溶藻弧菌TssJ基因的原核表達及多克隆抗體制備

范雪亭，許　悅，孫　云，周永燦，王世鋒，謝珍玉

(海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點實驗室，海南 ?？?570228)

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溶藻弧菌TssJ基因的原核表達及多克隆抗體制備

范雪亭，許悅，孫云，周永燦，王世鋒，謝珍玉

(海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點實驗室，海南 海口 570228)

摘要：TssJ是溶藻弧菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)的一個重要基因.為了制備TssJ基因的多克隆抗體，以溶藻弧菌HN08155菌株的DNA為模板，擴增TssJ 基因后利用表達載體PET-32a(+)和大腸桿菌BL21(DE3)原核表達，分離純化后免疫大鼠獲得TssJ基因的多克隆抗體.結(jié)果顯示，37 ℃、IPTG終濃度1 mmol·L-1是較適宜的表達誘導(dǎo)條件，表達的融合蛋白是存在于細胞內(nèi)的包涵體，與預(yù)期的分子量42 kD一致，并且免疫大鼠后血清的多克隆抗體效價很高，為1 ∶32 768.制備的溶藻弧菌TssJ高效價多克隆抗體有助于進一步開展TssJ的定位和功能研究.

關(guān)鍵詞：溶藻弧菌；TssJ；原核表達；多克隆抗體

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)是一種廣泛分布的革蘭氏陰性桿菌，能夠?qū)е滤a(chǎn)動物弧菌病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1-2].Ⅵ型分泌系統(tǒng)(TypeⅥsecretionsystem,T6SS)是2006年在霍亂弧菌(V.cholerae)中發(fā)現(xiàn)的一種新的細菌分泌系統(tǒng)[3]，與生物膜形成、運動性、細胞毒性以及在吞噬細胞中的存活有關(guān)[4-5].近年來，人們對T6SS結(jié)構(gòu)進行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)它是由類噬菌體結(jié)構(gòu)和膜結(jié)構(gòu)兩部分組成.T6SS的膜結(jié)構(gòu)主要由TssJ、TssM、TssL和TagL四個亞基組成，形成一種類似于T3SS或者T4SS的跨膜環(huán)狀結(jié)構(gòu)[6-9]；其中TssJ是外膜脂蛋白，通過N末端?；陌腚装彼釟埢^定在外膜上[10-11].

雖然有研究認為TssJ在大腸桿菌(Escherichiacoli)的T6SS組裝中扮演了非常重要的角色[12]，但是TssJ的相關(guān)研究很少，而且主要集中于其蛋白結(jié)構(gòu)分析上，尚沒有該蛋白質(zhì)的具體生物學(xué)功能及其對T6SS影響的報道，也未見TssJ在溶藻弧菌中的作用的相關(guān)研究.為此，本研究克隆了溶藻弧菌的TssJ基因，在大腸桿菌中進行原核表達His-TssJ重組蛋白，并初步純化后制備了多克隆抗體，為后續(xù)研究該基因在溶藻弧菌中具體功能奠定了基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件溶藻弧菌HN08155、大腸桿菌DH5α與BL21(DE3)、載體質(zhì)粒pET-32a(+)均源自本實驗室.2216E培養(yǎng)基：1g酵母粉、5g胰蛋白胨、0.01g磷酸高鐵，加海水至1L(固體培養(yǎng)基加瓊脂17g-20g)；加入氨芐青霉素(Amp)至終濃度50μg·mL-1.用2216E培養(yǎng)基、30 ℃培養(yǎng)HN08155，大腸桿菌用LB培養(yǎng)基、37 ℃培養(yǎng).

1.1.2試劑克隆載體pEASYSimple-T購自TransgenBiotech公司，高保真DNA聚合酶Trans-Taq購自Tiangen公司，小量質(zhì)粒提取試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒均購自O(shè)MEGA公司，SmaⅠ限制性核酸內(nèi)切酶購自ThermoFisher公司，T4DNA連接酶、小牛堿性磷酸酶(CIP)、DNA與蛋白標準Marker均購自Takara公司，Ni-NTA瓊脂糖柱填料購自Qiagen公司，弗氏佐劑、弗氏不完全佐劑、HRP標記的羊抗大鼠IgG購自索萊寶公司，其他試劑均為分析純(A.R.).SPF級大鼠(雌性，～300g)購買自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心.引物合成及測序由華大基因(深圳)有限公司完成.

1.2實驗方法

1.2.1PCR引物設(shè)計與TssJ基因擴增根據(jù)本實驗室克隆的TssJ(原名為vasd)的序列，設(shè)計合成引物(F：5’-CCCGGGATGGACCCATATTCAGATTTAG-3’；R：5’-CCCGGGCTTTTACGACCAAAGACAGAT-3’；下劃線部分為SmaⅠ酶切位點).以溶藻弧菌HN08155的DNA作為模板，利用F和R引物擴增TssJ基因，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5min，95 ℃變性30s，60 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10min.PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳、觀察，將PCR樣品送至華大基因有限公司測序，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒的步驟回收測序驗證后的TssJ基因擴增產(chǎn)物.

1.2.2原核表達載體pET32a-TssJ的構(gòu)建與檢測回收產(chǎn)物和載體質(zhì)粒pET-32a分別用SmaⅠ酶切3h，其中載體質(zhì)粒pET-32a酶切后加1μLCIP酶、37 ℃孵育2h；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物并且回收目的片段.回收產(chǎn)物和酶切后的質(zhì)粒pET-32a在T4連接酶的作用下16 ℃連接16h，獲得重組質(zhì)粒pET32a-TssJ；隨后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，用R引物與pET-32a質(zhì)粒的上游引物P70進行PCR和測序驗證重組質(zhì)粒.

1.2.3重組蛋白的誘導(dǎo)表達和純化將鑒定正確的pET32a-TssJ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)，LB瓊脂平板培養(yǎng)24h后挑取單菌落接種于5mL含Amp(50μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜.按照1 ∶100的比例重新接種5mL含Amp(50μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基，在OD值0.6時加入IPTG誘導(dǎo)表達.誘導(dǎo)表達分兩組進行，其中一組在16 ℃誘導(dǎo)12h，另一組在37 ℃誘導(dǎo)8h，同時每組又采用1mmol·L-1和4mmol·L-1兩種IPTG終濃度分別誘導(dǎo)；兩組實驗中均以pET-32a載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)作為對照.隨后表達產(chǎn)物SDS-PAGE(12%分離膠)電泳檢測確定誘導(dǎo)表達的優(yōu)化條件.

大量培養(yǎng)(100mL)含有pET32a-TssJ重組質(zhì)粒的表達菌株BL21(DE3)，在優(yōu)化條件下誘導(dǎo)表達，離心收集細菌，加入4mLBufferB裂解2h，離心收集上清液.采用鎳柱純化上清液重組蛋白TssJ，SDS-PAGE凝膠電泳分析.

1.2.4重組蛋白多克隆抗體制備參考張寶存[13]的方法用純化的TssJ重組蛋白作為抗原免疫雌性SPF級大鼠制備多克隆抗體，具體如下：1)初次免疫，取 700μL純化的蛋白液(含重組蛋白約50ug)與相同體積的弗氏完全佐劑混合，用 1mL注射器反復(fù)推拉 30～60min，直至混合物呈粘稠乳狀、且取一滴加入水中不散開為止，將混好的乳液于大鼠背部脊椎兩側(cè)、前后各兩點作皮下注射、每點注射約250μL；2)初次增強免疫，初次免疫2周時取700μL純化的蛋白液與相同體積的弗氏不完全佐劑1∶1混合，混合和注射方法同初次免疫；3)二次增強免疫，初次免疫3周時按初次增強免疫方法重復(fù)增強免疫一次.二次增強免疫1周后收集大鼠的抗體血清，分裝成每管50μL，-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.5抗體效價的測定采用間接ELISA測定免疫大鼠血清的抗體效價，方法參照朱叢睿等[14].將純化的TssJ重組蛋白稀釋為2μg·mL-1，每孔100μL將稀釋重組蛋白加入96孔板，37 ℃孵育3h后每孔加入300μL封閉液，37 ℃再孵育2h后每孔加入100μL不同稀釋濃度的免疫大鼠血清(每個稀釋濃度3個重復(fù))，37 ℃孵育30min；充分洗滌后加入100μL二抗(1 ∶4 000稀釋的HRP標記的羊抗大鼠IgG)，37 ℃孵育30min再一次洗滌干凈后加入50μL底物A和50μL底物B，37 ℃反應(yīng)10min后加入終止液終止反應(yīng)，最后用酶標儀讀取OD450的值，計算多克隆抗體的效價.

2結(jié)果

2.1TssJ基因擴增以溶藻弧菌HN08155菌株的DNA為模板進行PCR，擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示有一條約450bp的亮帶，與預(yù)期大小(453bp)相近(圖1).進一步的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，該序列與已知TssJ基因序列完全一致(NCBIID：JX880396).

2.2TssJ基因表達載體構(gòu)建從重組連接載體轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)平板上挑取單克隆菌落，提取重組質(zhì)粒，采用載體上游序列對應(yīng)的引物P70和擴增TssJ基因的下游引物PCR擴增，瓊脂糖電泳檢測顯示擴增產(chǎn)物的大小約500bp，與預(yù)期的pET32a-TssJ重組載體的序列長度一致(圖2).進一步將重組質(zhì)粒進行測序結(jié)果顯示，該重組質(zhì)粒由pET32a載體和目的基因TssJ組成，且序列與目標序列相同.

2.3重組蛋白誘導(dǎo)表達和純化不同誘導(dǎo)溫度、不同IPTG濃度誘導(dǎo)TssJ基因表達后SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在37 ℃誘導(dǎo)時，培養(yǎng)液離心后的上清液中沒有檢測到新的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，但是在收集的細菌裂解后的上清液中可以檢測到約42kD的蛋白質(zhì)，其大小與預(yù)期的目的蛋白大小相同，并且在IPTG終濃度1mmol·L-1時誘導(dǎo)產(chǎn)物的濃度顯著高于IPTG終濃度4mmol·L-1時誘導(dǎo)產(chǎn)物的濃度；在16 ℃誘導(dǎo)時，無論IPTG的終濃度是1mmol·L-1還是4mmol·L-1均未檢測到目的蛋白(圖3).采用優(yōu)化后的適宜誘導(dǎo)條件37 ℃、IPTG終濃度4mmol·L-1進行大量誘導(dǎo)，誘導(dǎo)產(chǎn)物用鎳柱過柱純化后進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示純化產(chǎn)物與目標蛋白大小一致，重組蛋白純度高(圖4).

2.4多克隆抗體的效價純化后的TssJ基因誘導(dǎo)表達蛋白質(zhì)免疫大鼠后，間接ELISA方法檢測結(jié)果顯示，分離血清的效價為1 ∶32 768，該抗體具有較高效價.

3討論

T6SS參與細菌和細菌、細菌和宿主之間的相互作用，在細菌的存活和致病方面有重要的作用，因而自2006年發(fā)現(xiàn)開始就受到眾多學(xué)者的關(guān)注，相關(guān)研究主要集中于T6SS的元件組成、元件之間的相互作以及VgrG和HcP蛋白的功能.雖然已經(jīng)證實TssJ在大腸桿菌T6SS的組裝中起了十分重要的作用[12]，但是還未見其他細菌中關(guān)于TssJ功能等的研究.

pET-32a(+)表達載體分子量約26kD，可以編碼用于檢測和純化的His-Tag、S-Tag等[15-17]，目的蛋白與標簽蛋白形成融合蛋白，提高了表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性[18]，并可以利用融合蛋白的His標簽用鎳柱純化目的蛋白.本研究采用pET-32a(+)通過基因重組技術(shù)構(gòu)建了TssJ基因的原核表達載體pET32a-TssJ，對其進行誘導(dǎo)條件優(yōu)化的結(jié)果顯示，在16 ℃條件下沒有誘導(dǎo)產(chǎn)生目的蛋白，但是在37 ℃時可以誘導(dǎo)出目的蛋白，這一結(jié)果與溶藻弧菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)注射裝置蛋白VscO[19]、溶藻弧菌HY9901的轉(zhuǎn)運蛋白TolB[20]和血紅素結(jié)合蛋白HutB[21]的原核表達研究結(jié)果一致，可能的原因是誘導(dǎo)溫度影響大腸桿菌體內(nèi)各種代謝相關(guān)酶的活性，37 ℃是大腸桿菌的最適生長溫度，體內(nèi)酶的活性最大，而16 ℃顯著低于最適宜溫度.不同濃度IPTG誘導(dǎo)分析表明IPTG終濃度1mmol·L-1誘導(dǎo)比4mmol·L-1誘導(dǎo)時蛋白表達水平高，即IPTG的濃度升高時其表達量反而降低，過高的IPTG誘導(dǎo)濃度會抑制目的蛋白的表達[22].

將含有His標簽的融合表達蛋白經(jīng)過鎳柱層析純化后SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示獲得的目的蛋白純度較高，并且用純化的蛋白免疫大鼠獲得的多克隆抗體效價較高.陳春琳等[23]制備溶藻弧菌外膜蛋白OmpK多克隆抗體的效價為1 ∶1 600，劉祥[24]制備溶藻弧菌附著定值因子ACFA多克隆抗體的效價為1 ∶3 200，均低于本研究的溶藻弧菌TssJ基因的多克隆抗體效價.因此，本研究通過原核表達和純化獲得了含His標簽的TssJ基因的融合蛋白，免疫大鼠后得到了效價較高的TssJ基因多克隆抗體，為進一步開展該蛋白在溶藻弧菌中的功能和亞細胞定位等深入研究、揭示TssJ蛋白的結(jié)構(gòu)和功能等奠定了基礎(chǔ).

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收稿日期：2016-02-19

基金項目：國家自然科學(xué)基金(No. 41466002、31060360)；海南省重大科技項目(No. ZDZX2013014)

作者簡介：范雪亭(1989 -)，女，山東聊城人，海南大學(xué)海洋學(xué)院2013級碩士研究生 通信作者： 謝珍玉(1974 - )，男，江西吉水人，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖與病害控制，E-mail: xiezyscuta@163.com

文章編號：1004-1729(2016)02-0150-05

中圖分類號：Q78；S917.1

文獻標志碼：ADOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2016.0023

Prokaryotic Expression of the TssJ Gene from Vibrio alginolyticusandPreparationofthePolyclonalAntibody

Fan Xueting, Xu Yue, Sun Yun, Zhou Yongcan, Wang Shifeng, Xie Zhenyu

(CollegeofMarineScience,HainanUniversity,ExperimentalTeachingDemonstrationCenterofMarineBiology,KeyLaboratoryofTropicalAquaticBiotechnologyofHainanProvince,Haikou570228,China)

Abstract：TssJ is an important gene of the type VI secretion system (T6SS) in Vibrio alginolyticus. To prepare the polyclonal antibody against TssJ, TssJ gene was amplified from genomic DNA of V. alginolyticus HN08155 and cloned into pET-32a(+) vector. The recombinant plasmid, pET32a-TssJ, was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) for the expression. Then, the purified TssJ recombinant protein was used to immunize SPF rats for preparing polyclonal antibody. The results indicated that the optimization inducing condition in E. coli was at 37 ℃ with 1 mmol·L-1IPTG; the recombinant TssJ protein, with a molecular weight of 42 kD as expected, was mainly expressed in the inclusion body; the antibody titer of serum was very high, which was validated to be 1∶ 32 768 by ELISA. The polyclonal antibody is very helpful for the position location and functional description of TssJ in the future experiment.

Keywords：Vibrio alginolyticus; TssJ; prokaryotic expression; polyclonal antibody