金針菇與黑木耳醇提物的抗腫瘤和抗氧化作用比較

汪璐，劉明月，謝鯤鵬，謝明杰

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116081)

金針菇與黑木耳醇提物的抗腫瘤和抗氧化作用比較

汪璐，劉明月，謝鯤鵬，謝明杰Δ

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116081)

目的 研究比較金針菇和黑木耳醇提物的抗腫瘤作用和抗氧化作用。方法 采用MTT法測定金針菇和黑木耳醇提物對MCF-7、HeLa和A375細(xì)胞的抑制作用。DPPH和FRAP法測定金針菇和黑木耳醇提物的抗氧化能力。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示，25～400 μg/mL濃度范圍內(nèi)的金針菇和黑木耳醇提物對MCF-7、HeLa和A375細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，金針菇的抑制作用強(qiáng)于黑木耳，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，400 μg/mL金針菇醇提物對MCF-7、HeLa和A375的抑制率分別為48.20%、52.61%和50.58%(P<0.01)，相同濃度的黑木耳醇提物對MCF-7、HeLa和A375的抑制率分別為37.62%、50.21%和41.59%(P<0.01)?？寡趸Y(jié)果顯示，金針菇和黑木耳醇提物均具有較好的抗氧化活性，金針菇的抗氧化作用強(qiáng)于黑木耳，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對照組相比，1.6 mg/mL的金針菇和木耳醇提物對DPPH·自由基的清除率分別為60.30%和40.43%(P<0.01)，F(xiàn)RAP值分別為9.5和7.0 mmol/mL(P<0.01)。結(jié)論 金針菇和黑木耳均具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用和抗氧化作用，金針菇的藥理活性優(yōu)于黑木耳。

金針菇；黑木耳；抗腫瘤活性；抗氧化活性

食用菌是指能形成大型的肉質(zhì)(或膠質(zhì))子實(shí)體或菌核類組織的一類大型真菌[1]。其中金針菇和黑木耳等食用菌因其含有豐富的氨基酸、維生素、纖維素、多種微量元素和多糖等營養(yǎng)成分和生物活性成分，使其具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，成為百姓餐桌上不可多得的美味佳肴[2-4]。研究結(jié)果顯示，金針菇和黑木耳具有抗腫瘤、消除自由基，抗輻射，調(diào)節(jié)免疫、降血糖和降血脂等生理功能[5-7]。本文主要對金針菇和黑木耳的醇提物的抗腫瘤活性與抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在為指導(dǎo)人們合理膳食，開發(fā)新型食用菌功能食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試細(xì)胞株：MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞株)，Hela(人宮頸癌細(xì)胞株)，A375(黑色素瘤細(xì)胞株)購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 金針菇(F.velutipes)和黑木耳(A.auricula)購于四川省宜賓市食用菌加工有限公司。

1.1.3 試劑：RPMI-1640、新生牛血清購自Gibco公司；四氮唑藍(lán)(MTT)購于Sigma公司；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金針菇和黑木耳醇提取物的制備[8]：分別稱取一定量的金針菇和黑木耳，以95%乙醇為溶劑，用索氏提取器回流抽提8 h后，將提取液濃縮并制成干粉，用無水乙醇配制成一定濃度的母液，0.22 μm濾器過濾備用。

1.2.2 金針菇和黑木耳醇提物對MCF-7，Hela和A375細(xì)胞的抑制作用：用胰酶將培養(yǎng)至對數(shù)期的MCF-7，Hela和A375細(xì)胞消化處理，制備單細(xì)胞懸液(5×104/mL)。以每孔100 μL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h貼壁后加入10 μL食用菌醇提物，使其終濃度依次為25、50、100、200和400 μg/mL，作用24 h，后棄去培養(yǎng)基，每孔加入20 μL MTT，孵育3～4 h，吸去孔內(nèi)上清液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm下的吸收值，計(jì)算藥物抑制率和食用菌對三種腫瘤細(xì)胞的IC50值。以不加食用菌只加培養(yǎng)基為空白組，以食用菌醇提物0 μg/mL的作用濃度為對照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率(%)=1-(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)。

1.2.3 金針菇和黑木耳醇提物對DPPH·自由基清除率的測定[10]：于EP管中加入2 mL兩種食用菌無水甲醇溶液和DPPH無水乙醇溶液[9]，使兩種食用菌的終濃度分別為0.2、0.4、0.8和1.6 mg/mL，混勻后避光孵育35 min，用分光光度計(jì)測定517 nm下的吸光值，按照下列公式計(jì)算清除率。以不加食用菌為空白組，以食用菌醇提物0 μg/mL的作用濃度為對照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。清除率(%)=1-[(A2-A0)/A1]×100。A0為樣品液的本底值，A1為空白對照的吸光值；A2為加入食用菌溶液的吸光值。

1.2.4 金針菇和黑木耳醇提物總抗氧化能力的測定：采用FRAP法測定[10]。在EP管中加入4mL FRAP工作液(由0.1 mol/L醋酸緩沖液，10 mmol/L TPTZ和20 mmol/L三氯化鐵溶液，按照10:1:1的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)和1 mL 2種食用菌無水甲醇溶液，使食用菌終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL。37 ℃避光孵育12 min，用分光光度計(jì)測定593 nm下的吸光值。以不加食用菌只加助溶劑為空白組，以食用菌醇提物0 μg/mL的作用濃度為對照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4毫摩爾數(shù)表示，定義為FRAP值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組內(nèi)比較用單因素方差分析，組間用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金針菇和黑木耳醇提物對3種腫瘤細(xì)胞的抑制作用 MTT結(jié)果顯示，金針菇和黑木耳醇提物均能抑制MCF-7，Hela和A375細(xì)胞的增殖，且呈濃度劑量依賴性，見圖1。其中400 μg/mL的金針菇醇提物對3種腫瘤細(xì)胞的抑制作用均優(yōu)于黑木耳，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，400 μg/mL的金針菇和黑木耳對MCF-7細(xì)胞的抑制率分別為48.20%和37.62%(P<0.01)，IC50分別為0.37 mg/mL和0.67 mg/mL;對Hela細(xì)胞的抑制率分別52.61%和50.21%(P<0.05)，IC50分別為0.20 mg/mL和0.28 mg/mL;對A375細(xì)胞的抑制率分別為50.58%和41.59%(P<0.01)，IC50分別為0.39 mg/mL和0.57 mg/mL。

圖1 金針菇和黑木耳醇提物的抗腫瘤作用*P<0.05，與對照組相比Fig.1 Anti-tumor activity of ethanol extracts of F.velutipes and A.auricula(±s)*P<0.05, compared with control group

2.2 金針菇和黑木耳醇提物的抗氧化活性結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金針菇和黑木耳醇提物均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其中金針菇的抗氧化能力優(yōu)于黑木耳，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。DPPH·自由基清除率結(jié)果顯示，1.6mg/mL的金針菇和黑木耳醇提物對DPPH·自由基的清除率分別為60.30%和40.43%，顯著高于對照組(P<0.01)，IC50分別為1.2 mg/mL和2 mg/mL見圖2A。FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，其濃度在0.1～1.6 mmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，y=0.303 7x+0.003 6，R2=0.999 9。當(dāng)金針菇和黑木耳的濃度為1.6 mg/mL時(shí)，F(xiàn)RAP值分別為9.5 mmol/mL和7.0 mmol/mL，顯著高于對照組(P<0.01)，見圖2B。

圖2 金針菇和黑木耳醇提物的抗氧化作用*P<0.05，與對照組相比Fig.2 Antioxidant activity of ethanol extracts of F.velutipes and A.auricula (±s)*P<0.05, compared with control group

3 討論

我國中醫(yī)認(rèn)為，許多食物和藥物一樣具有防治疾病的作用[11]。其中食用菌以其可食、可藥、可補(bǔ)的良好特性，被列入中國居民膳食指南，成為21世紀(jì)人們首選的健康食品之一[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金針菇和黑木耳對MCF-7，Hela和A375細(xì)胞的增殖均有顯著的抑制作用，且呈濃度劑量依賴性。目前的研究結(jié)果顯示，食用菌的抗腫瘤功效成分主要為多糖[13-14]，而金針菇除多糖外，有研究顯示其功效成分還包括火菇素[15]，火菇素是金針菇中一種結(jié)構(gòu)簡單的堿性蛋白質(zhì)，具有抗癌活性與增強(qiáng)免疫等功能。

研究表明，人們衰老以及罹患癌癥等疾病大都與體內(nèi)產(chǎn)生的過量自由基有關(guān)[16]。但人體因呼吸、放射線照射和環(huán)境污染等因素的影響，不可避免地會在機(jī)體內(nèi)持續(xù)的產(chǎn)生自由基，因此能夠抗氧化的保健食品備受人們推崇，也是醫(yī)療、保健品和化妝品企業(yè)的研究方向之一[16]。測定抗氧化活性的方法很多，本文采用DPPH法和FRAP法對金針菇和黑木耳的抗氧化活性進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示，兩種食用菌均有自由基清除活性和還原能力，其中金針菇的抗氧化活性優(yōu)于黑木耳。由于金針菇和黑木耳既具有較高的營養(yǎng)價(jià)值又具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用和抗氧化作用，因此經(jīng)常食用金針菇和黑木耳等食用菌，可防病治病、增進(jìn)人們的體質(zhì)，在促進(jìn)人類健康方面發(fā)揮著重要的作用。關(guān)于這兩種食用菌發(fā)揮作用的活性成分和藥理作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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(編校：師維康)

Compare anti-tumor activity and antioxidant activity ofF.velutipesandA.auricula

WANG Lu?, LIU Ming-Yue?, XIE Kun-Peng, XIE Ming-JieΔ

(College of Life Sciences, Liaoning Normal University, Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery of Liaoning Province, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo compare the anti-tumor activity and antioxidant activity of ethanol extracts ofF.velutiesandA.auricula.MethodsThree human carcinoma cell lines, including MCF-7, HeLa and A375 were assessed by MTT assay to measure cell viability.The antioxidant activity was detected with a DPPH and RFAP assays.ResultsTwo domestic fungus have different anti-tumor activity on the inhibition of MCF-7, HeLa and A375 cells at 25-400 μg/mL concentration rage.F.velutipeswas better than theA.auricula.The difference was statistically significant (P<0.05).Compared with the control group, the inhibition ofF.velutipeswere 48.20%, 52.61%and 50.58%at the concentration of 400 μg/mL, respectively (P<0.01).At the same concentration, the inhibition ofA.auriculawere 37.62%、50.21%and 41.59%, respectively (P<0.01).The ethanol extracts of two domestic fungus have significant antioxidant activity.F.velutipeswas better than theA.auricula.The difference was statistically significant (P<0.01).Compared with the control group, the scavenging radical capacities on DPPH of ethanol extracts ofF.velutipesandA.auriculawere 60.30%and 40.43%at the concentration of 1.6 mg/mL, respectively (P<0.01).At the same concentration FRAP value were 9.5 and 7.0 mmol/mL(P<0.01).ConclusionTheF.velutipesandA.auriculaboth have strong anti-tumor and antioxidant activities,F.velutipesis better thanA.auricula.

F.velutipes;A.auricula; anti-tumor activity; antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.011

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610165042)；省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610165000042)；遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(L201683675)

汪璐，女，學(xué)士在讀，研究方向：生物科學(xué)，E-mail：1796245927@qq.com；劉明月，共同第一作者，女，碩士在讀，研究方向：微生物生化，E-mail：liumymoon@163.com；謝明杰，通信作者，女，博士，教授，研究方向：微生物生化，E-mail：xmj1222@sina.com。

S646.1+5；S646.6；R979.1

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