溫度對14株無乳鏈球菌溶血價的影響

蒙愛云, 周永燦, 胡文婷, 吳夢曉, 王世鋒, 謝珍玉, 郭偉良

(海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點實驗室，海南 ?？?570228)

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溫度對14株無乳鏈球菌溶血價的影響

蒙愛云, 周永燦, 胡文婷, 吳夢曉, 王世鋒, 謝珍玉, 郭偉良

(海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點實驗室，海南 ?？?570228)

摘要：為了研究溫度對無乳鏈球菌溶血價的影響，本文選擇了來自不同地區(qū)、不同宿主和不同血清型的14株無乳鏈球菌，以2倍梯度稀釋法分別測定了3個培養(yǎng)溫度(25 ℃、30 ℃和37 ℃)對各菌株溶血價的影響，并測定了37 ℃下靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)對各菌株溶血價的影響.結(jié)果表明，14株無乳鏈球菌的溶血價均顯著受培養(yǎng)溫度的影響，其中，有11株無乳鏈球菌的溶血價在37 ℃時最高、2株在25 ℃時最高、1株在30 ℃時最高，2015年分離自海南養(yǎng)殖場的5株羅非魚源無乳鏈球菌的溶血價均在高溫培養(yǎng)條件下較高.37 ℃下培養(yǎng)方式對無乳鏈球菌溶血價影響的研究結(jié)果表明，14株實驗菌株中有12株的溶血價受振蕩影響顯著，其中，有8株實驗菌株的溶血價在靜置培養(yǎng)時比振蕩培養(yǎng)時顯著升高、有4株實驗菌株的溶血價在振蕩培養(yǎng)時比靜置培養(yǎng)時顯著升高.

關(guān)鍵詞：無乳鏈球菌; 溶血價; 溫度

無乳鏈球菌(Streptococusagalactiae)為革蘭氏陽性菌，是唯一的B群特異性抗原鏈球菌(groupBstreptococcus，GBS).GBS可廣泛地感染宿主，是人、畜、魚共患的條件致病菌.GBS最初被確定為牛乳腺炎病原，之后因其能感染新生兒、嬰兒、婦女和老人等，并引起他們患腦膜炎、腦水腫、膿毒血癥和心內(nèi)膜炎等疾病而廣受關(guān)注[1-3]；19世紀80年代以來，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)GBS還是危害嚴重的水生動物的病原，它可廣泛感染淡、海水養(yǎng)殖動物，包括鯪魚、卵形鯧鲹、虎紋蛙、紅鰭東方純、石斑魚、美國紅魚和羅非魚等，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重危害[4-6].2009年以來，在我國各主要羅非魚養(yǎng)殖區(qū)，GBS感染引起的鏈球菌病發(fā)病率達95%以上，累積死亡率達30%～80%，為我國當前羅非魚養(yǎng)殖危害最嚴重的病害[7].已有研究表明，羅非魚鏈球菌病的發(fā)生與溫度密切相關(guān)，一般水溫在26 ℃以上的開始發(fā)病，水溫在30 ℃以上時病情加劇[8].近年來，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)在溫度對GBS的侵染力、毒力、毒力相關(guān)基因的表達量、粘附活性和溶血活性等的影響方面進行了研究[9-15].其中，β-溶血素屬于成孔毒素，可破壞細胞膜結(jié)構(gòu)和擾亂其功能，造成細胞溶解，引起敗血癥等癥狀.此外，其在浸染表皮和內(nèi)皮細胞以及激活宿主炎癥介質(zhì)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是GBS最重要的毒力因子之一[16-18].已有研究表明，GBS的β-溶血素基因(cylE基因)表達量隨溫度的升高而顯著上調(diào)[10,14]；但這些研究僅針對某個特定的分離菌株，據(jù)報道GBS在分子血清型和溶血特征等方面存在著多樣性[19-21].為了解溫度和培養(yǎng)方式對不同類型GBS溶血特性的影響，本文對14株不同地區(qū)、來源和血清型的GBS菌株在不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)方式下的溶血價進行了研究與分析，旨在了解GBS的溶血特性，并為防控GBS引起的疾病提供理論依據(jù).

1材料與方法

1.1實驗材料實驗用14株GBS菌株的來源、分離時間和地區(qū)等信息見表1，所有菌株接種于腦心浸液(BHI)液體培養(yǎng)基，于30 ℃下，以180r·min-1振蕩培養(yǎng)24h，加等體積φ=50%的無菌甘油，一份樣品于-80 ℃保藏，另一份樣品于-20 ℃保存，備用.

表 1　14株實驗GBS菌株的來源、分離時間和地點

主要試劑：腦心浸液培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)(37g·L-1)；SDS(北京Solarbio科技有限公司)、肝素鈉(北京Solarbio科技有限公司)(1 400U·mL-1).含氯化鈉(8.0g·L-1)和氯化鉀(0.2g·L-1)的0.01mmol·L-1的PBS(pH7.4)；0.2%G-PBS(4g·L-1葡萄糖+0.01mmol·L-1PBS).

主要儀器：PCR儀(2720ThermalCycle,AppliedBiosystems)、酶標儀(InfiniteF50,TECAN)、冷凍高速離心機(UNIVERSAL32R,Hettich)、恒溫恒濕培養(yǎng)箱(XMT-9017，重慶永生實驗儀器廠).

1.2實驗方法

1.2.1菌種鑒定按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》的生理生化實驗方法和16SrDNA方法對14株菌進行鑒定[22-23].

菌株莢膜多糖(cps)基因血清型分型[24-25]：采用TaKaRa細菌基因DNA試劑盒提取DNA，Ⅰa型引物序列為：Ⅰa-FGGTCAGACTGGATTAATGGTATGC，Ⅰa-RGTAGAAATAGCCT-ATATACGTTGAATGC；Ⅲ型鑒定引物序列為：Ⅲ-FTCCGTACTACAACAGACTCATCC，Ⅲ-RAGTAACCGTCCAT-ACATTCTATAAGC.50μL反應(yīng)體系PremixTaq酶25μL，模板DNA2μL，引物各2μL，無DNase/RNase水19μL.反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5min，94 ℃ 45s，58 ℃ 60s，72 ℃ 1min進行32個循環(huán)，最后72 ℃延伸10min.取5μL反應(yīng)液在10g·L-1的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，其余樣品送華大基因進行序列測序.

1.2.2羅非魚紅細胞懸液制備以吸取了適量肝素鈉(1 400U·mL-1)的2.5mL無菌注射器從羅非魚尾靜脈采血，血樣于4 ℃ 以3 000r·min-1離心5min，去上清，沉淀加入與血樣等體積的0.2%G-PBS，洗滌3次(至上清無紅色)，去上清，加入血樣16倍體積的0.2%G-PBS，配制成羅非魚紅細胞懸液.

1.2.3菌懸液制備(1)待測菌種子液制備-20 ℃保存的菌種經(jīng)BHI液體培養(yǎng)基活化后，按φ=1%的接種量接入新的BHI液體培養(yǎng)基，并于30 ℃靜置培養(yǎng)12h，離心，收集菌體，用生理鹽水制備OD620nm為0.68的待測菌種子液.

(2)菌懸液的制備將待測菌種子液按φ=5%的量接種于含6mLBHI液體培養(yǎng)基的15mL試管中，分成4組，分別于25 ℃，30 ℃和37 ℃靜置培養(yǎng)，并于37 ℃以 180r·min-1振蕩培養(yǎng)6h，每組3個平行，在4 ℃以 8 000r·min-1離心5min，用4 ℃預(yù)冷的0.01mmol·L-1的PBS洗滌2次，并以該PBS配制OD620nm為1.65的菌懸液.

1.2.4溶血價測定[10, 26]參照Gottschalk等[26]和Mereghetti等[10]的方法，以2倍梯度稀釋法測定溶血效價，具體如下：取96孔板，吸取300μL菌懸液于第一孔中，然后用0.01mmol·L-1PBS溶液以2倍梯度稀釋；再每孔加入150μL羅非魚血紅細胞懸液，于37 ℃孵育1h，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，于4 ℃以 3 000r·min-1離心10min，取200μL上清液至新的96孔板中，用酶標儀測520nm處的吸光度值，每塊96孔板分別設(shè)有陰性對照和陽性對照，陰性對照用150μL0.01mmol·L-1的PBS代替菌懸液，而陽性對照孔用0.1%的SDS溶液代替菌懸液，每個樣品平行測定3次，按照式(a)計算溶血率(Hemolysisrate，HR)：

(a)

以菌濃度為橫坐標，HR為縱坐標，采用OriginPro8.5.1SR2(OriginLabCorporation，美國)繪制散點圖，并采用OriginPro8.5.1SR2的Analysis中的NonlinearCurveFit工具對散點圖進行Logistic方程(式(b))擬合，獲得擬合方程，然后根據(jù)擬合方程計算半溶血率菌液濃度(EC50)，按式(c)計算溶血價(HemolysisTiter，HT).

y=B2+(B1-B2)/(1+(x/x0)p)，

(b)

式(b)中y為HR，x為菌液濃度，B1，B2，x0和p為常數(shù).

HT=1×109/EC50.

(c)

1.2.5統(tǒng)計分析采用OriginPro8.5.1SR2統(tǒng)計分析工具中的Tukey多重比較檢驗法，對同一菌株在不同培養(yǎng)溫度下的溶血價差異進行分析，并對所有菌株在不同培養(yǎng)溫度下的溶血價差異進行分析；此外，采用t檢驗方法對各菌株在靜置培養(yǎng)與振蕩培養(yǎng)下的溶血價差異進行分析.

2結(jié)果

2.1菌種的鑒定按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》對14株菌進行生理生化鑒定，結(jié)果顯示：14株菌的各項生理生化指標與GBS一致(結(jié)果略).以16SrDNA法對14株菌測序并在NCBI上比對和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示：14株菌均與無乳鏈球菌A909聚為一支，相似性達99%以上(結(jié)果略).

以各菌株的DNA提取液為模板，采用莢膜多糖(cps)基因血清型Ⅰa引物序列進行PCR擴增、電泳，結(jié)果表明(圖1)，只有菌株FWL1402和空白對照在521bp未出現(xiàn)特異性條帶，表明只有FWL1402不是Ⅰa型，其余菌株均為Ⅰa型.采用莢膜多糖(cps)基因血清型Ⅲ引物序列進行PCR擴增、電泳，結(jié)果表明(圖2)，只有FWL1402在1 826bp處出現(xiàn)特異性條帶，表明只有FWL1402為Ⅲ型菌株.

1泳道為DNAmarkerDL2000，2—5泳道依次分別為PBSA0901，PBSA0902，PBSA0903，PBSA0904菌株；6泳道為空白對照；7—16泳道依次分別為PBSA0905，PBSA0906，PBSA1401，PBSA1501，PBSA1502，PBSA1503，PBSA1504，PBSA1505，Hn1404，F(xiàn)WL1402菌株

圖1引物Ⅰa-F-Ⅰa-R鑒定Ⅰa型血清型

1泳道為DNAmarkerDL2000，2泳道為空白對照；3—16泳道依次分別為FWL1402，PBSA0901，PBSA0902，PBSA0903，PBSA0904，PBSA0905，PBSA0906，PBSA1401，PBSA1501，PBSA1502，PBSA1503，PBSA1504，PBSA1505，Hn1404菌株.

圖2引物Ⅲ-F-Ⅲ-R鑒定Ⅲ型血清型

2.2溶血價的測定PBSA1501菌體濃度與溶血率的相關(guān)圖及Logistic方程擬合的效果表明(圖3，其余菌株的相關(guān)圖和Logistic方程擬合的效果圖略)，隨著菌液濃度的升高，溶血率呈指數(shù)增加.采用Logistic方程擬合各菌株菌液濃度對溶血率的曲線，擬合相關(guān)系數(shù)(R2)均達到0.900 0以上，F(xiàn)檢驗顯示Prob>F值，且均小于0.05，表明Logistic方程的擬合結(jié)果準確可靠.

根據(jù)擬合的Logistic方程及EC50計算溶血價，其結(jié)果表明(圖 4)，菌株P(guān)BSA0901在37 ℃培養(yǎng)的溶血價最高，且其溶血價受培養(yǎng)溫度的影響顯著，在3個實驗溫度下，37 ℃培養(yǎng)時溶血價最高，30 ℃培養(yǎng)時溶血價最低.各菌株在不同溫度下的溶血價差異性是通過Tukey多重比較檢驗法來分析的，其結(jié)果表明，14株實驗菌株的溶血價均顯著受培養(yǎng)溫度影響，鳙魚源HN1404和羅非魚源PBSA0905在25 ℃培養(yǎng)時其溶血價最高，金鯧魚源PBSA1401則是在30 ℃培養(yǎng)時其溶血價最高，除此之外，其余菌株的溶血價均在37 ℃培養(yǎng)時最高.

37 ℃培養(yǎng)時，靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)對各菌株溶血價的影響的分析表明(圖5)，在所有14株實驗菌株中，只有PBSA1502和PBSA1504兩株菌的溶血價不受振蕩培養(yǎng)的影響，其余2株GBS菌株的溶血價均顯著受振蕩影響，其中有8株菌的溶血價在靜置培養(yǎng)時比振蕩時要顯著升高，而另外4株菌的溶血價則在振蕩培養(yǎng)時比在靜置培養(yǎng)時要顯著升高.

3討論

由無乳鏈球菌引發(fā)的水生動物疾病大多發(fā)生在高溫季節(jié)，其發(fā)生與溫度的變化密切相關(guān).Rodkhum[9]等的研究表明，高水溫時GBS的侵染力更強.FreitasLione[11]等研究了37 ℃和40 ℃時人源GBS對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的粘附和入侵能力的影響，其結(jié)果也表明，40 ℃時GBS粘附和入侵能力明顯更高.Mereghetti[10]等在研究30 ℃和40 ℃培養(yǎng)條件下人源GBS的轉(zhuǎn)錄組時發(fā)現(xiàn)，40 ℃培養(yǎng)時GBS的毒力相關(guān)基因的表達量顯著上調(diào)，說明溫度是影響GBS毒力的主要因素之一.目前已證實，GBS的主要毒力因子包括β-溶血素、溶血促進因子(CAMP因子)、莢膜多糖、粘連蛋白結(jié)合蛋白、菌毛、補體C5α肽酶、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、唾液酸酶、富色絲氨酸重復(fù)序列蛋白以及超氧化物歧化酶等.在GBS的致病過程中，溶血發(fā)揮著重要作用，而與溶血相關(guān)的毒力因子主要是β-溶血素和CAMP因子[27].劉志剛[14]等研究了溫度對羅非魚源無乳鏈球菌BSL2N#毒力的影響，其結(jié)果表明，該菌株β-溶血素和CAMP因子的基因表達量分別在34 ℃和37 ℃時達到最高；在37 ℃時，腹腔注射攻毒的致死率最高.本文研究了溫度對14株來自不同地區(qū)、不同宿主和不同血清型的GBS溶血價的影響，研究結(jié)果與羅志剛等[14]的研究結(jié)果相似，所有實驗菌株的溶血價均顯著受培養(yǎng)溫度影響，但不同菌株的溶血價受培養(yǎng)溫度的影響不同，78.6%的菌株(11株)在37 ℃時溶血價最高，14.3%的菌株(2株)在25 ℃時溶血價最高，7.1%的菌株(1株)在30 ℃時溶血價最高.

不同GBS菌株的溶血能力差別較大，且受溫度影響的表現(xiàn)也各不相同，它與宿主來源、分子血清型和采集區(qū)域均無明顯相關(guān)性.卵形鯧鲹源菌株P(guān)BSA1401在30 ℃時溶血價最高，鳙源菌株HN1404與羅非魚源菌株P(guān)BSA0905在25 ℃時溶血價最高，虎紋蛙源菌株FWL1404和10株羅非魚源菌株的溶血價在37 ℃時最高.血清型Ⅰa型作為無乳鏈球菌的主要流行性血清型，不同來源的13株菌株中有10株的溶血價在37 ℃時最高.本實驗中僅有的1株血清型Ⅲ菌株FWL1404(虎紋蛙源)，其溶血價在溫度較低時顯著增強.14株GBS菌株分離自海南省和廣東省，但其溶血特性無明顯的地區(qū)性差異.造成這種結(jié)果的原因可能與菌株致病力、適宜的生存環(huán)境以及對羅非魚血的敏感性不同等有關(guān).2015年從海南分離的5株羅非魚源GBS菌株的溶血能力均在高溫時較高，這與實際生產(chǎn)中溫度越高羅非魚鏈球菌病越易發(fā)病的現(xiàn)象相一致.

徐洋等[15]的研究結(jié)果表明，從海南分離獲得的羅非魚源無乳鏈球菌L4在THB肉湯培養(yǎng)基中于28 ℃靜置培養(yǎng)時的溶血價要高于振蕩培養(yǎng)時的溶血價.而本文有關(guān)振蕩培養(yǎng)對實驗菌株溶血價的影響的研究結(jié)果表明，振蕩培養(yǎng)對不同菌株溶血價的影響也存在較大差異，85.7%的菌株(12株)的溶血價在振蕩培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)時存在顯著差異，在有顯著差異的菌株中，66.7%的菌株(8株)的溶血價在靜置培養(yǎng)時要顯著高于振蕩培養(yǎng)時，僅33.3%的菌株(4株)的溶血價在振蕩培養(yǎng)時顯著高于靜置培養(yǎng)時.這表明不同類型GBS的溶血特性受培養(yǎng)方式的影響不同，其影響機制較為復(fù)雜，尚有待進一步的研究.

溶血作用是由穿孔毒素或理化因素造成的紅細胞破裂現(xiàn)象，是許多病原微生物致病力的重要組成部分，病原菌通過溶血作用可促進其進入宿主細胞，并在機體內(nèi)迅速傳播.為此，本文研究了來自不同地區(qū)、不同宿主和不同血清型的GBS菌株的溶血能力受溫度和培養(yǎng)方式影響的情況，旨在為了解環(huán)境對GBS致病力的影響.不過，GBS溶血作用的機理比較復(fù)雜，除β-溶血素和CAMP因子兩種毒力因子外，還有可能存在其他多種未知的共同參與調(diào)控的毒力因子[13].今后，為了更深入地了解溫度對GBS溶血作用的影響機制，需結(jié)合基因組和轉(zhuǎn)錄組等方法來進一步探討.

4結(jié)論

GBS具有廣泛的宿主，可對人、畜、魚造成嚴重危害，尤其是在高溫季節(jié)，它對羅非魚養(yǎng)殖造成了巨大的影響.本研究考察了來自不同地區(qū)、不同宿主和不同血清型的14株GBS在不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)方式下的溶血價變化.研究結(jié)果表明，所有GBS菌株的溶血價均顯著受培養(yǎng)溫度的影響，但不同菌株的溶血效價受培養(yǎng)溫度的影響存在一定差異，其中，大多數(shù)菌株在37 ℃培養(yǎng)條件下其溶血效價最高.本研究結(jié)果為了解環(huán)境對GBS致病力的影響以及防控GBS引起的水產(chǎn)疾病提供了參考依據(jù).

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收稿日期：2016-02-25

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31260644)；國家海洋公益性項目(201205025)；海南省自然科學(xué)基金(20153050)；農(nóng)業(yè)部漁用藥物創(chuàng)制重點實驗室開放課題(201408)

作者簡介：蒙愛云(1989-)，女，甘肅鎮(zhèn)原人，海南大學(xué)海洋學(xué)院2013級碩士研究生，E-mail: 1243156384@qq.com 通信作者： 郭偉良(1983-)，男，廣西貴港人，講師，博士，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖病害研究，E-mail: guowl07@mails.jlu.edu.cn

文章編號：1004-1729(2016)02-0170-07

中圖分類號：R 931.71

文獻標志碼：ADOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2016.0026

Effects of Culture Temperature on the Hemolysis Titerof14StrainsStreptococus agalactiaeIsolates

Meng Aiyun, Zhou Yongcan, Hu Wenting, Wu Mengxiao, Wang Shifeng, Xie Zhenyu, Guo Weiliang

(CollegeofMarinescience,KeyLaboratoryofTropicalAquaticBiotechnologyofHainanProvince,HainanUniversity,Haikou570228,China.)

Abstract：Temperature is one of the important environmental factors that influence the outbreak of streptococcosis in tilapia. In the study, to analyze the effects of culturing temperature on the hemolytic titer (HT) of Streptococcus agalactiae (GBS) isolates, fourteen S. agalactiae isolates from different regions, different hosts and different capsule polysaccharide serotype were selected, doubling dilution hemolytic test method was employed to determine the effects of three different temperatures (25 ℃, 30 ℃, and 37 ℃) culture conditions on the HT of the isolates, respectively, and the effects of static culture (37 ℃) and shaking culture (37 ℃) on the HT of the isolates were also determined. The results indicated that the HTs of 14 isolates were significantly affected by temperature; the HTs of 11 isolates had the highest values under 37 ℃ culture; the HTs of 2 isolates had the highest values under 25 ℃ culture; the HTs of 1 isolates had the highest values under 30 ℃ culture; All of five isolate in 2015 showed the same characteristics that HTs are increasing while the culturing temperature rise. The research results about the effects of culture conditions on the HT of the isolates suggested that twelve isolates were significantly affected by shaking culture conditions; the HTs of eight isolates under static culture(37 ℃) were higher than that under shaking culture of higher than shaking culture(37 ℃); the HTs of four isolates under shaking culture(37 ℃) were higher than that under static culture(37 ℃).

Keywords：Streptococus agalactiae; hemolytic titer; temperature