豬鏈球菌2型毒力因子與MLST分型分析

王楷宬，陳繼明，黃保續(xù)（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

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豬鏈球菌2型毒力因子與MLST分型分析

王楷宬，陳繼明，黃保續(xù)
（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

摘 要：為了解我國豬鏈球菌2型毒力因子和MLST型的特點，對四川、重慶和山東等地的22株豬鏈球菌2型進(jìn)行毒力因子檢測和ST型分析。結(jié)果顯示，78%（17/22）的分離株為sly+ mrp+ epf+基因型的強毒株，僅山東省的5株分離株為弱毒力型。四川省和重慶市89%（15/17）的分離株為毒力較強的ST7型，而山東省的分離株均為毒力稍弱的ST1型。結(jié)合這些地區(qū)的豬鏈球菌病發(fā)病情況，分析提示豬鏈球菌2型的毒力因子和ST分型與菌株的致病性有一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌2型；毒力因子；MLST

豬鏈球菌屬球菌科、鏈球菌屬，是1987年由Kilpper-Balz發(fā)現(xiàn)的一個新種［1］，能引起豬和其他家畜多種臨床疾病，早期按照莢膜抗原的差異可分為35個血清型（1～34、1/2）［2］；2005年，Nill等［3］從基因水平證實其中的32及34型為鼠口腔鏈球菌（Streptococcus orisratti）。在豬鏈球菌眾多血清型中，2型是人的最主要病原，致病性最強［4］。感染此血清型豬鏈球菌發(fā)病的潛伏期為幾小時至兩天［5］，當(dāng)其直接通過傷口感染血液時，其潛伏期會極短［6］。人感染豬鏈球菌多為散發(fā)，沒有明顯的季節(jié)性，但有報道稱在高溫高濕季節(jié)多發(fā)［7-10］。該病的死亡率為3%～26%［4-11］。

通過比較基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列、抑制差減雜交等方法，已發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌的毒力因子多達(dá)70多種，多數(shù)為細(xì)菌表面成分、表面蛋白、胞外蛋白、酶類、調(diào)控因子等，直接或間接參與黏附宿主細(xì)胞、體內(nèi)存活、免疫逃逸等［12］。分析豬鏈球菌的主要毒力因子，可進(jìn)一步了解毒株的分子特性和致病能力。

多位點序列分型（MLST）是由多位點酶電泳（MLEE）衍生出來的一種分型方法，通過分析多個管家基因（House-keeping gene）內(nèi)部片段的核酸序列，從而對菌株的等位基因進(jìn)行多樣性比較，并將每一組不同等位基因的排列組合作為一個RFLP型構(gòu)成等位基因圖譜（Alleles profi le），每個獨特的基因型就對應(yīng)了一個序列型（STs），并且通過比較ST可以發(fā)現(xiàn)菌株的相關(guān)性。

本文對我國不同年份發(fā)病豬分離的22株豬鏈球菌2型進(jìn)行毒力和MLST分析，以期了解我國豬鏈球菌2型的分子特性。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

本文分析的22株豬鏈球菌2型均分離自具有豬鏈球菌病發(fā)病特征的豬群，詳見表1。Taq DNA聚合酶、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000均為大連Ta-KaRa公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)與核酸提取

將豬鏈球菌菌株接種于含10% （v/v）綿羊血的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18 h左右，挑取單菌落接種THB液體培養(yǎng)基（BD公司，美國），37℃靜置培養(yǎng)過夜，取4 mL菌液，用Wizard Genomic DNA Purifi cation Kit（Promega），按說明書提取細(xì)菌的基因組DNA，并溶于滅菌超純水，-20℃保存。

1.3 毒力因子檢測

根據(jù)GenBank 中溶菌酶釋放蛋白（Muramidase-related protein，mrp）［10］、胞外蛋白（Extracellular protein factor，epf）、溶血素（Suilysin，sly）、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合 蛋 白（Fibronectin binding proteins，fbps）、orf 2毒力基因（orf 2）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gapdh）的基因各設(shè)計一對引物（表2），用PCR方法對豬鏈球菌2型分離株的6種毒力因子進(jìn)行檢測。本次所用于檢測mrp、epf的引物，可擴增不同大小的mrp、epf片斷，以顯示mrp、epf的變化。

1.4 MLST 分型

表1 菌株及其毒力因子檢測結(jié)果和MLST型

King等［13］最先建立了豬鏈球菌的MLST分析方法，對豬鏈球菌7個看家基因（cpn60、dpr、recA、aroA、thrA、gki、mutS）約350 bp的序列進(jìn)行測定，每個基因的序列如有1個或1個以上核苷酸的變異，便指定一個序列號。7個看家基因座的序列號構(gòu)成等位基因譜（STs）。有5個或5個以上相同基因座序列號的歸并入一個群系（lineages，ST complex），從而對豬鏈球菌進(jìn)行分型。合成擴增7個看家基因的引物（表2），按文獻(xiàn)［13］方法擴增并送上海生工生物有限公司進(jìn)行測序，測得的序列先通過NCBI進(jìn)行BLAST比對驗證，然后在線遞交到豬鏈球菌MLST數(shù)據(jù)庫（http：//ssuis.mlst.net）進(jìn)行分析，并從該數(shù)據(jù)庫中下載部分豬鏈球菌2型菌株的MLST分析結(jié)果，與本文中的菌株MLST檢測結(jié)果一起采用eBURST v3.0 顯示分析結(jié)果。

表2 引物列表

2 結(jié)果

2.1 毒力因子檢測

毒力因子譜分析發(fā)現(xiàn)，山東省分離的豬鏈球菌2型菌均缺失1～3個主要毒力因子，四川省和重慶市分離的菌株均有全部6種毒力因子。mrp、epf的擴增片段大小顯示，所有22株菌株的mrp和epf均為常規(guī)型，未檢測到mrp和epf的變型。檢測結(jié)果詳見表1。

2.2 MLST分型

22株豬鏈球菌2型菌中，四川省分離株均為ST7型；重慶市分離株中有2株為ST1型，其余均為ST7型；山東省分離株均為ST1型。詳見表1。圖1顯示了豬鏈球菌2型的主要ST型的親緣關(guān)系。

3 討論

2005年7月，四川省9個地級市26個縣（區(qū)）先后暴發(fā)豬鏈球菌病。在生豬發(fā)病死亡的同時，與病豬有密切接觸的人群感染豬鏈球菌的病例有206例，死亡38例［11］。自此次疫情發(fā)生以來，我國四川、廣東、廣西、江蘇、安徽等地都有豬感染豬鏈球菌的報道。

Wei Zigong等［14］，曾對2003—2007年在我國多個地區(qū)發(fā)病豬中分離的407株豬鏈球菌進(jìn)行特性分析，發(fā)現(xiàn)引起豬鏈球菌病的主要為2型（43.2%），感染菌株多數(shù)（54%）為sly+ mrp+ epf+基因型的強毒株。而健康豬感染的豬鏈球菌血清型復(fù)雜，毒力因子多變，2型不一定為優(yōu)勢血清型，且多數(shù)菌株為缺失重要毒力因子的弱毒株［15］。本文對分離的22株發(fā)病豬感染的豬鏈球菌2型進(jìn)行了毒力因子分析，結(jié)果與Wei Zigong 的報道一致，78%（17/22）的分離株為sly+ mrp+ epf+基因型的強毒株，僅山東省的5株分離株為弱毒力型。本文分析的菌株多數(shù)來源于四川和重慶。這兩個地區(qū)均高溫高濕，為豬鏈球菌病的高發(fā)地區(qū)，菌株均為sly+ mrp+ epf+基因型的強毒株?？梢?，山東省為豬鏈球菌病低發(fā)地區(qū)，可能與豬鏈球菌2型流行菌株為弱毒型有關(guān)。

ST型分析結(jié)果顯示，四川和重慶等地的分離株89%（15/17）為ST7型，與2005年引起四川省豬鏈球菌病的菌株屬于同一種ST型［16］。ST7型與ST1型相比有一個看家基因不同，ST7型的毒力比ST1型的毒力強。而山東省的分離株均為ST1型，屬于較ST7毒力稍弱的型。

本文的分析結(jié)果提示豬鏈球菌2型的毒力和ST型與菌株的致病性有一定的相關(guān)性。研究發(fā)病豬感染該菌的特性有利于了解不同地區(qū)流行菌株致病能力和疫情發(fā)生、發(fā)展趨勢，對豬鏈球菌病的有效防控具有重要意義。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Analysis of Virulence Factors and Multilocus Sequence Typing Scheme of Streptococcus Suis Serotype 2

Wang Kaicheng，Chen Jiming，Huang Baoxu
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Abstract：To understand the characterization of virulence factors and multilocus sequence typing scheme of Streptococcus suis serotype 2，22 Streptococcus suis serotype 2 isolates from Sichuan，Chongqing and Shandong were detected in the virulence factors and multilocus sequence typing scheme analysis.The results showed that 78%（17/22）isolates were high virulent with sly+ mrp+ epf+ genotype.Only 5 strains isolated from Shandong were low virulent.89% isolates from Sichuan and Chongqing were high virulent ST7 type，but the isolates from Shandong were all lower virulent ST1 type.Comprehensive analysis of the research results and the occurrence situation of swine streptococcsis showed that the virulence factors and multilocus sequence typing scheme were related to the pathogenicity of Streptococcus suis serotype 2.

Key words：streptococcus suis serotype 2；virulence factors；MLST

中圖分類號：S855.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1005-944X（2016）03-0001-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.03.001

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃，2007AA02Z405）、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303041）

通訊作者：黃保續(xù)