重組人組織因子在畢赤酵母中的高效分泌表達的研究

張秀華，釗倩倩，劉飛，朱希強,2Δ

(1.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點實驗室/山東省多糖類藥物工程實驗室/多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實驗室，山東 濟南 250101；2.山東福瑞達醫(yī)藥集團公司，山東 濟南 250101)

重組人組織因子在畢赤酵母中的高效分泌表達的研究

張秀華1，釗倩倩1，劉飛1，朱希強1,2Δ

(1.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點實驗室/山東省多糖類藥物工程實驗室/多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實驗室，山東 濟南 250101；2.山東福瑞達醫(yī)藥集團公司，山東 濟南 250101)

目的 構(gòu)建含有人組織因子(hTF)基因的畢赤酵母高效表達系統(tǒng)，實現(xiàn)胞外高效分泌表達。方法 全基因合成hTF胞外區(qū)序列，PCR擴增該基因片段，經(jīng)Xho I和Xba I雙酶切后，和表達載體pGAPZaA相連，并電轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168H。在YPD培養(yǎng)基中進行表達，取培養(yǎng)基上清進行SDS-PAGE檢測，并利用Western進行確證，通過BCA法檢測胞外蛋白表達量。結(jié)果 在畢赤酵母中成功表達人組織因子，通過Western確證目的蛋白分子量大小正確，BCA法檢測搖瓶表達胞外總蛋白達1 g/L，Bandscan軟件分析目的蛋白占胞外總蛋白80%以上。結(jié)論 本研究實現(xiàn)了截短型人組織因子在畢赤酵母中的高效分泌表達，獲得了具有與完整因子相同凝血活性的截短型組織因子。

重組人組織因子；畢赤酵母SMD1168H；Western blot；高效分泌表達

凝血因子III，又稱組織因子(tissue factor，TF)，廣泛存在于各種動物組織[1]，在凝血過程中發(fā)揮著重要作用，是凝血過程的啟動者。在創(chuàng)傷等外界刺激下組織因子釋放，在鈣離子作用下與因子VII結(jié)合，并依次激活因子VII、因子X，然后活化凝血酶原為凝血酶，進一步將纖維蛋白原酶解為纖維蛋白單體，并交聯(lián)形成穩(wěn)定的纖維蛋白凝塊，最終凝血[2-3]。

組織因子是一種由263個氨基酸殘基組成的單鏈跨膜糖蛋白。完整的組織因子含有263個氨基酸殘基，分子量為47 kDa，含三個結(jié)構(gòu)域，胞外區(qū)包含1-219氨基酸殘基，疏水跨膜區(qū)包含220-242氨基酸殘基，243-263為胞內(nèi)區(qū)[4]。其中胞外區(qū)含有兩個二硫鍵和三個N糖基化位點，組織因子與因子VIIa形成復(fù)合物并激活因子X的主要功能即位于胞外區(qū)[5]。由于畢赤酵母表達系統(tǒng)既具有原核細胞的可操作特點，也具有真核細胞的翻譯后加工能力，表達水平較高，且產(chǎn)物是以活性狀態(tài)分泌到培養(yǎng)基中，易于后續(xù)分離純化。本課題擬在畢赤酵母中表達只含胞外區(qū)的截短型組織因子，在胞外實現(xiàn)可溶性表達，且實驗數(shù)據(jù)證實截短型組織因子具有和完整組織因子相同的激活作用[6-7]。

王羽雄等[8]在畢赤酵母中利用pPIC9K載體，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后組織因子表達量僅為182 mg/L。趙邑等[5]在大腸桿菌中表達人組織因子，在30 L發(fā)酵罐上表達量為6.56 mg/L。宋后燕等[10]在大腸桿菌中表達組織因子，形成包涵體，不僅復(fù)性困難，產(chǎn)量也低。目前報道的重組組織因子表達量均較低[11]，且發(fā)酵過程需要誘導(dǎo)或形成包涵體，誘導(dǎo)劑的加入不僅增加毒性，也給后續(xù)分離純化帶來困難，本課題擬構(gòu)建一株不需要誘導(dǎo)同時表達量高的菌株，以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求，降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株：pGAPZaA質(zhì)粒、E.coliTop10、SMD1168H畢赤酵母表達宿主菌均為本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基：液體低鹽LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉5，調(diào)節(jié)至pH7.5。固體低鹽LB培養(yǎng)基含1.5%～2%瓊脂粉。YPB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。固體YPD培養(yǎng)基含1.5%～2%瓊脂粉。

1.1.3 試劑：限制性內(nèi)切酶(Xba I，Xho I，Bln I)、T4 DNA連接酶、Protein Marker、Pfu DNA 聚合酶(Fermentas)、Zeocin；PCR引物、DNA Marker、質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；TF(C-7)：sc-393657、goat anti-mouse IgG-HRP：sc-2005(Santa cruz biotechnology)。其他試劑均為市售分析純。

1.1.4 實驗儀器：三層搖床Ampere chart Mnltitron II(伊孚森生物技術(shù)中國有限公司)；AG 22331 Hamburg PCR儀(Eppendorf)；Thermo Micro7/21R離心機(Thermo)；Sunrise-Basic Tecan酶標(biāo)儀(TECAN)；Mini-PROTEAN Tetra Cell SDS-PAGE電泳槽(Bio-RAD)；DYCP-40C型電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 TF基因的獲得：查閱Genebank得到人組織因子基因序列，Gene ID：7018，取其胞外區(qū)657個堿基(219 aa)，按照畢赤酵母表達宿主菌偏好的密碼子進行序列優(yōu)化，分別在優(yōu)化好的序列上下游添加Xho I，Xba I酶切位點，并送濟南博尚生物技術(shù)有限公司進行序列合成。利用Oligo軟件設(shè)計上下游引物(上游引物：5’-CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAG-3’下游引物：5’-GCTCTAGATTACTCTCTGAACTCAC-3’)以對目的片段進行擴增，合成該引物。

1.2.2 pGAPZaA-rTF重組質(zhì)粒的構(gòu)建并電轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168H：將PCR獲得的rTF基因片段和pGAPZaA質(zhì)粒載體分別用限制性內(nèi)切酶Xho I、Xba I進行雙酶切，純化后用T4 DNA連接酶連接，獲得pGAPZaA-rTF重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞，涂布含25 μg/mL Zeocin的低鹽LB平板。獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)單酶切和PCR驗證正確后進行測序分析。測序正確后，提取pGAPZaA-rTF重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bln I線性化后準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)化畢赤酵母。電轉(zhuǎn)化過程按《畢赤酵母表達操作手冊》[12]中操作，山梨醇活化后涂布含1 μg/mL、5 μg/mL Zeocin抗性的平板。

1.2.3 重組人組織因子的表達：從1 μg/mL、5 μg/mL Zeocin抗性平板上挑取SMD1168H-pGAPZaA-rTF工程菌單菌落，分別接種至含1 μg/mL、5 μg/mL Zeocin抗性的YPD培養(yǎng)基中進行表達，SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白表達量，從中篩選出表達量高的菌株接種至含相同濃度Zeocin的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，保存菌種。同時按6%接種量將種子液接種至含100 mL YPD培養(yǎng)基的搖瓶中， 30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，并分別在發(fā)酵40、50、62、75、87、99、110 h時取樣。

表達結(jié)束后，樣品經(jīng)12000 r/min，離心5 min，取發(fā)酵液上清進行SDS-PAGE電泳(具體操作方法參考精編分子生物學(xué)實驗指南334-335[13])，檢測目的蛋白表達情況及分子量。

1.2.4 重組人組織因子的Western免疫學(xué)研究：取胞外發(fā)酵液，稀釋后取1 μg進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后利用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白從SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，預(yù)染蛋白分子量marker作為轉(zhuǎn)膜是否完全的標(biāo)志。轉(zhuǎn)膜后Western操作過程按照精編分子生物學(xué)實驗指南[13]操作，利用小鼠IgG1-TF單抗作為一抗，稀釋比例1︰1000；羊抗鼠IgG-HRP作為二抗，稀釋比例1︰10000， DAB顯色試劑盒顯色。為防止實驗結(jié)果假陽性，分別取3批不同發(fā)酵批次的發(fā)酵液上清進行Western驗證。

2 結(jié)果

2.1 TF基因的獲得 利用添加酶切位點的特異性引物對合成的序列進行PCR擴增，擴增后的片段進行切膠回收，回收后的片段進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。從圖中可知得到的目的基因片段約在700 bp，與理論值相一致。

圖1 TF胞外區(qū)基因片段結(jié)果1：DNA Marker；2，3：TF目的基因Fig.1 Extracellular domain of TF gene1:DNA Marker;2,3:TF gene

2.2 pGAPZaA-rTF重組質(zhì)粒的構(gòu)建 從轉(zhuǎn)化平板上挑取重組子單菌落至低鹽LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒后用Xho I單酶切，并進行PCR驗證，0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。從圖中可以看出，單酶切后的空質(zhì)粒約為3100 bp，單酶切后的重組質(zhì)粒在3800 bp附近，差值與目的基因理論值相一致。以重組子為模版利用PCR擴增得到的目的基因，也與TF基因700 bp大小相一致，而陰性對照組以pGAPZaA為模版，無法擴增出目的片段。測序結(jié)果也顯示插入的序列與設(shè)計的序列完全一致。

圖2 pGAPZaA-rTF重組質(zhì)粒單酶切及PCR驗證結(jié)果1：DNA Marker；2：pGAPZaA 空質(zhì)粒；3：pGAPZaA-rTF重組質(zhì)粒；4：pGAPZaA-rTF重組質(zhì)粒經(jīng)Xho I單酶切；5：pGAPZaA空質(zhì)粒經(jīng)Xho I單酶切；6：pGAPZaA-rTF重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增；7：pGAPZaA空質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增Fig.2 Single-digested and PCR validation of recombinant pGAPZaA-rTF1:DNA Marker；2:pGAPZaA plasmid;3:recombinant pGAPZaA-rTF plasmid；4:Single digested of pGAPZaA-rTF by Xho I;5:Single digested of pGAPZaA by Xho I;6:PCR validation of recombinant pGAPZaA-rTF;7:PCR validation of pGAPZaA

測序正確的重組質(zhì)粒pGAPZaA-rTF經(jīng)Bln I單酶切線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168H，將在5 μg/mL Zeocin抗性平板上篩選得到轉(zhuǎn)化子，破壁后進行PCR擴增，得到同樣大小的目的基因片段，證明重組質(zhì)粒成功在畢赤酵母SMD1168H基因組中同源重組。

2.3 重組人組織因子的表達 SMD1168H-pGAPZaA-rTF菌株在YPD培養(yǎng)基中表達，電泳結(jié)果見圖3。

圖3 人組織因子表達情況SDS-PAGE分析1：蛋白分子量Marker；2-8：表達40、50、62、75、87、99、110 h發(fā)酵上清液中蛋白表達情況Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression of human rTF1:Protein molecular weight Marker;2-8:Expression of rTF in culture medium at 40,50,62,75,87,99,110 h

圖3中可以看出，發(fā)酵40 h后蛋白已有明顯表達，蛋白分子量在37～40 kDa。酵母表達胞外總蛋白用BCA蛋白含量試劑盒檢測，見圖4，從圖中看出隨著發(fā)酵時間的延長蛋白表達量增多，表達至87 h后蛋白表達量幾乎不再上升，因此可適當(dāng)縮短表達時間。

圖4 人組織因子表達胞外總蛋白含量Fig.4 Total extracellular protein of human TF expression

經(jīng)BCA蛋白含量試劑盒檢測，胞外總蛋白表達量可達1 g/L，Bandscan軟件分析目的蛋白占胞外總蛋白80%以上。

2.4 重組人組織因子的免疫學(xué)研究 重組人組織因子Western結(jié)果見圖5。從圖中可以看出空載體處沒有任何條帶，樣品處出現(xiàn)3條特異性條帶，大小在37～40 kDa，而經(jīng)去糖基化酶去糖基化后只出現(xiàn)一條特異性條帶，說明3條均為目的蛋白條帶，是由于糖基化程度不同而出現(xiàn)分子量的差異。取不同發(fā)酵批次的發(fā)酵液進行Western驗證，結(jié)果證明均在同一位置處出現(xiàn)目的條帶，即確定該位置處條帶為目的條帶。

圖5 人組織因子Western結(jié)果(n=3)1：蛋白分子量Marker；2：空載體對照；3：蛋白表達樣品；4：蛋白樣品去糖基化Fig.5 Western results of human rTF(n=3)1：Protein molecular weight Marker；2：Proteins expressed by SMD1168H-pGAPZaA； 3：Proteins expressed by SMD1168H-pGAPZaA-rTF；4：Deglycosylated protein expressed by SMD1168H-pGAPZaA-rTF

3 討論

完整組織因子包括胞外區(qū)、疏水跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)共263 aa，理論分子量為24.8 kDa，實際分子量為47 kDa，本課題表達人組織因子胞外區(qū)部分，含有219 aa，推算分子量約為39 kDa。而從Western結(jié)果中看出，存在3條特異性條帶，對應(yīng)分子量Marker推算分子量分別約為37、39、40 kDa，與理論分子量相符。3條特異性條帶處蛋白均為人組織因子蛋白，由于人組織因子胞外區(qū)有3個N糖基化位點，分析原因可能是由于糖基化程度的不同導(dǎo)致目的蛋白在分子量上有些許區(qū)別，但該區(qū)別不影響蛋白活性[8,14-15]。

本課題利用pGAPZaA載體，將人組織因子在畢赤酵母中中表達，無需誘導(dǎo)，利用搖瓶發(fā)酵胞外總蛋白產(chǎn)量即可達1 g/L，其中目的蛋白占80%以上，這也是目前所報道的重組人組織因子表達的最高產(chǎn)量。表達量是趙邑等[7]的150倍，是王羽雄等[8]的5.5倍，更加適合工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)。本課題后續(xù)將進行發(fā)酵罐發(fā)酵表達，在良好的發(fā)酵條件下，蛋白表達量將有明顯提高。同時將表達產(chǎn)物分離純化，提高組織因子蛋白的質(zhì)量，進行凝血酶原試劑盒的開發(fā)，為凝血酶原時間測定實驗標(biāo)準(zhǔn)化提供重要保障。

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(編校：王冬梅)

High level secretory expression of recombinant human tissue factor inPichiapastoris

ZHANG Xiu-hua1, ZHAO Qian-qian1, LIU Fei1, ZHU Xi-qiang1，2Δ

(1.Key Laboratory of Biopharmaceuticals/Engineering Laboratory of Polysaccharide Drugs/National-Local Joint Engineering Laboratory of Polysaccharide Drugs Fermentation and Purification, Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences, Jinan 250101, China;2.Shandong Freda Pharmaceutical Group Co.Ltd., Jinan 250101, China)

ObjectiveTo construct a eukaryotic expression vector inPichiapastoriscontaining human tissue factor(hTF) gene,in order to achieve high level secretory expression in extracellular.MethodsExpression plasmid, pGAPZaA-hTF, was constructed by inserting the synthesized sequence encoding human extracellular tissue factor into yeast expression vector pGAPZaA and transformed intoPichiapastorisSMD1168H with electroporation.Having been selected by Zeocin, transformants containing hTF cDNA were expressed in YPD, extracellular proteins were detected by SDS-PAGE and confirmed by Western bolt.ResultsSuccessfully constructed the recombinant pGAPZaA-hTF expression system inPichiapastoris.SDS-PAGE showed that the molecular weight of the expression product was about 37 - 40 kDa.Western-blot indicated that it was human extracellular tissue factor.The crude yield of total protein in medium was up to 1 g/L, more than 80% of which was hTF.ConclusionTruncated rTF gene is expressed inPichiapastorisand the active products are secreted into the medium which have the same activation as the native TF.

recombinant human tissue factor;Pichiapastoris; Western blot; high yield

國家高技術(shù)研究發(fā)展(863)計劃(2014AA093603)；山東省科技發(fā)展計劃，(2014GSF121043)；山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化專項(2014GGZH1306)；山東省重點研發(fā)計劃(2015GSF121003)；濟南市重大專項(201403009)；山東省科技重大專項(重大關(guān)鍵技術(shù))(2015ZDJS04002)

張秀華，女，碩士，研究方向：生物藥學(xué)，E-mail：wfzxh0318@163.com；朱希強，通信作者，男，博士，研究員，研究方向：生物技術(shù)，E-mail：lfshwu@163.com。

Q786

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.09