL蒸餾水(空白調(diào)零組)加入到含有96孔板的管槽中，加入蒸餾水至50μL，滴加90μL顯色劑和60μL的測定緩沖液到管槽中，混合均勻.在室溫避光條件下使其反應(yīng)5～10min，然后將反應(yīng)后的混合液在波長575nm處測定吸光度，將吸光度值代入鈣離子標準曲線中的到培養(yǎng)基中鈣離子濃度.

凝膠球硬度的測定參考王秀娟[16]改進后的方法.使用CT3型質(zhì)構(gòu)儀對海藻酸鈣凝膠球進行TRA質(zhì)構(gòu)分析，測定條件：探頭為TA-39(直徑為2mm)平底柱型探頭；測試速度為0.5mm·s-1;觸發(fā)點負載為5g；行變量30%.

1.6數(shù)據(jù)處理本試驗數(shù)據(jù)為3個平行實驗的平均數(shù)，數(shù)據(jù)以±s表示，同時利用Origin8.0和SigmaPlot12.5進行繪圖，P<0.05視為差異顯著.

2結(jié)果與分析

2.1粗榧細胞固定化培養(yǎng)過程中的細胞生長曲線圖1和圖2分別為海南粗榧懸浮細胞固定化培養(yǎng)過程中的生物量變化及其培養(yǎng)基蔗糖的消耗變化，其接種量為10%.從圖1可見，海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)周期約為40d：初期其細胞生長停滯；15d后固定化細胞進入生長對數(shù)期，生物量增加，細胞緩慢生長；至30d左右生物量不再增加，細胞褐化嚴重.從圖2可見，在海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)的初期，培養(yǎng)基糖耗很慢，說明海南粗榧固定化細胞剛進入調(diào)整期，并逐漸適應(yīng)固定化環(huán)境，糖代謝緩慢，細胞生長停滯；在培養(yǎng)的第25～30 天，糖耗速度加快，表明此時固定化細胞緩慢生長；固定化培養(yǎng)的末期，由于培養(yǎng)基中蔗糖和其他營養(yǎng)物質(zhì)的減少而導(dǎo)致細胞開始減少，糖耗速度變緩.但是，從培養(yǎng)40d的海南粗榧固定化細胞中提取培養(yǎng)物后并沒有發(fā)現(xiàn)三尖杉酯堿.由此推測，海南粗榧固定化細胞的生長周期與次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)周期不一致，因此，有必要研究海南粗榧固定化細胞合成三尖杉酯堿的代謝周期.

2.2海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)的最佳生產(chǎn)周期及其PAL酶活性的變化圖3為固定化海南粗榧細胞合成三尖杉酯堿周期的研究結(jié)果.由圖3可見，隨著固定化海南粗榧細胞的培養(yǎng)時間增加所獲得的三尖杉酯堿的量先增加后減少，在培養(yǎng)的第15d獲得最大產(chǎn)量(2.018mg/L).因此，粗榧細胞固定化培養(yǎng)的產(chǎn)物最佳收獲時間是第15d.圖4為海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)過程中的苯丙氨酸解氨酶(PAL酶)的活性變化.從圖4可見，海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)前期的PAL酶活性相對較高，但隨著細胞的繼續(xù)培養(yǎng)，其PAL酶活性下降，且在培養(yǎng)后期其活性處于該水平.

2.3包埋過程中CaCl2濃度對海南粗榧固定化細胞生產(chǎn)三尖杉酯堿的影響圖5和圖6分別為固定化包埋過程中不同濃度的CaCl2溶液對培養(yǎng)基中游離Ca2+濃度以及凝膠球硬度的影響.由圖5可見，在海藻酸鈉-海南粗榧細胞混合液中滴入不同濃度的CaCl2溶液后，所形成的凝膠球被充分洗滌2次后，其對培養(yǎng)基中游離鈣離子質(zhì)量濃度的影響不顯著；當CaCl2質(zhì)量濃度>0.031g·mL-1時，海南粗榧固定化細胞培養(yǎng)5d后全部褐化死亡；當CaCl2質(zhì)量濃度在0.015～0.031g·mL-1時，如圖6所示，凝膠球硬度隨CaCl2質(zhì)量濃度的升高會不斷增強.取不同質(zhì)量濃度的CaCl2溶液進行固定化包埋后，所制成的海南粗榧固定化細胞凝膠球經(jīng)培養(yǎng)后生產(chǎn)三尖杉酯堿的情況如圖7所示，當CaCl2質(zhì)量濃度為0.023g·mL-1時，海南粗榧固定化細胞所生產(chǎn)的三尖杉酯堿的產(chǎn)量最高.

2.4細胞接種量對海南粗榧固定化細胞生長和其生產(chǎn)三尖杉酯堿的影響 由圖8表明，在海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)的過程中，隨著接種量的增加三尖杉酯堿的產(chǎn)量先增加后減少，接種量為10%時可獲得最大產(chǎn)物產(chǎn)量；接種量為12%時比接種量為8%時所獲得的產(chǎn)物產(chǎn)量要高.因此，利用海南粗榧固定化細胞生產(chǎn)三尖杉酯堿的最佳接種量為10%.圖9為不同接種量下培養(yǎng)基蔗糖含量的測定結(jié)果，圖9表明，隨著接種量的增加，細胞耗糖速率也隨之增加，但是，當接種量超過10%時糖耗速度反而減緩.

3討論

植物細胞固定化培養(yǎng)使細胞生長期延長，它使細胞在較長的時間內(nèi)保持了較高的活力[17].當接種量為6%時進行粗榧細胞的懸浮培養(yǎng)，此時可發(fā)現(xiàn)，懸浮細胞生長的0～10d為生長滯后期，培養(yǎng)的第10～25 天為對數(shù)生長期，第25～30d為穩(wěn)定期[2].與之相比，本試驗中所采用的固定化培養(yǎng)法使海南粗榧細胞的生長期延長了.細胞被固定化后，由于其周圍的生長環(huán)境較懸浮培養(yǎng)環(huán)境有了較大的不同，故細胞的生長周期以及代謝周期都發(fā)生了一定變化[18].采用植物細胞固定化法時，在包埋及培養(yǎng)過程中雖然細胞直接與固定劑接觸會對細胞產(chǎn)生一定的毒性作用，不利于細胞的生長，但是，這對于次生代謝物的合成是有利的[19].PAL酶存在于所有綠色植物中，它是次級代謝途徑的起始酶，也是初生代謝和次生代謝的紐帶.誘導(dǎo)植物細胞的防御反應(yīng)雖能夠促進細胞次級代謝產(chǎn)物的合成，但同時也會伴隨細胞的防御反應(yīng)，這同樣會引起PAL酶活性的變化[3].本研究的結(jié)果表明，在海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)的過程中細胞的生長周期(40d)與次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)周期不一致，其合成三尖杉酯堿的總量在固定化法培養(yǎng)15d左右達到最高(2.018mg·L-1)，與之相比，陳林[2]等要在海南粗榧細胞懸浮培養(yǎng)的第25 天才能獲得產(chǎn)物的最大產(chǎn)量(1.4mg·L-1)；細胞固定化培養(yǎng)的第15 天以后，三尖杉酯堿量不斷減少，至海南粗榧固定化細胞生長的末期已檢測不到三尖杉酯堿.可見，海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)不僅提高了產(chǎn)物的產(chǎn)量，而且還縮短了生產(chǎn)周期，提高了生產(chǎn)效率.在海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)的過程中，其PAL酶的活性由高降低，這可能是由于在海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)的初期，海南粗榧細胞受到固定化條件的脅迫作用而引起細胞的防御反應(yīng)，從而致使細胞生長緩慢并導(dǎo)致了其PAL酶的活性較高，但同時也促進了細胞合成三尖杉酯堿.隨后，由于細胞逐漸適應(yīng)了固定化培養(yǎng)環(huán)境而進入對數(shù)生長期，此時由于PAL酶的活性有所降低，因而細胞合成三尖杉酯堿的量逐漸減少.但是，在海南粗榧固定化細胞生長的末期，為何細胞內(nèi)外三尖杉酯堿的含量會不斷減少，目前對這一現(xiàn)象的代謝機制尚不清楚.

在植物細胞的代謝過程中，鈣離子作為高等植物細胞內(nèi)普遍存在的一種信使分子，它參與并調(diào)節(jié)了植物細胞的多種生理反應(yīng)[20].但是，過多的Ca2+也會對植物細胞產(chǎn)生毒性刺激，從而對細胞的生長代謝產(chǎn)生影響；此外，在固定化過程中由于氯化鈣質(zhì)量濃度的不同也會導(dǎo)致海藻酸鈣凝膠球硬度的不同[7]，從而造成細胞的機械脅迫情況不同.本試驗研究了海南粗榧細胞固定化包埋過程中不同CaCl2質(zhì)量濃度對固定化細胞代謝的影響，結(jié)果表明，海南粗榧細胞固定化所形成的凝膠球被充分洗滌后不會影響培養(yǎng)基中的游離Ca2+濃度，從而排除了培養(yǎng)基中的游離Ca2+質(zhì)量濃度的變化對細胞代謝的誘導(dǎo)作用.因此，用不同質(zhì)量濃度的CaCl2溶液作固定劑所造成的海藻酸鈣凝膠球硬度的不同是影響固定化細胞代謝的主要因素，由結(jié)果可見，當凝膠球達到一定的硬度時會促進細胞合成三尖杉酯堿，但當凝膠球硬度過高時細胞合成三尖杉酯堿的量則會降低.

由于在植物細胞固定化培養(yǎng)中可通過提高單位重量細胞的生產(chǎn)率來提高產(chǎn)量[9]，因此，在海南粗榧細胞固定化培養(yǎng)的工藝條件中也可通過提高海南粗榧細胞的接種量來提高三尖杉酯堿的產(chǎn)量，這也是一種較直接的途徑，但是由于營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的限制，過高的接種量并不會再提高產(chǎn)物的產(chǎn)量，相反，由于細胞生長代謝受到抑制后反而會降低產(chǎn)物產(chǎn)量.本試驗的結(jié)果表明，當接種量達到10%時，海南粗榧固定化細胞消耗基質(zhì)中蔗糖的速率以及合成三尖杉酯堿的總量均已達到最大.

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收稿日期：2015-11-26

基金項目：國家自然科學(xué)基金(NO.21166007)

作者簡介：潘亞華(1990-)，男，河北景縣人，海南大學(xué)食品學(xué)院2013級碩士研究生，E-mail:1203737023@qq.com 通信作者： 李永成(1964-)，男，苗族，海南?？谌?，博士，副教授，研究方向：生化工程，E-mail: lyc2360@sina.com

文章編號：1004-1729(2016)02-0155-07

中圖分類號：Q 831.1

文獻標志碼：ADOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2016.0024

Effects of the Conditions for Immobilized Cell of Plant on theHarringonineProductionofCephalotaxus manniiImmobilizedCells

Pan Yahua, Jiang Xuanxian, Li Yongcheng

(CollegeofFoodScience,HainanUniversity,Haikou570228,China)

Abstract：In the study, to study the conditions for immobilizing cell of Cephalotaxus mannii and its effects on the growth and harringtonine synthesis of C. manni, the sodium alginate embedding method was performed to immobilize C. mannii, the immobilized conditions were changed, and biomass, the activity of phenylalanine ammonium-lyse, the hardness of gel beads, sucrose content, and the production of harringtonine were determined. The results indicated that the growth cycle of the immobilized cell of C. mannii was 40d, the lag period of growth was during 0-15d, the slow growing time was during 15-30th days, and the stable phase was during 30-40d; the culture conditions of the immobilized cell of C.mannii was optimized as followed: the optimal time point to extract the product of C. mannii was the 15th day; the optimal concentration of CaCl2 was 0.023 g.mL-1; to obtain the maximum harringtonine production, the optimal fresh weight of C. mannii was 10%. The culture conditions for immobilizing cell of C. mannii inhibited the growth and extended the growth time of C. mannii cell, but this method shortened processing periods of the harringtonine.

Keywords：Cephalotaxus mannii； immobilized； sodium alginate； harringtonine