一測(cè)多評(píng)法測(cè)定垂盆草顆粒中槲皮素、山奈素與異鼠李素含量

郭燕娜，胡華杰

(浙江省舟山醫(yī)院 藥劑科，浙江 舟山 316000)

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定垂盆草顆粒中槲皮素、山奈素與異鼠李素含量

郭燕娜Δ，胡華杰

(浙江省舟山醫(yī)院 藥劑科，浙江 舟山 316000)

目的 建立一測(cè)多評(píng)方法，測(cè)定垂盆草顆粒中槲皮素、山奈素與異鼠李素含量為控制垂盆草顆粒的質(zhì)量提供依據(jù)。方法 采用島津C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)性為甲醇-水(含0.4%磷酸溶液)=50:40；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；進(jìn)樣量：10 μL；以槲皮素為參考建立山奈素和異鼠李素間的相對(duì)校正因子，考察其重現(xiàn)性，比較計(jì)算值與測(cè)得值的差異。結(jié)果 槲皮素、山奈素和異鼠李素分別在32.36～426.43 μg、11.56～136.87 μg 、10.45～155.68 μg呈良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為：Y=3625.8X-13658(R2=0.9998)、Y=2682.9X-10253(R2=0.9999)、Y=3012.2X-11223(R2=0.9999)。平均加樣回收率分別為99.3%、99.6%、98.5%(RSD均<1.0%)。用一測(cè)多評(píng)法對(duì)10批垂盆草顆粒中槲皮素、山奈素與異鼠李素進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值基本一致。結(jié)論 該方法可靠，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于垂盆草顆粒的質(zhì)量控制。

一測(cè)多評(píng)；垂盆草顆粒；槲皮素；山奈素；異鼠李素

垂盆草顆粒是提取垂盆草新鮮全草制備而來(lái)的，它具有清利濕熱、降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用，臨床上用于急性肝炎、遷移性肝炎及慢性肝炎活動(dòng)期的治療[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2-3]，垂盆草中含有黃酮及其苷、三萜、甾醇、生物堿、氰苷、氨基酸、糖類(lèi)等化合物。而大部分黃酮醇苷結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過(guò)其水解后的苷元, 如槲皮素、山柰酚、異鼠李素等得到證實(shí)。2015年版《中國(guó)藥典》一部制定垂盆草顆粒中蘆丁質(zhì)控方法和限度，未對(duì)槲皮素、山奈素和異鼠李素做質(zhì)控要求，近年來(lái)，雖已有文獻(xiàn)[1-4]對(duì)上述成分做了研究，但是涉及到多種對(duì)照物質(zhì)，檢驗(yàn)成本高。2006年，王智民等[5]最早建立利用一測(cè)多評(píng)法來(lái)控制中成藥多成分的考察模式,實(shí)現(xiàn)以一種對(duì)照物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)多種成分，方法簡(jiǎn)便實(shí)用，經(jīng)濟(jì)合理，目前在中藥領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)以槲皮素為參照物，建立其與山奈素和異鼠李素間的相對(duì)校正因子，實(shí)現(xiàn)以一種對(duì)照物質(zhì)對(duì)垂盆草顆粒中的多成分進(jìn)行質(zhì)量控制，這為更真實(shí)評(píng)價(jià)垂盆草顆粒質(zhì)量提供了全新模式，以便控制藥品質(zhì)量。通過(guò)考察不同色譜儀器和色譜柱對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，并通過(guò)比較一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果的差異來(lái)驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：垂盆草顆粒10批(上海靜安制藥有限公司，規(guī)格：5g/袋，批號(hào)：20150503、20150617、20150715、20150729、20150816、20150830、20150914、20150929、20151016、20151117)；槲皮素對(duì)照品(批號(hào)：100081-20907，含量：97.4%)、異鼠李素對(duì)照品(批號(hào)：110860-201109，含量：99.0%)、山奈素對(duì)照品(批號(hào)：110861-201209，含量：93.2%)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為純化水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：戴安Ultimate 3000系列高效液相色譜儀(SRD-3400A分析泵、WPS-3000自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3000SD柱溫箱、VDW-3000檢測(cè)器、工作站：Chromeleon?Dionex)，色譜柱：島津ODS (250 mm×4.6 mm，5 μm)；AB-135S型電子天平(梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司，D=0.01 mg)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：流動(dòng)相：甲醇-水(含0.4%磷酸溶液)=50:40；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱(chēng)取槲皮素、山柰素和異鼠李素對(duì)照品適量，置200 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述對(duì)照品混合溶液5 mL置50 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含槲皮素、山柰素和異鼠李素16.2、5.8、5.2 μg的對(duì)照品混合溶液，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備：取混合均勻的垂盆草顆粒約5 g，研細(xì)，精密稱(chēng)定，置100 mL燒瓶中，加25 mL的甲醇-20%鹽酸溶液(5:1)混合溶液，加熱回流2 h，期間用甲醇-20%鹽酸溶液(5:1)補(bǔ)足減失的重量，放冷，混勻后，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

1.2.4 陰性樣品溶液的制備：按處方制備缺槲皮素、山柰素和異鼠李素的陰性樣品，按1.2.3項(xiàng)下方法制備陰性供試品溶液。

1.2.5 方法學(xué)考察

① 線性關(guān)系的考察：精密吸取1.2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，分別按照1.2.1色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積。

② 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批供試品溶液，放置0、2、4、6、8、10 h后按照1.2.1色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積。

③ 精密度試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液，按照1.2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針。記錄色譜圖，計(jì)算峰面積。

④ 加樣回收率試驗(yàn)：取6份已知含量的垂盆草顆粒，分別加入一定量的槲皮素、山奈素和異鼠李素對(duì)照品，按照1.2.1色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算峰面積、回收率。

⑤ 相對(duì)校正因子的計(jì)算：以槲皮素為內(nèi)參物，按下式計(jì)算相對(duì)校正因子：f=fs/fi=AsCi/AiCs

式中As為內(nèi)參物對(duì)照品峰面積，Ai為待測(cè)成分峰面積，Cs為內(nèi)參物濃度， Ci待測(cè)成分濃度。

精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液 2、5、10、15、20、25 μL，分別進(jìn)樣測(cè)定。

1.2.6 相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性考察

① 高效液相色譜儀及色譜柱考察：分別考察Agilent 1260infinity、SHIMADZU LC-10tvp和Waters 2695-2489高效液相色譜儀，考察Sunfire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Thermo C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和SHIMADZU C18(4.6 mm×250 mm，4.5 μm)色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響。

② 色譜峰專(zhuān)屬性考察：色譜峰準(zhǔn)確定位是保證一測(cè)多評(píng)法應(yīng)用的前提，本實(shí)驗(yàn)中利用相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行定位，采用槲皮素與山奈素和異鼠李素的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)合色譜圖的整體特征，結(jié)合不同高效液相色譜儀和色譜柱來(lái)定位目標(biāo)成分。

1.2.7 樣品測(cè)定 取10批不同批號(hào)的垂盆草顆粒，采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法分別計(jì)算垂盆草顆粒中槲皮素、山奈素和異鼠李素的含量。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系的考察 對(duì)照品、陰性樣品和樣品的HPLC色譜圖(見(jiàn)圖2)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，槲皮素、山奈素和異鼠李素的回歸方程(見(jiàn)圖1)分別為：

Y=3625.8X-13658，R2=0.9998；Y=2682.9X-10253，R2=0.9999；Y=3012.2X-11223，R2=0.9999。

圖1 垂盆草顆粒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Linear regression trend of Chuipencao granules

結(jié)果表明,槲皮素、山奈素和異鼠李素進(jìn)樣量分別在32.36～426.43 μg、11.56～136.87 μg 、10.45～155.68 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖2 陰性樣品(A)、對(duì)照品(B)和樣品(C)和HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of negative sample(A),mixed standard (B) and sample(C)

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 槲皮素、山奈素和異鼠李素峰面積的RSD分別為0.4%、0.3%和0.5%(n=6)，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 精密度試驗(yàn) 槲皮素、山奈素和異鼠李素峰面積的RSD分別為0.8%、0.4%和0.9%(n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.4 加樣回收率試驗(yàn) 槲皮素、山奈素和異鼠李素的回收率，結(jié)果見(jiàn)表1-3。

表1 山奈素回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

表2 槲皮素回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

表3 異鼠李素回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.5 相對(duì)校正因子的計(jì)算 山奈素和異鼠李素的校正因子分別為0.721和1.901，RSD分別為0.3%和0.2%，均小于1.0%，表明相對(duì)校正因子重現(xiàn)性很好。

2.6 相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性考察

2.6.1 高效液相色譜儀及色譜柱考察：色譜柱和色譜儀這2個(gè)因素對(duì)相對(duì)校正因子的影響較小(RSD均小于要求的5%)，說(shuō)明一測(cè)多評(píng)法可以運(yùn)用在檢測(cè)垂盆草顆粒中槲皮素、山奈素和異鼠李素成分中，以槲皮素為內(nèi)標(biāo)參考物，利用相對(duì)校正因子0.720和1.905分別來(lái)計(jì)算樣品中山奈素和異鼠李素的含量。見(jiàn)表4。

表4 高效液相色譜儀及色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.6.2 色譜峰專(zhuān)屬性考察：使用通過(guò)考察的色譜條件，利用不同色譜儀和色譜柱進(jìn)行測(cè)定分析，山奈素和異鼠李素相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為0.4%和0.6%，表明相對(duì)位置較為固定，重現(xiàn)性較好，并通過(guò)相應(yīng)出峰的光譜圖來(lái)確定各成分的同一性，可以認(rèn)為本一測(cè)多評(píng)法能作為垂盆草顆粒標(biāo)準(zhǔn)制定的參考依據(jù)。見(jiàn)表5。

表5 不同色譜儀及色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響

2.7 樣品測(cè)定 采用2種方法所得的10批垂盆草顆粒中2種成分含量測(cè)定值的RSD值均小于1.0%，可以認(rèn)為2種方法測(cè)得的結(jié)果基本一致；采用外標(biāo)法實(shí)測(cè)含量與一測(cè)多評(píng)計(jì)算的含夾角余弦值進(jìn)行比較[3]，夾角余弦值分別為0.999 8和0.999 9，表明2種方法測(cè)得的含量沒(méi)有顯著性差異，一測(cè)多評(píng)法可以作為該品種的分析方法。見(jiàn)表6。

表6 樣品的測(cè)定結(jié)果

3 討論

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)比對(duì)，2015版《中國(guó)藥典》一部中垂盆草藥材[6]項(xiàng)下色譜條件和樣品配制方法可以作為本實(shí)驗(yàn)的參考。在樣品提取方式的選擇上，分別考察了超聲和回流3種供試品提取方法，結(jié)果超聲提取不完全，采用回流提取時(shí)，3種成分含量均有很大程度的提高，并且回流2 h時(shí)各成分基本提取完全。提取溶媒的選擇方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)合3種成分的溶解特性，分別以水、甲醇、50甲醇水、甲醇-20%鹽酸溶液(5:1)混合溶液對(duì)樣品進(jìn)行提取，結(jié)果采用甲醇-20%鹽酸溶液(5:1)混合溶液時(shí)提取最完全。

在流動(dòng)相選擇時(shí)，本實(shí)驗(yàn)分別采用乙腈-0.2%磷酸溶液和甲醇-0.4%磷酸溶液系統(tǒng)進(jìn)行比較，結(jié)果采用乙腈-0.2%磷酸溶液時(shí)，山奈素和異鼠李素分離達(dá)不到要求；采用甲醇-0.4%磷酸溶液系統(tǒng)則能實(shí)現(xiàn)各成分的基線分離，理論塔板數(shù)也較前者有所提高，峰形較好，故以甲醇-0.4%磷酸溶液作為流動(dòng)相。

一測(cè)多評(píng)法(QAMS)可在待測(cè)成分對(duì)照品不易得到或不穩(wěn)定等情況下，使用一種對(duì)照物質(zhì)、利用相對(duì)校正因子同時(shí)測(cè)定多成分的含量，目前，QAMS法已在中藥材及飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)中廣泛應(yīng)用[7-12]。此種方法不僅大大地節(jié)省了檢驗(yàn)成本，同時(shí)也極大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，有效提高了工作效率和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，方法有效可行，可以為制定本藥品標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

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(編校：王冬梅)

Content determination of quercetin，kaempferide and isohamnetin in Chuipencao granules by quantitative analysis of multi- components by single-marker

GUO Yan-naΔ, HU Hua-jie

(Department of Pharmacy, Zhoushan Hospital of Zhejiang, Zhoushan 316000, China)

ObjectiveTo develop a method of quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS)for determination of quercetin，kaempferide，isohamnetin in Chuipencao granules，providing method to control the quality of Chuipencao granules.MethodsThe analysis was performed at 30 ℃，on an Shimadzu C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)，and the mobile phase was methanol -0.4% phosphoric acid solution .The flow rate was 1.0 mL/min，and the injection volume was 10 μL.Quercetin as a reference to establish the relative correction factor kaempferol and between isorhmnetin, the method was evaluated for reproducibility, and the difference between calculated and measured values was compared.ResultsQuercetin, kaempferol and isorhmnetin respectively 32.36-426.43 μg, 11.56-136.87 μg, 10.45-155.68 μg showed a good linear relationship, and the regression equation was:Y=3625.8X-13658 (R2=0.9998),Y=2682.9X-10253(R2=0.9999),Y=3012.2X-11223 (R2= 0.9999).The average recoveries were 99.3%, 99.6%, 98.5% (RSD were less than 1.0%).Determination of 10 batches of Chuipencao granules with QAMS and external standard method, kaempferol and isorhamnetin were measured, and measured values were basically the same.ConclusionThe QAMS method is reliable and accurate, which might be used for the quality control of Chuipencao granules.

quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS); Chuipencao granules; quercetin; kaempferide; isohamnetin

郭燕娜，通信作者，女，本科，中藥師，研究方向：中藥(中成藥)質(zhì)量控制，E-mail：3357766703@qq.com。

R969.3

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.63