氯丙嗪在不同種屬肝微粒體中代謝差異研究

董 凡，譚 敘，何 欣，謝 晴，譚 峰

(1.大連理工大學環(huán)境學院，工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點實驗室，遼寧 大連 116024；2.大連海關(guān)綜合技術(shù)服務中心，遼寧 大連 116001)

氯丙嗪(CPZ)又名冬眠靈，是一種吩噻嗪類藥物[1]，具有安神、鎮(zhèn)定的功效，常用來治療精神類疾病[2]，其在獸醫(yī)臨床上應用廣泛，一方面可以降低動物的死亡率，另一方面可以間接起到增加動物體質(zhì)量的作用[3]。氯丙嗪的過量使用容易引起白細胞減少和遲發(fā)性運動障礙等，危害生物健康[2]。氯丙嗪容易在生物體內(nèi)代謝，采用體外孵育肝微粒體的方法進行代謝研究，既可模擬藥物在體內(nèi)的代謝過程[4]，又可避免體內(nèi)復雜基質(zhì)對結(jié)果產(chǎn)生影響[5]，因此，研究肝微粒體體外孵育氯丙嗪的代謝對于指導臨床用藥具有重要意義。

氯丙嗪代謝產(chǎn)物種類多、含量低，對其分析檢測存在困難，常用的檢測方法有毛細管電泳安培法[6]、分光光度法[7]、高效液相色譜法[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-10]、酶聯(lián)免疫法[11-12]等，其中，液相色譜-質(zhì)譜法具有檢出限低、選擇性強等優(yōu)點[13]，已成為目前檢測氯丙嗪及其代謝產(chǎn)物的重要方法。

鼠是研究藥物代謝的常用動物；豬和雞作為代表性家畜，是人們?nèi)忸悢z取的主要來源。本研究擬選用鼠、豬、雞3種肝微粒體體外孵育氯丙嗪，計算氯丙嗪體外代謝半衰期和固有清除率，使用液相色譜-質(zhì)譜法推斷氯丙嗪可能的代謝產(chǎn)物，比較氯丙嗪在不同種屬之間的代謝速率和代謝途徑差異，為藥代動力學研究提供依據(jù)[14]。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent RPLC/6410B液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜：美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)；VM-02U型渦旋儀、小型水浴鍋：美國Crystal公司產(chǎn)品；BSA224S型電子天平：德國Sartorius公司產(chǎn)品；Smart-S15實驗室純水系統(tǒng)：上海和泰公司產(chǎn)品；離心機：上海安亭儀器廠產(chǎn)品。

1.2 主要試劑與材料

三羥甲基氨基甲烷：北京Solarbio公司產(chǎn)品；乙腈：色譜純，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；甲酸：色譜純，天津市科密歐公司產(chǎn)品；鼠、豬、雞肝微粒體：武漢普萊特生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品；還原輔酶Ⅱ四鈉鹽、鹽酸氯丙嗪：阿拉丁試劑有限公司產(chǎn)品。

1.3 溶液配制

鹽酸氯丙嗪儲備液的配制：稱取100.0 mg鹽酸氯丙嗪，用乙腈溶解并定容至10 mL，得到終濃度為10 g/L的儲備液，于-20 ℃避光保存。

Tris-HCl緩沖溶液的配制：稱取0.61 g Tris，用超純水溶解，HCl調(diào)至pH 7.4，最后定容至100 mL，得到終濃度為0.05 mol/L的儲備液。

NADPH溶液的配制：稱取0.084 4 g NADPH，用超純水溶解并定容至10 mL，得到終濃度為10 mmol/L的儲備液，于4 ℃避光保存。

1.4 實驗條件

1.4.1色譜條件 Waters C18色譜柱(100 mm×2.1 mm×3.5 μm)；柱溫40 ℃；進樣體積10 μL；流速0.25 mL/min；流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為乙腈溶液；氯丙嗪在不同種屬肝微粒體孵育體系中代謝速率的梯度洗脫條件：0～8 min(65%B)，8～15 min(20%B)；氯丙嗪在不同種屬肝微粒體孵育體系中代謝產(chǎn)物的梯度洗脫條件：1～15 min(5%B)，15～17 min(5%～90%B)，17～17.1 min(90%～5%B)，17.1～21 min(5%B)。

1.4.2質(zhì)譜條件 電噴霧正離子采集模式；霧化氣壓力0.31 MPa；干燥氣溫度250 ℃；干燥氣流速14 L/min；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速8 L/min；使用選擇離子掃描模式(SIM)研究氯丙嗪在不同種屬肝微粒體孵育體系中的代謝速率；使用全掃描模式(full scan)研究氯丙嗪在不同種屬肝微粒體孵育體系中的代謝產(chǎn)物。

1.5 實驗方法

分別用鼠、豬、雞3種肝微粒體對氯丙嗪進行體外孵育，孵育體系總體積為0.5 mL，含有0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液、0.5 g/L肝微粒體、10 mg/L氯丙嗪。孵育體系在37 ℃水浴孵育5 min后，加入50 μL 10 mmol/L的NADPH溶液啟動反應，設置0、20、60、120 min不同的反應時間，反應時間到達后，立即加入0.5 mL的4 ℃乙腈終止反應，以8 000 r/min離心15 min，取上清液，過0.22 μm微孔纖維素濾膜后，進行檢測分析。設置空白對照組，即不添加氯丙嗪，反應時間為120 min。

1.6 數(shù)據(jù)分析及相關(guān)計算公式

實驗采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定氯丙嗪的峰面積，將氯丙嗪在肝微粒體中反應0 min的峰面積A0作為100%，反應20、60、120 min的峰面積At與A0相比，得到氯丙嗪的剩余百分比；用剩余百分比的自然對數(shù)與時間做線性關(guān)系圖，得到斜率k；利用公式T1/2=0.693/(-k)，計算得到氯丙嗪在不同種屬肝微粒體中的半衰期T1/2；再根據(jù)公式CLint=[0.693/(T1/2)×孵育體系體積(mL)]/肝微粒體質(zhì)量(mg)，計算得到氯丙嗪在不同種屬肝微粒體中的固有清除率(CLint)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氯丙嗪在不同種屬肝微粒體中的代謝速率

氯丙嗪在鼠、豬、雞肝微粒體中的剩余百分比-時間關(guān)系曲線示于圖1?？梢钥闯觯缺涸诓煌N屬的肝微粒體孵育體系中的代謝速率差異較大。在豬肝微粒體孵育體系中代謝最快，反應120 min后，氯丙嗪僅剩余2.34%，接近代謝完全，而在鼠、雞肝微粒體孵育體系中代謝較慢，反應120 min后，氯丙嗪剩余百分比分別為59.94%和77.76%。氯丙嗪在鼠、豬、雞肝微粒體孵育體系中剩余百分比的自然對數(shù)(y)與時間(x)的線性回歸方程分別為y=-0.004x+4.601(R2=0.99)，y=-0.038x+4.343(R2=0.99)，y=-0.002x+4.565(R2=0.89)，計算得到體外代謝半衰期T1/2分別為173.3、18.2、346.5 min，CLint分別為8.0、76.2、4.0 μL/(min·mg)。

2.2 氯丙嗪在不同種屬肝微粒體孵育體系中體外代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

氯丙嗪在肝微粒孵育體系中孵育120 min后，與空白體系的譜圖對比，共發(fā)現(xiàn)了8種代謝產(chǎn)物(M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8)，氯丙嗪(M0)及8種代謝產(chǎn)物的信息列于表1，提取離子流圖示于圖2。根據(jù)氯丙嗪的結(jié)構(gòu)、代謝產(chǎn)物的信息，推斷代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和氯丙嗪的代謝途徑。

圖2 鼠(a)、豬(b)、雞(c)肝微粒體孵育體系中氯丙嗪及其代謝產(chǎn)物的提取離子流圖Fig.2 Extraction ion chromatograms of chlorpromazine and its metabolites in the liver microsome incubation systems of rat (a),pig (b) and chicken (c)

母體化合物氯丙嗪M0的保留時間為12.640 min，準分子離子峰[M+H]+為m/z319，經(jīng)碰撞裂解后，產(chǎn)生m/z274、246、214、86碎片離子。其中m/z274碎片離子是由氯丙嗪失去—HN(CH3)2形成的；m/z246碎片離子是由m/z274失去—CH2CH2形成；m/z214碎片離子比m/z246少32 u，由此推斷是失去—S形成的。氯丙嗪可能的碎裂結(jié)果示于圖3。

圖3 氯丙嗪可能的碎裂途徑Fig.3 Possible fragmentation pathways of chlorpromazine

氯丙嗪在體內(nèi)的代謝主要分為氧化、羥基化和去甲基化3種途徑。代謝產(chǎn)物M1、M4、M8的準分子離子峰[M+H]+均為m/z335，比氯丙嗪多16 u，推測是氯丙嗪羥基化或氧化產(chǎn)物。由氯丙嗪化學結(jié)構(gòu)可知，其容易在6β-、7β-位發(fā)生羥基化反應，在硫原子位置發(fā)生氧化反應。M4產(chǎn)生了m/z230的特征碎片離子，比氯丙嗪的m/z214碎片離子多16 u，表明苯環(huán)上發(fā)生了羥基化反應，因此推測M4是羥基化產(chǎn)物；對于產(chǎn)物M1和M8，僅憑二級質(zhì)譜圖無法確定是羥基化或氧化產(chǎn)物，因此推測M1、M4、M8可能是6-羥基氯丙嗪、7-羥基氯丙嗪、氯丙嗪亞砜。

代謝產(chǎn)物M2、M5的準分子離子峰[M+H]+均為m/z351，比氯丙嗪多32 u，產(chǎn)生的m/z262碎片離子比氯丙嗪的m/z246碎片離子多16 u，表明發(fā)生了羥基化或者氧化反應，但根據(jù)二級質(zhì)譜圖無法確定M2和M5是羥基化產(chǎn)物或氧化產(chǎn)物，因此M2和M5有6-羥基氯丙嗪亞砜、7-羥基氯丙嗪亞砜或6,7-二羥基氯丙嗪3種可能結(jié)構(gòu)。

代謝產(chǎn)物M7的準分子離子峰[M+H]+為m/z305，比氯丙嗪少14 u，推測是氯丙嗪失去1個亞甲基產(chǎn)生的。M7和氯丙嗪都含有m/z274、246碎片離子，而M7產(chǎn)生的m/z72碎片離子比氯丙嗪的m/z86碎片離子少14 u，表明是氯丙嗪側(cè)鏈失去1個亞甲基產(chǎn)生的，因此推測M7是去甲基氯丙嗪。

代謝產(chǎn)物M3的準分子離子峰[M+H]+為m/z321，比M7多16 u，產(chǎn)生了與M7相同的m/z72特征碎片離子，并且根據(jù)m/z230碎片離子，推測苯環(huán)上6β-、7β-位發(fā)生羥基化反應，因此推測M3是7-羥基去甲基氯丙嗪或6-羥基去甲基氯丙嗪。

代謝產(chǎn)物M6的準分子離子峰[M+H]+為m/z291，比M7少14 u，同樣產(chǎn)生與M7相同的m/z274、246碎片離子，表明M6是M7側(cè)鏈失去1個亞甲基產(chǎn)生的，因此推測M6是去二甲基氯丙嗪。

氯丙嗪在鼠、豬、雞肝微粒體孵育體系中分別產(chǎn)生5、7和4種代謝產(chǎn)物，由于不同物種體內(nèi)代謝酶的差異，代謝途徑有所不同，結(jié)果分別示于圖4、5、6。在3種肝微粒體孵育體系中，氯丙嗪在雞肝微粒體中的代謝途徑最簡單，在豬肝微粒體中最復雜。在雞肝微粒體中，氯丙嗪發(fā)生了3種不同類型的反應，分別是氧化反應生成氯丙嗪亞砜、去甲基反應生成去甲基氯丙嗪、羥基化反應生成6-羥基氯丙嗪和7-羥基氯丙嗪，這些反應在豬和鼠肝微粒體中均有發(fā)生。除此之外，在鼠肝微粒體中，去甲基氯丙嗪發(fā)生了去甲基反應生成了去二甲基氯丙嗪，在豬肝微粒體中生成了2個m/z351的代謝產(chǎn)物，由于憑借二級質(zhì)譜不能確定是羥基化或氧化產(chǎn)物，所以推測這2個產(chǎn)物為6-羥基氯丙嗪亞砜、7-羥基氯丙嗪亞砜或6，7-二羥基氯丙嗪。

圖4 氯丙嗪在鼠肝微粒體孵育系統(tǒng)中可能的代謝途徑Fig.4 Possible metabolic pathways of chlorpromazine in the rat liver microsome incubation systems

在不同種屬肝微粒體孵育體系中，氯丙嗪的代謝產(chǎn)物不僅種類不同，而且含量存在差異，對每個代謝物的提取離子流圖進行積分，結(jié)果示于圖7。根據(jù)剩余氯丙嗪的峰面積可以看出，氯丙嗪在豬肝微粒體孵育體系中的剩余量遠遠低于鼠、雞，表明豬孵育體系代謝能力最好。氯丙嗪在鼠和雞肝微粒體中的主要代謝產(chǎn)物相同，以M1、M4、M7為主，而在豬肝微粒體孵育體系中，主要代謝產(chǎn)物為M3、M5、M8。綜上所述，氯丙嗪在鼠和雞肝微粒體中代謝相似，以羥基化和去甲基化為主，而在豬肝微粒體中以氧化和羥基化為主。

圖5 氯丙嗪在豬肝微粒體孵育系統(tǒng)中可能的代謝途徑Fig.5 Possible metabolic pathways of chlorpromazine in the pig liver microsome incubation systems

圖6 氯丙嗪在雞肝微粒體孵育系統(tǒng)中可能的代謝途徑Fig.6 Possible metabolic pathways of chlorpromazine in the chicken liver microsome incubation systems

圖7 在鼠、豬、雞肝微粒體孵育體系中，氯丙嗪及其代謝產(chǎn)物的峰面積Fig.7 Peak areas of chlorpromazine and its metabolites in the rat,pig and chicken liver microsome incubation systems

3 結(jié)論

本研究利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定氯丙嗪在鼠、豬、雞肝微粒體孵育體系中的代謝速率和代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明，氯丙嗪在豬肝微粒體孵育體系中代謝最快，其次是鼠、雞。在3種肝微粒體孵育體系中共發(fā)現(xiàn)8種代謝產(chǎn)物，在鼠、豬和雞肝微粒體孵育體系中分別發(fā)現(xiàn)5、7和4種氯丙嗪代謝產(chǎn)物，其中3種肝微粒體孵育體系中均檢測出產(chǎn)物氯丙嗪亞砜、去甲基氯丙嗪、6-羥基氯丙嗪和7-羥基氯丙嗪。雖然不同種屬之間代謝產(chǎn)物的種類和含量存在差異，但氯丙嗪在3種肝微粒體孵育體系中都存在氧化反應、羥基化反應、去甲基反應，其中檢測到的6-羥基氯丙嗪、6-羥基氯丙嗪亞砜、7-羥基氯丙嗪亞砜和6，7-二羥基氯丙嗪尚未見文獻報道。