氯丙嗪對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用*

曹勝男，邱　敏，楊世俊，江　帆，韋先明，徐東東，張　偉，王　娛，寧志豐，劉復(fù)興

(湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

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氯丙嗪對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用*

曹勝男，邱敏，楊世俊，江帆，韋先明，徐東東，張偉，王娛，寧志豐，劉復(fù)興**

(湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

摘要：目的 探索抗精神病藥物氯丙嗪對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用。方法 常規(guī)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，設(shè)置不同梯度的氯丙嗪藥物濃度，從生長(zhǎng)能力、克隆形成能力、遷移和侵襲能力來(lái)研究氯丙嗪對(duì)HepG2細(xì)胞的藥理作用。結(jié)果 不同藥物濃度下，HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)能力、克隆形成能力、遷移和侵襲能力隨著藥物濃度的增高呈遞減趨勢(shì)。結(jié)論 氯丙嗪對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有抑制作用。

關(guān)鍵詞：氯丙嗪；肝癌；HepG2細(xì)胞

肝癌是是世界上最常見的腫瘤之一，也是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。在我國(guó)，肝癌病死率占惡性腫瘤第二，且發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)[2]。此外，肝癌的惡性程度很高，肝癌患者的生存率也很低，所以當(dāng)前應(yīng)為肝癌的治療尋找新的手段。我們主要探索抗精神病藥物氯丙嗪對(duì)HepG2細(xì)胞的藥理作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞系來(lái)自于武漢大學(xué)中國(guó)培養(yǎng)物典藏中心。改良RPMI1640液體培養(yǎng)基( HyClone公司)，胎牛血清(FBS，HyClone公司),胰酶為Gibco公司產(chǎn)品，氯丙嗪(常州康普藥業(yè)有限公司)，Transwell小室(美國(guó)Corning公司)，6孔板(costar 公司)，96孔板(costar公司產(chǎn)品)，100×雙抗、結(jié)晶紫購(gòu)于天津索羅門生物科技公司，其他試劑為生化分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS和100U/mL 青霉素及100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)予以傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以5000個(gè)/孔接種于96孔板內(nèi)，100μL/孔，分為6組，每組6個(gè)平行復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)24h后，加含氯丙嗪的完全培養(yǎng)液(濃度0、5、10、20、40、80μM)，藥物作用72h后，每孔加MTT(5g/L)20μL,繼續(xù)孵育培養(yǎng)4h后，棄上清，每孔加入二甲基亞砜150μL，震蕩10min，結(jié)晶溶解充分，酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定OD值。

1.4平板克隆形成實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以每孔200個(gè)細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，設(shè)定藥物濃度(0、5、10、20、40μM)，常規(guī)培養(yǎng)14d，每3d換液一次。棄原培養(yǎng)液，PBS洗3次，甲醇常溫固定15min，0.1%結(jié)晶紫染色20min，流水清洗，晾干。顯微鏡下計(jì)數(shù)(含細(xì)胞50個(gè)以上克隆為陽(yáng)性克隆)，計(jì)算克隆形成率(克隆形成率=陽(yáng)性克隆數(shù)/種板細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.5遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)用RPMI1640無(wú)血清培養(yǎng)基1∶5稀釋matrigel膠包被小室上室，每孔60μL，37℃ 30min后，無(wú)血清培養(yǎng)基50μL/孔水化基底膜，37℃ 30min。胰酶消化細(xì)胞，離心，PBS洗2～3次，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸、混勻。細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，設(shè)置藥物濃度梯度，上室加細(xì)胞100μL/孔，下室加入500μL 10%完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48h,棄培養(yǎng)基，用棉簽小心擦去上室基質(zhì)膠，甲醇固定15min，PBS洗3次，0.1%結(jié)晶紫染色20min，PBS洗3次，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)微孔膜細(xì)胞，每個(gè)樣本10個(gè)視野計(jì)數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)同上法操作，不需包被上室。

2結(jié)果

2.1生長(zhǎng)能力隨著藥物濃度的遞增，HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)能力呈遞減趨勢(shì)，見圖1。

圖1　不同氯丙嗪藥物濃度下的HepG2生存能力

2.2平板克隆形成能力隨著藥物濃度的增高，HepG2細(xì)胞的克隆形成能力減弱，不同濃度(0、5、10、20、40μM)氯丙嗪所對(duì)應(yīng)的HepG2細(xì)胞的克隆形成率分別為(61.67±1.25)%、(56.67±0.62)%、(47.30±0.47)%、(2.50±0.41)%、(0.67±0.23)%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2(封二)。

2.3遷移和侵襲能力隨著藥物濃度的增大，細(xì)胞的遷移和侵襲能力都降低(P<0.05)，見圖3(封二)、圖4(封二)、表1。

表1　各組遷移和侵襲能力比較(個(gè),

注：各濃度組間兩兩比較，P<0.05

3討論

目前已用于腫瘤研究的抗精神病藥是甲硫噠嗪，甲硫噠嗪屬于吩噻嗪類藥物，它是一種強(qiáng)效的抗焦慮和抗精神病藥物，在晚期癌癥中，已用于治療癌癥相關(guān)的出汗[3]和抑郁[4]。此外，甲硫噠嗪具有抗腫瘤作用，具體表現(xiàn)是抗增殖和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，例如，它能促進(jìn)宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病、乳腺癌[5-7]等細(xì)胞的凋亡。而氯丙嗪與甲硫噠嗪同屬吩噻嗪抗精神病藥物，具有相同的藥理作用，還具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，故我們選擇氯丙嗪來(lái)研究它對(duì)肝癌細(xì)胞的作用。本實(shí)驗(yàn)中，采用MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、腫瘤遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氯丙嗪對(duì)HepG2細(xì)胞的藥理作用。結(jié)果顯示，在不同藥物濃度梯度下，肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力、克隆形成能力、遷移和侵襲能力均呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，尤其在80μmol/L時(shí)，肝癌細(xì)胞HepG2喪失生長(zhǎng)能力、克隆形成能力，但是似乎沒(méi)有完全抑制遷移和侵襲能力，提示氯丙嗪對(duì)肝癌HepG2的增殖生長(zhǎng)抑制能力強(qiáng)于對(duì)它的遷移和侵襲能力。Transwell遷移和侵襲能力在一定程度上反映了惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移能力，說(shuō)明氯丙嗪抑制肝癌轉(zhuǎn)移的作用弱于抑制增殖的作用，但是這只是個(gè)初步研究，還不能得出最終結(jié)論，由于腫瘤的增殖加速早于轉(zhuǎn)移，提示氯丙嗪更可能在肝癌早期階段起作用。按照《細(xì)胞培養(yǎng)》試驗(yàn)藥物濃度(μg/mL)=(mg 平均體表面積)/平均體重*100/6[8]來(lái)計(jì)算，中國(guó)成人男性平均身高167.1cm、體重66.2kg，女性成人平均升高155.8cm、體重57.3kg，氯丙嗪日閾劑量600mg,細(xì)胞試驗(yàn)藥物濃度最大應(yīng)為26.8μg/mL。而在本實(shí)驗(yàn)中，氯丙嗪藥物濃度為20μmol/L(14.2μg/mL)時(shí)，對(duì)肝癌細(xì)胞的作用已經(jīng)非常明顯，而在40μmol/L(28.4μg/mL)時(shí)，作用效果已非常顯著。此外，在本實(shí)驗(yàn)中所用氯丙嗪為片劑粉碎溶解過(guò)濾所得，其實(shí)際藥物濃度應(yīng)比理論藥物濃度偏低。這更說(shuō)明了氯丙嗪可能可用于肝癌的治療。

目前，甲硫噠嗪抑制腫瘤機(jī)制已有探究，例如Sokbom 等[9]通過(guò)實(shí)驗(yàn)等證明在宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌中，甲硫噠嗪能有效抑制(磷脂酰激醇3激酶)PI3-K-(蛋白激酶B)Akt-mTOR(哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白)細(xì)胞通路，PI3-K及Akt通過(guò)使mTOR磷酸化而使各種癌癥細(xì)胞凋亡,mTOR磷酸化，激活p70S6K,通過(guò)促使細(xì)胞周期進(jìn)展從而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、腫瘤生長(zhǎng)及血管生成。Mi Sun等[10]也發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中，甲硫噠嗪抑制卵巢癌的生長(zhǎng)也與PI3-K-Akt-mTOR通路有關(guān)。此外，Eleftherios等[11]研究證實(shí)多巴胺受體在腫瘤干細(xì)胞中高表達(dá)，而甲硫噠嗪能有選擇地作用于腫瘤干細(xì)胞而對(duì)人類正常干細(xì)胞無(wú)影響，原因在于甲硫噠嗪能作用于多巴胺受體，抑制多巴胺受體的表達(dá)，多巴胺受體表達(dá)下調(diào)，腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制故而發(fā)揮抗腫瘤作用。Daniel等[12]在彌散性巨型B細(xì)胞淋巴瘤實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)吩噻嗪類化合物在抑制抗凋亡基因NF-κB的同時(shí)，還能選擇性作用于彌散性巨型B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的MALT1(黏膜相關(guān)淋巴瘤易位基因)上，而MALT1是彌散性巨型B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生發(fā)展所必需的基因，故吩噻嗪類化合物能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與發(fā)展。因此，本實(shí)驗(yàn)下一步將對(duì)氯丙嗪抑制肝癌的機(jī)制進(jìn)行具體探究。

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Inhibitory Effect of Chlorpromazine on HepG2 Cells

CAO Sheng-nan，QIU Min，LIU Fu-xing，et al

(SchoolofBasicMedicine,HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

ABSTRACT：Objective To explore the inhibitory effect of chlorpromazine on liver cancer cell line HepG2. Methods HepG2 cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum,100 U/mL penicillin and 100 μg/mL streptomycin.Different concentrations of chlorpromazine were set to test the influence on the ability of proliferation,colony formation，mobility and invasion of HepG2.Results Chlorpromazine could inhibit the proliferation of HepG2,colony formation and the ability ofmobility and invasion in a concentration-dependent manner.Conclusion Chlorpromazine has inhibitory effect on liver cancer cell line HepG2.

KEY WORDS：Chlorpromazine;Liver cancer;HepG2 cell

*基金項(xiàng)目：湖北科技學(xué)院省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(201510927008)

中圖分類號(hào)：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-4646(2016)03-0185-03

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.03.0185

(收稿日期：2016-01-06)

**通訊作者，E-mail：liufx6505@126.com