線粒體應(yīng)激蛋白在腦缺血再灌注損傷中的表達及意義

劉思言,毛　穎,姜現(xiàn)瑞,馬鶴銘,王心雪,孫連坤,康勁松*

(1.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021;2.吉林大學(xué) 病理生理學(xué)系,吉林 長春130021)

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線粒體應(yīng)激蛋白在腦缺血再灌注損傷中的表達及意義

劉思言1,毛穎2,姜現(xiàn)瑞2,馬鶴銘1,王心雪2,孫連坤2,康勁松2*

(1.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021;2.吉林大學(xué) 病理生理學(xué)系,吉林 長春130021)

腦缺血半暗帶區(qū)是指由于腦缺血所致的腦細胞點活動停止，功能喪失但形態(tài)結(jié)構(gòu)仍然保持完整的組織，位于嚴(yán)重缺血中心區(qū)中衛(wèi)的低灌注區(qū)，具有可逆性及可變性，可轉(zhuǎn)化為正常灌注區(qū)或梗死區(qū)[1]。大量動物實驗表明，缺血灶的中心區(qū)域以神經(jīng)元的壞死為主而缺血半暗帶區(qū)以凋亡為主[2,3]。但最新的研究表明，在線粒體應(yīng)激中，線粒體中非折疊蛋白的增加遠早于細胞凋亡[4]，線粒體非折疊蛋白的增加是其產(chǎn)生毒性作用前的一個廣泛存在的應(yīng)激反應(yīng)，并可剝奪細胞能量、控制細胞死亡[5]。目前尚未見線粒體應(yīng)激相關(guān)蛋白與不同腦缺血程度關(guān)系的報道。

因此，本研究的目的通過線栓法建立大鼠大腦中動脈栓塞模型，在此基礎(chǔ)上檢測腦缺血灌注損傷后不同時間點缺血半暗帶線粒體應(yīng)激相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達，探討線粒體應(yīng)激在腦缺血再灌注損傷過程中的作用，為腦缺血再灌注損傷中的半暗帶形成及調(diào)控提供理論依據(jù)和新的作用靶點。

1材料與方法

1.1實驗動物

Wistar大白鼠，雄性，體重250-300 g，購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證號：SYXK(吉)2013-0003。取大鼠40只，隨機分成4組，每組10只。分別為假手術(shù)對照組，缺血1 h再灌24 h組(1 h)，缺血1.5 h再灌24 h組(1.5 h)，缺血3 h再灌24 h組(3 h)。

1.2主要試劑與儀器

ClpP、cleaved-caspase3、β-actin抗體購自美國Santa cruz公司，二抗購自美國 Pierce 公司。ECL發(fā)光試劑盒購自上海碧云天公司?；瘜W(xué)發(fā)光顯影系統(tǒng)購自英國 Synene 公司；-80℃低溫冰箱由日本SANYO公司生產(chǎn)。

1.3大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)模型的制備

利用本室常規(guī)方法制備大鼠MCAO模型[6]，根據(jù)不同缺血時間在相對應(yīng)時間后將大鼠顱內(nèi)的線栓拔出，恢復(fù)血流進行再灌注，時間為24 h。假手術(shù)組，線栓不插入顱內(nèi)，其余操作同上。以動物清醒后爬行時右轉(zhuǎn)圈,提尾時右前肢內(nèi)收屈曲為入選標(biāo)準(zhǔn)。24 h后斷頭處死各組動物，迅速分離半暗帶大腦皮質(zhì)[7]，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4HE染色

24 h后用10%水合氯醛將其麻醉，將胸廓剪開，暴露心臟，把灌注針頭經(jīng)左心室刺入至主動脈，用止血鉗加以固定，然后剪開右心房，先用生理鹽水對其進行快速灌注沖洗直至肝臟變白，然后用4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)對其進行灌注固定，最后將大鼠斷頭，取出完整大腦，并放置于4%多聚甲醛中固定24 h。用常規(guī)方法經(jīng)過脫水、透明、包埋和切片制作石蠟切片，接著進行HE染色，封片，光鏡下進行觀察。

1.5Western Blot檢測腦組織應(yīng)激相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達

按1 ml/100 mg的量加入組織裂解液，提取大腦皮層總蛋白。采用Bio-Rad法測定蛋白濃度，取30 μg上樣，配制12%聚丙烯酰胺凝膠，采用恒壓100V跑電泳，并用恒壓100V將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，之后用10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用兔源的ClpP、cleaved-caspase3及內(nèi)參蛋白β-actin多克隆抗體作為一抗，4℃封閉過夜。隔天用含吐溫的Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)洗膜3次，每次10 min；之后加山羊抗兔二抗，在搖床室溫封閉孵育2 h，TBST再一次洗膜3次，每次10 min，最后用ECL發(fā)光液沖洗，在化學(xué)發(fā)光顯影系統(tǒng)中進行顯色，并做灰度值分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

2結(jié)果

2.1局造性腦缺血對大鼠腦皮質(zhì)損傷的影響

大鼠大腦HE染色結(jié)果表明，腦缺血1 h再灌注24 h，缺血側(cè)大腦皮質(zhì)出現(xiàn)典型的紅色樣變神經(jīng)元，表現(xiàn)為細胞核固縮，胞體縮小變形，胞漿呈深伊紅色；缺血1.5 h再灌注24 h，缺血側(cè)大腦皮質(zhì)濃染細胞明顯增多，細胞周圍間隙增寬，腦組織結(jié)構(gòu)稀疏；缺血3 h再灌24 h，腦缺血側(cè)大腦神經(jīng)細胞發(fā)生核溶解，核消失，腦組織結(jié)構(gòu)更加稀疏，正常神經(jīng)結(jié)構(gòu)消失。說明隨著缺血時間延長腦損傷加重且腦梗死面積變大。

圖1　大鼠腦皮質(zhì)組織病理學(xué)改變

2.2局造性腦缺血對線粒體應(yīng)激蛋白及凋亡相關(guān)關(guān)蛋白表達的影響

Westernblot結(jié)果表明，凋亡蛋白cleaved-caspase3隨著缺血時間的延長，表達量逐漸升高，而線粒體應(yīng)激蛋白ClpP在缺血1.5 h時表達量升至最高，缺血3 h有所下降。見圖2。

3討論

腦缺血半暗帶理論的提出，改變了缺血腦組織無法挽救的舊觀點。半暗帶決定著梗塞灶的大小，決定患者的康復(fù)質(zhì)量，其特殊的臨床意義使它成為腦缺血和腦保護作用的研究熱點之一。因此，缺血性腦血管病治療的關(guān)鍵在于及時挽救缺血半暗帶尚未死亡的神經(jīng)元。

*P<0.05 與假手術(shù)組相比 L：代表腦缺血損傷側(cè)；R：代表未損傷側(cè)

圖2大腦皮質(zhì)凋亡蛋白與線粒體應(yīng)激蛋白的表達

線粒體應(yīng)激主要反應(yīng)在線粒體內(nèi)非折疊蛋白增加。線粒體未折疊蛋白應(yīng)答反應(yīng)(mitochondrial unfolded protein response,UPRmt)是指由線粒體-細胞核信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路所誘導(dǎo)的線粒體保護性基因包括線粒體分子伴侶和蛋白酶重建線粒體蛋白折疊環(huán)境中蛋白的穩(wěn)態(tài)。目前認為線粒體應(yīng)激過程包括三個層面，伴侶蛋白的改變及對氧化應(yīng)激、線粒體損害的防御作用；線粒體蛋白酶的降解和損傷；線粒體功能障礙。因此，從線粒體應(yīng)激角度出發(fā)探討其與半暗帶的關(guān)系，及時調(diào)控線粒體應(yīng)激有望成為減輕腦損傷反應(yīng)的重要途徑。

再灌注后神經(jīng)細胞的命運主要取決于缺血時間的長短，目前大多數(shù)人認為腦缺血后再灌注治療時間窗在2-4小時之間[8]。因此，本實驗我們采用了1小時、1.5小時和3小時3個不同缺血時間點復(fù)制腦缺血再灌注模型。

本實驗HE結(jié)果證明，隨著缺血時間延長，大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元逐漸失去其正常形態(tài)，腦損傷逐漸加重。進一步的Western Blot結(jié)果顯示，活化的凋亡蛋白cleaved-caspase3隨著缺血時間的延長，表達量逐漸升高，在缺血3 h時表達最強，說明凋亡參與了半暗帶的形成。但是線粒體應(yīng)激相關(guān)蛋白ClpP則出現(xiàn)先增高后降低，在缺血1.5 h時表達最強，早于3 h時表達最強的cleaved-caspase3。UPRmt是維持線粒體自身穩(wěn)態(tài)的重要因素，它通過ClpP產(chǎn)生蛋白片段作為危險信號，激活PKR(Protein kinase RNA-activated)，進而磷酸化elF2α，阻止蛋白翻譯，并促進核編碼的線粒體分子伴侶HSP60等的產(chǎn)生[9]。ClpP表達升高說明在大鼠腦缺血再灌發(fā)生腦損傷時，線粒體應(yīng)激反應(yīng)也早于細胞凋亡，對腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)凋亡可起到防御作用。

綜上所述，腦缺血再灌注損傷過程中線粒體應(yīng)激反應(yīng)早于細胞凋亡，因此及時調(diào)控線粒體應(yīng)激有望成為減輕腦損傷反應(yīng)的重要途徑。

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[9]Rath E,Berger E,Messlik A,et al.Induction of dsRNA-activated protein kinase links mitochondrial unfolded protein response to the pathogenesis of intestinal inflammation[J].Gut，2012,61(9):1269.

基金項目:吉林大學(xué)白求恩前沿交叉學(xué)科創(chuàng)新項目(No.2013101003)；吉林大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃”項目(No.2014A79352); 吉林省衛(wèi)生廳項目(No.20132068);吉林省科技廳項目(No.20150414026GH)

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)06-0890-03

(收稿日期：2015-12-18)