Box-Behnken 效應(yīng)面法優(yōu)化婦樂(lè)顆粒中綠原酸提取工藝

林佳苗，姜建偉

(1.浙江省臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心(集團(tuán))臺(tái)州市中心醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 318000；2.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022)

Box-Behnken 效應(yīng)面法優(yōu)化婦樂(lè)顆粒中綠原酸提取工藝

林佳苗1Δ，姜建偉2

(1.浙江省臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心(集團(tuán))臺(tái)州市中心醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 318000；2.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022)

目的 采用Box-Behnken 效應(yīng)面法,優(yōu)選婦樂(lè)顆粒中綠原酸提取工藝條件。方法 采用HPLC測(cè)定婦樂(lè)顆粒中綠原酸的含量，色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm；柱溫: 30 ℃; 流速: 0.9 mL/min；流動(dòng)相:乙腈-0.2%磷酸溶液=15:85。以綠原酸提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Behnken 試驗(yàn)考察提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)對(duì)提取工藝的影響。結(jié)果 最佳提取工藝為加12倍量水提取3次，每次60 min; 綠原酸提取率為3.379%。結(jié)論 通過(guò)Box-Behnken 效應(yīng)面法為評(píng)價(jià)系統(tǒng)優(yōu)選的提取工藝合理可行，預(yù)測(cè)性良好,為婦樂(lè)顆粒的應(yīng)用提供參考。

婦樂(lè)顆粒；忍冬藤；綠原酸；提取工藝；Box-Behnken 效應(yīng)面法

婦樂(lè)顆粒由忍冬藤、大血藤、甘草、大青葉、蒲公英、牡丹皮、赤芍、川楝子、醋延胡索和熟地黃等10味藥材制得，具有化瘀止痛、清熱涼血之功效。臨床多用于治療瘀熱蘊(yùn)結(jié)所致的帶下病，癥見帶下量多、色黃、少腹疼痛，慢性盆腔炎等癥候[1]。君藥忍冬藤具有清熱解毒，消腫的功效。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2-3]：忍冬藤主要活性成分為有機(jī)酸類和環(huán)烯醚萜苷類，其中綠原酸含量較高，它具有抗病毒、抗菌、保肝利膽、增高白血球、抗菌抗感染、抗腫瘤、降血壓及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用[4-5]。目前，大多研究采用正交設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化綠原酸的提取工藝[6-7]，未見Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝方面相關(guān)研究。

Box-Behnken(BBD)效應(yīng)面法是常見的一種效應(yīng)面優(yōu)化方法，適宜于解決非線性數(shù)據(jù)處理的相關(guān)問(wèn)題，是一種連續(xù)分析實(shí)驗(yàn)點(diǎn)以尋求最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件的方法。BBD效應(yīng)面法在小區(qū)域內(nèi)用簡(jiǎn)單一次或二次多項(xiàng)式模型來(lái)擬合較復(fù)雜的未知函數(shù)，找出預(yù)測(cè)的響應(yīng)值最優(yōu)值以及相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件。本試驗(yàn)采用Box-Behnken效應(yīng)面法對(duì)婦樂(lè)顆粒中綠原酸提取工藝影響的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化的同時(shí)，旨在驗(yàn)證該試驗(yàn)設(shè)計(jì)法在中藥提取工藝應(yīng)用中的可行性，也為婦樂(lè)顆粒標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：婦樂(lè)顆粒(湖北襄陽(yáng)隆中藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：6克/袋，6批)；綠原酸對(duì)照品(批號(hào)110753-201314，供含量測(cè)定用)購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究院；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑為分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：DIONEX UltiMate 3000 系列高效液相色譜儀(SRD-3400A分析泵、WPS-3000自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3000SD柱溫箱、VDW-3000檢測(cè)器、工作站：Chromeleon?Dionex)；色譜柱： Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；AB-135S型電子天平(METTLER-TOLEDO D=0.01 mg)。

1.2 方法

1.2.1 婦樂(lè)顆粒中綠原酸滲漉提取工藝：分別稱取照處方比例的忍冬藤、大血藤、甘草、大青葉、蒲公英、牡丹皮、赤芍、川楝子、醋延胡索等九味藥材，加水煎煮2次，合并煎液，縮至適量，加水定容至1000 mL，搖勻、過(guò)濾。測(cè)定濾液中綠原酸的質(zhì)量濃度，計(jì)算綠原酸提取率[提取率=(濾液中綠原酸的質(zhì)量濃度×濾液體積)/忍冬藤質(zhì)量×100%]。

1.2.2 色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸溶液=15:85；流速： 0.9 mL/min；進(jìn)樣體積： 10 μL；柱溫： 30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)： 327 nm。

1.2.3 婦樂(lè)顆粒中綠原酸的含量測(cè)定

① 對(duì)照品溶液的制備：取經(jīng)P2O5真空干燥24 h綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，置于棕色容量瓶中，加入甲醇制成每1 mL含46.3 μg的綠原酸對(duì)照品溶液，置涼暗處保藏，備用。

② 供試品溶液的制備：精密量取“1.2.1”項(xiàng)下藥材濃縮液2.0 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

③ 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取綠原酸對(duì)照品溶液2、4、8、16、25、30 μL注入液相色譜儀，記錄綠原酸的峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量X(ng) 為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

④ 精密度試驗(yàn)精密：吸取綠原酸對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄色譜圖。

⑤ 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、15、18、24 h按相應(yīng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。

⑥ 加樣回收試驗(yàn)：按照婦樂(lè)顆粒處方，取已知含量忍冬藤和其它九味藥材共6份，按照“1.2.1”和“1.2.3②”方法，分別精密加入綠原酸對(duì)照品各適量，依“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)定峰面積，并計(jì)算回收率。

1.2.4 婦樂(lè)顆粒中綠原酸提取工藝的優(yōu)化

① 單因素試驗(yàn):料液比考察：取忍冬藤藥材約20 g，其它九味藥材取量按照處方比例推算，提取時(shí)間為60 min/次，提取2次，分別按料液比1:6，1:8，1:10，1:12，1:14 條件進(jìn)行提取，依“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算綠原酸提取率。

提取時(shí)間考察：取忍冬藤藥材約20 g，其它九味藥材取量按照處方比例推算，按料液比1:10，提取2次，考察提取30、40、60、90、100 min 綠原酸的提取率。

提取次數(shù)考察：取忍冬藤藥材約20 g，其它九味藥材取量按照處方比例推算，料液比1:10，提取時(shí)間定為60 min，逐步提取1，2，3，4 次，依“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算綠原酸提取率。

② Box-Behnken 效應(yīng)面法優(yōu)化婦樂(lè)顆粒提取工藝：提取工藝方案設(shè)計(jì)：采用軟件Design-Expert 8.0.5 中的Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取次數(shù)(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C) 為因素，綠原酸提取率(%)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析。

模型的建立及顯著性檢驗(yàn)：以綠原酸提取率為因變量，提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)為自變量，使用Design Expert 8.0.5 軟件對(duì)各因素進(jìn)行二次多元回歸擬合，并對(duì)模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化：根據(jù)二元多次模型，采用Design-Expert軟件分析，作出相應(yīng)的曲面圖和等高線圖，并對(duì)曲面圖和等高線圖進(jìn)行分析，優(yōu)化提取工藝。

最佳提取工藝確定及驗(yàn)證試驗(yàn)：用Design-Expert 8.0.5 統(tǒng)計(jì)軟件求解回歸方程可以推測(cè)出綠原酸最佳提取工藝，并預(yù)測(cè)出提取率值。

2 結(jié)果

2.1 婦樂(lè)顆粒中綠原酸的含量測(cè)定方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果： 綠原酸回歸方程為Y=2.36X-0.05，R2=0.9997。表明綠原酸在0.0923～1.389 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度試驗(yàn)精密結(jié)果： RSD為0.12%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果：綠原酸的峰面積RSD為0.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果綠原酸平均回收率99.4%，RSD=0.5%(n=6)，表明本方法具有較好的加樣回收率。見表1。

表1 綠原酸回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.2 婦樂(lè)顆粒中綠原酸提取工藝的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 單因素考察結(jié)果：

① 料液比考察結(jié)果：綠原酸提取率分別為2.11%、2.56%、2.87%、3.32%、3.30%。表明當(dāng)提高料液比有利于綠原酸的提取，當(dāng)料液比達(dá)到1:12時(shí)，綠原酸基本提取完全。

② 提取時(shí)間考察結(jié)果：綠原酸提取率分別為2.06%、2.89%、3.26%、3.32%、3.30%。表明60 min內(nèi)綠原酸提取率隨提取時(shí)間的增而增加，當(dāng)提取時(shí)間大于60 min時(shí)，再繼續(xù)提取，綠原酸提取率沒(méi)有顯著增加，可以推斷60 min為最佳提取時(shí)長(zhǎng)。

③ 提取次數(shù)考察結(jié)果：結(jié)果綠原酸提取率(2次及以后綠原酸累加計(jì)算)分別為1.26%、2.72%、3.30%，3.32%，說(shuō)明忍冬藤提取3～4 次才可以提取完全。

2.2.2 Box-Behnken 效應(yīng)面法優(yōu)化婦樂(lè)顆粒提取工藝結(jié)果

① 提取工藝方案設(shè)計(jì)結(jié)果：優(yōu)化方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 提取工藝Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值

② 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果：擬合模型如下：綠原酸提取率Y(%)=3.32+0.026A+0.044B+0.087C+0.0025B+0.005AC -0.024A2+0.011B2-0.092C2，A，B，C 為自變量，分別代表提取次數(shù)、料液比、提取時(shí)間。擬合方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9522，說(shuō)明設(shè)計(jì)模型擬合程度良好，可以用于忍冬藤中綠原酸的提取率的預(yù)測(cè)。模型的變異系數(shù)(CV)為0.90%，在可接受范圍。對(duì)二次多項(xiàng)模型進(jìn)行方差分析可知(見表3)，所建立模型有意義 (P<0. 05)，失擬項(xiàng)P=0.405，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C-提取時(shí)間一次項(xiàng)、B-料液比一次項(xiàng)、提取時(shí)間二次項(xiàng)達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，對(duì)綠原酸提取率影響明顯。

表3 二元多次回歸擬合Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果

*P<0.05表示顯著性差異；**P<0.01表示極顯著性差異

③ 提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化結(jié)果：響應(yīng)面如圖1～3所示。圖1可以看出，料液比達(dá)到1:12時(shí)，綠原酸提取最完全，當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到大約2.5次時(shí)，曲線達(dá)到高點(diǎn)，即綠原酸提取率最高，隨后有所下降；圖2顯示的是提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)綠原酸提取率的影響，由圖可以看出，提取時(shí)間對(duì)提取率的影響呈曲線趨勢(shì)，先大后小，大概在60 min達(dá)到頂峰。

圖1 料液比與提取次數(shù)對(duì)綠原酸提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Response surface plot and contour plot of liquid ratio and extraction times

圖2 提取時(shí)間與提取次數(shù)對(duì)綠原酸提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface plot and contour plot of extraction time and extraction times

圖3 提取時(shí)間與料液比對(duì)綠原酸提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot of extraction time and solid-liquid ratio

④ 最佳提取工藝確定及驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果婦樂(lè)顆粒中綠原酸最佳提取工藝為： 提取次數(shù)為3，料液比為1:12，提取時(shí)間為60 min，此條件下綠原酸與預(yù)測(cè)值為3.379%。結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)，將料液比定為1 ：12，提取時(shí)間定為60 min，提取3 次，進(jìn)行提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)(n=3)，實(shí)際測(cè)得綠原酸提取率為3.372%，RSD=0.1%(n=3)，說(shuō)明該模型可靠。

3 討論

綠原酸具有抗病毒、抗菌、抗感染等多種功效，具有很好臨床應(yīng)用價(jià)值。婦樂(lè)顆粒處方中忍冬藤藥材含量綠原酸，目前，也有相關(guān)文獻(xiàn)[8]對(duì)忍冬藤中綠原酸開展研究，但是提取方法鮮有報(bào)道，本文利用Box-Behnken 效應(yīng)面法設(shè)計(jì)并優(yōu)化忍冬藤藥材中綠原酸提取工藝，確立最佳提取工藝參數(shù)，為提高婦樂(lè)顆粒臨床應(yīng)用范圍提高參考。

本研究考察提取次數(shù)、提取時(shí)間和料液比三因素對(duì)綠原酸提取率的影響，利用Box-Behnken效應(yīng)面法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并按照各試驗(yàn)點(diǎn)條件測(cè)出相應(yīng)提取率，采用二元多次方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)二元多次模型來(lái)推測(cè)最佳工藝條件。BBD效應(yīng)面法不僅考察因素與響應(yīng)值之間作用，還能考察各因素間的相互作用，方法簡(jiǎn)便合理，試驗(yàn)次數(shù)較少，與正交試驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)相比較，更加直觀、合理，精密度和準(zhǔn)確度也大大地提高。采用模型推測(cè)最佳方法實(shí)驗(yàn)所得提取率和預(yù)測(cè)值接近，進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。

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(編校：譚玲)

Optimization of processing parameters for extraction of chlorogenic acid in Fule Granula using Box-Behnken experimental design

LIN Jia-miao1Δ, JIANG Jian-wei2

(1. Zhejiang Taizhou Grace (group) Medical Center Taizhou Center Hospital, Taizhou 318000, China；2. Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou 310022, China)

ObjectiveTo optimize the processing parameters for the extraction of chlorogenic acid in Fule Granula by Box-Behnken experimental design. MethodsThe content of chlorogenic acid in Fule Granula was determination. The separation was performed on a Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18column(4. 6 mm ×250 mm, 5 μm), and column temperature 30 ℃. Aetonitrile-0.2% H3PO4was used as the mobile phase. The detection wavelength was at 327 nm. A three-factor and three-level Box-Behnken experimental design was employed to investigate effects of extraction time, solid-liquid ratio and extraction times on composite score of extracting amount of chlorogenic acid. ResultsOptimum process conditions were as follows:12 times the amount of water extracted three times, each time 60 min; chlorogenic acid extraction rate of 3.379%.ConclusionThis optimized extraction technology has good predictability by Box-Behnken experimental design, and overall desirability, it provides a reference for application of Fule Granula.

Fule Granula; lonicerae japonicae caulis; chlorogenic acid; extraction technology; Box-Behnken experimental design

林佳苗，通信作者，女，本科，主管藥師，研究方向：藥物制劑工藝，E-mail：3079133348@qq.com。

R284.1

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.62