CD4/CD45雙色單平臺(tái)法檢測(cè)HIV感染者CD4+T淋巴細(xì)胞研究進(jìn)展

許亞寧，張　輝，肖　瑤

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·專題綜述·

CD4/CD45雙色單平臺(tái)法檢測(cè)HIV感染者CD4+T淋巴細(xì)胞研究進(jìn)展

許亞寧，張輝，肖瑤

［摘要］CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)是評(píng)價(jià)AIDS疾病進(jìn)展和抗病毒治療效果的重要指標(biāo)。本文介紹了流式細(xì)胞儀CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的發(fā)展歷史。將CD4/CD45雙色單平臺(tái)法的準(zhǔn)確性、可靠性和經(jīng)濟(jì)性與其他方法進(jìn)行了比較。表明該法簡(jiǎn)便、廉價(jià)且實(shí)用性強(qiáng)。同時(shí)介紹了當(dāng)前適用于CD4/CD45雙色單平臺(tái)法的幾款流式細(xì)胞儀的機(jī)型特點(diǎn)。

［關(guān)鍵詞］HIV；CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)；抗原，CD45；流式細(xì)胞術(shù)

DOI∶ 10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.014

HIV感染引起的AIDS是世界性公共健康問題［1］。根據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention， CDC）2015年調(diào)查統(tǒng)計(jì)，世界約有3690萬人攜帶HIV，累計(jì)約有7600萬人感染HIV，3900萬人死于AIDS，僅2014年死亡人數(shù)就超過120萬人［2］。HIV感染的典型特征是CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，T淋巴細(xì)胞功能受損和機(jī)體免疫功能缺陷。2014年5月更新的《HIV-1感染的成年人和青少年的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物使用指南》中將CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)作為AIDS檢測(cè)的重要標(biāo)準(zhǔn)。一直以來，研究人員使用傳統(tǒng)的雙平臺(tái)三色以上熒光抗體染色法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)，但是這些方法檢測(cè)費(fèi)用昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、人員和檢測(cè)樣本要求較高，不適宜進(jìn)行高通量的HIV檢測(cè)。隨著科技的發(fā)展，新興的CD4/CD45雙色流式細(xì)胞儀單平臺(tái)法檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞不僅操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，而且準(zhǔn)確性高，能夠作為標(biāo)準(zhǔn)方法廣泛推廣。

1　CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的發(fā)展

CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)始于20世紀(jì)90年代，采用雙平臺(tái)法，使用血液分析儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞總數(shù)，使用流式細(xì)胞儀CD3/CD4或CD3/CD4/CD45抗體檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞所占淋巴細(xì)胞百分比，由此計(jì)算出CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)［3］。1996年O’Gorman和Gelman［4］提出使用流式細(xì)胞儀單平臺(tái)法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)。單平臺(tái)法是指通過一臺(tái)流式細(xì)胞儀直接檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)數(shù)量，計(jì)數(shù)原理包括直接體積計(jì)數(shù)、內(nèi)參照微球計(jì)數(shù)、毛細(xì)管計(jì)數(shù)、阻抗法計(jì)數(shù)和推進(jìn)器容積計(jì)數(shù)等，但由于技術(shù)手段問題，淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性略顯不足。鑒于各種方法的不統(tǒng)一性，1997年美國(guó)CDC更新CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)指導(dǎo)方針，推薦用雙平臺(tái)法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)［5］。此法不足之處在于：①不同操作者和不同操作方式得出不同的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果；②無法進(jìn)行兩臺(tái)設(shè)備間的質(zhì)控和室間質(zhì)控；③血液分析儀中的淋巴細(xì)胞定義有異于流式細(xì)胞儀中的淋巴細(xì)胞，造成系統(tǒng)差異；④多種抗體和消耗品的使用導(dǎo)致成本偏高。2002年Glencross等［6］提出CD4/CD45雙色法：使用CD45輔助白細(xì)胞設(shè)門法，基于白細(xì)胞而不是單純的淋巴細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門，由血液分析儀的白細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞儀的CD4+T淋巴細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)計(jì)算出CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量。隨后，加拿大CDC于2003年頒布了單平臺(tái)CD45輔助白細(xì)胞設(shè)門法的CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)指導(dǎo)方針，對(duì)雙色單平臺(tái)法進(jìn)行詳述和推薦［7］。至此，CD4/CD45雙色單平臺(tái)法測(cè)定CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)趨于成熟穩(wěn)定。

CD4/CD45雙色單平臺(tái)法通過設(shè)門的方法測(cè)定CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)和相對(duì)計(jì)數(shù)。首先，在CD45/SSC（side scatter，側(cè)向角散射）散點(diǎn)圖中調(diào)整SSC和CD45（圖1），使所有白細(xì)胞群均可見，并圈定白細(xì)胞群（R3），其次，根據(jù)白細(xì)胞群（R3）設(shè)門再設(shè)定CD4/SSC散點(diǎn)圖，通過設(shè)門將表達(dá)CD4的陽性淋巴細(xì)胞亞群（R1）和CD4陰性淋巴細(xì)胞亞群（R2）進(jìn)行區(qū)分，CD4弱表達(dá)的單核細(xì)胞干擾可通過其在SSC坐標(biāo)的位置進(jìn)行區(qū)分，并通過修改SSC坐標(biāo)進(jìn)行調(diào)整。CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)由R1得出，CD4細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)為CD4+/CD45+比值，也叫做CD4+T淋巴細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)百分率［8］。

圖1　CD4/CD45雙色單平臺(tái)法CD4+ T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)Figure 1 CD4/CD45 two-color single-platform protocol for CD4+T lymphocyte enumeration

2　單平臺(tái)雙色和多色免疫分型的比較

許多指導(dǎo)手冊(cè)提出，使用流式細(xì)胞儀對(duì)HIV感染者進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)必須加強(qiáng)質(zhì)量控制，增強(qiáng)數(shù)據(jù)可靠性［9］。策略包括增加CD3抗體的使用，同時(shí)具有CD4和CD3雙陽性的淋巴細(xì)胞，才被認(rèn)為是有指導(dǎo)意義的輔助性T淋巴細(xì)胞。美國(guó)國(guó)家過敏和傳染病研究所AIDS分所建議使用多色抗體組合的方法，例如使用CD3/CD4確定T淋巴細(xì)胞/輔助性T淋巴細(xì)胞群；使用CD3/CD8確定T淋巴細(xì)胞/抑制性T淋巴細(xì)胞群。在多色抗體組合方案中對(duì)CD3陽性細(xì)胞的重復(fù)性有要求，重復(fù)結(jié)果差異應(yīng)≤3％，如果＞3％，說明樣本的管間變異較大，建議重新檢測(cè)此樣本。一般來講，成年人外周血中CD4+CD3+T淋巴細(xì)胞和CD8+CD3+T淋巴細(xì)胞百分比的總和應(yīng)該等于CD3+T淋巴細(xì)胞的百分比，變化范圍為5％～10％，如果超出此變化范圍，須要考慮其他因素，例如樣本中可能大量存在異常T淋巴細(xì)胞亞群。

CD4/CD45雙色法建立之初，關(guān)于HIV感染者中CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)采用雙色法或多色法分析具有爭(zhēng)議，CD4/CD45法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性成為研究?jī)?nèi)容。Pattanapanyasat等［10］對(duì)611例HIV感染者樣本使用CD4/CD45雙色和CD3/CD4 /CD45三色法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，2種方法的CD4+T淋巴細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)差異為0.03％。與三色法相比，雙色法檢測(cè)成本由12美元降低至2.5美元。Sippy-Chatrani 等［11］使用150例HIV感染者血液樣本比較CD4/CD45雙色法與CD3/CD4/CD8/CD45四色法CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，2種方法測(cè)量所得CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)和相對(duì)計(jì)數(shù)具有高度一致性（r2=0.95、0.98），無顯著偏差，測(cè)試成本由25美元節(jié)約至8美元。由于操作簡(jiǎn)便，對(duì)研究人員技術(shù)要求低，結(jié)果準(zhǔn)確，可重復(fù)性高以及成本低廉，CD4/CD45雙色法不再局限于資源緊張或者疾病的高發(fā)地區(qū)，逐漸引起廣泛的關(guān)注。2008年Denny等［12］使用不同品牌流式細(xì)胞儀對(duì)99 例HIV感染者樣本進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)檢測(cè)，用以評(píng)估CD4/CD45雙色法與四色法的精確性。研究表明，CD4/CD45雙色法數(shù)據(jù)一致性和精確性均高于傳統(tǒng)的四色法。推薦所有臨床和科研機(jī)構(gòu)，特別是進(jìn)行大批量樣本處理的機(jī)構(gòu)，使用此方法提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和可重復(fù)性。與此同時(shí)，我國(guó)學(xué)者也對(duì)CD4/CD45法進(jìn)行評(píng)估，旨在評(píng)價(jià)樣本采集后不同放置時(shí)間是否影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。結(jié)果表明CD4/CD45法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、重復(fù)性好、誤差小，對(duì)于陳舊樣本（采集后不超過6 d）的分析有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)［13］。CD4/CD45雙色法與多色法在CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)檢測(cè)方面具有較高的一致性，而且大大降低測(cè)試成本，尤其適合我國(guó)國(guó)情。

3　CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)單平臺(tái)法與雙平臺(tái)法的比較

與傳統(tǒng)的雙平臺(tái)CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)法相比，CD4/CD45單平臺(tái)法自創(chuàng)建起就備受爭(zhēng)議。1999 年Barnett等［14］使用三種單平臺(tái)系統(tǒng)（FlowCount/ Beckman Coulter、 TruCount/Becton Dickinson、CytoronAbsolute/Ortho Clinical Diagnostics）進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)檢測(cè)，并與CD4/CD45雙平臺(tái)法進(jìn)行比較。對(duì)于固定血液樣本，單平臺(tái)法的相關(guān)性優(yōu)于雙平臺(tái)法（CV值分別為13.7％和23.4％），出于對(duì)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的考慮，作者建議使用單平臺(tái)法。文章指出，使用計(jì)數(shù)微球進(jìn)行體積測(cè)定的操作中，不同的操作手法會(huì)造成較大差異性，某些材質(zhì)的計(jì)數(shù)微球也會(huì)由于形成多聚體造成結(jié)果偏差。2002年，Glencross等［15］使用CD4/CD45雙色雙平臺(tái)和單平臺(tái)法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種方法的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)具有良好的一致性（r=0.94），單平臺(tái)體積法和微球法不僅具有高度準(zhǔn)確性，而且可以進(jìn)行內(nèi)部控制和外部控制，能夠作為標(biāo)準(zhǔn)的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)方法進(jìn)行使用。同年，Janossy 等［16］使用單平臺(tái)體積法和微球法對(duì)600例樣本進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)。與雙平臺(tái)法比，2種單平臺(tái)法均保證了結(jié)果的準(zhǔn)確度，并可降低93％的試劑成本。2006年，Karcher等［17］使用兩種單平臺(tái)法［Cyto-Spheres /Beckman Coulter和 CyFlow Counter/Partec （CD4/CD45）］進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)檢測(cè)，并與雙平臺(tái)雙色法（FACScan/ Becton Dickinson）進(jìn)行比較。結(jié)果證明，使用絕對(duì)體積真實(shí)計(jì)數(shù)的CyFlow Counter避免了CytoSpheres使用計(jì)數(shù)微球造成的誤差，在準(zhǔn)確度和相關(guān)性上，CyFlow Counter均比CytoSpheres效果好（r = 0.929、0.725）。此外，CyFlow Counter由于價(jià)格低廉（1.75～2.00歐元/樣本），操作簡(jiǎn)單，結(jié)果快速（10樣本/h），尤為推薦在經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)使用。隨著科技發(fā)展，單平臺(tái)法以其簡(jiǎn)便的操作，高度的準(zhǔn)確性和一致性，已經(jīng)逐漸替代雙平臺(tái)法成為主要的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)方法。

4　目前采用單平臺(tái)法CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)常用機(jī)型

隨著科技的發(fā)展，許多商業(yè)化的單平臺(tái)技術(shù)被大力研發(fā)和廣泛使用，表1例舉了一些常見的可使用CD4/CD45法的流式細(xì)胞儀品牌機(jī)型。以下選取部分代表性機(jī)型進(jìn)行討論。 CyFlow Counter 和CyFlow miniPOC（Point of Care）是由德國(guó)Partec公司生產(chǎn)的桌面式流式細(xì)胞儀，配備有532 nm的綠色固態(tài)激光，3個(gè)光學(xué)信號(hào)通道，可使用CD4/ CD45雙色法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)［18］。系統(tǒng)使用機(jī)械方法進(jìn)行體積測(cè)量，省去微球的使用直接計(jì)算進(jìn)樣體積，減少任何與微球濃度變化相關(guān)的誤差。由于系統(tǒng)精準(zhǔn)性較高，對(duì)操作者技術(shù)要求較低，適用于偏遠(yuǎn)地區(qū)或者患者分散地區(qū)，每日最大檢測(cè)量為400個(gè)樣本。FACSCalibur是Becton Dickinson為常規(guī)免疫表型分析所研制的一款流式細(xì)胞儀，儀器最多可配備488 nm藍(lán)色和635 nm紅色氣態(tài)激光，可使用CD4/CD45設(shè)門法和微球計(jì)數(shù)法對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)［19］。樣本制備至檢測(cè)需要1 h左右，對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求低，適用于每日樣本量小于50的實(shí)驗(yàn)室。Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀是Beckman Coulter研制的產(chǎn)品，配備488 nm藍(lán)色激光器，可檢測(cè)5種熒光通道［20］。儀器可使用CD4/CD45設(shè)門法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)，通過微球法進(jìn)行體積定量。樣本檢測(cè)需100 μl全血，樣本準(zhǔn)備需1 h左右。EPICS XL流式細(xì)胞儀是Beckman Coulter的產(chǎn)品，最多檢測(cè)四色熒光，配合使用計(jì)數(shù)微球和相關(guān)抗體可檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)。BriCyte E6系統(tǒng)是邁瑞公司研發(fā)的中國(guó)第一款流式細(xì)胞儀，其配備488 nm藍(lán)色激光和638 nm紅色激光，可檢測(cè)6種熒光通道。使用計(jì)數(shù)微球和CD4/CD45設(shè)門法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)檢測(cè)。由于體積較大，不便于搬運(yùn)攜行，適合高通量樣本檢測(cè)的醫(yī)療科研機(jī)構(gòu)，并須配備專業(yè)操作人員。

5　展　　望

我國(guó)自1985年發(fā)現(xiàn)首例AIDS患者以來，HIV/ AIDS在我國(guó)已經(jīng)歷傳入期和局部流行期，進(jìn)入了快速增長(zhǎng)期，并且正由高危人群向一般人群傳播，HIV未能確診及晚期診斷是目前我國(guó)存在的典型問題。診斷時(shí)，外周血CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)是預(yù)測(cè)短期和長(zhǎng)期病死率的一項(xiàng)強(qiáng)有力的指標(biāo)，目前由于我國(guó)大部分病例處于農(nóng)村和邊遠(yuǎn)地區(qū)，離體24 h內(nèi)的新鮮標(biāo)本較難得到［21-22］，為CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)提出挑戰(zhàn)。CD4/CD45法采用基于白細(xì)胞的設(shè)門方案，利用CD4、CD45 和側(cè)向散射光3個(gè)參數(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞亞群免疫表型分析， 避免了傳統(tǒng)方法中根據(jù)淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)和CD4+T淋巴細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)確定CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量時(shí)淋巴細(xì)胞這一關(guān)鍵因素不易質(zhì)控的棘手問題，同時(shí)提高了長(zhǎng)距離運(yùn)輸及長(zhǎng)時(shí)間放置樣本檢測(cè)結(jié)果的可靠性。因此，CD4/CD45法對(duì)HIV感染人群， 尤其是農(nóng)村和邊遠(yuǎn)地區(qū)HIV感染人群，在疾病病程監(jiān)控、治療以及療效評(píng)價(jià)等方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

表1　CD4/CD45單平臺(tái)CD4+ T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)不同系統(tǒng)Table 1 Different brands for flow cytometry using single-platform protocol for CD4+T lymphocyte enumeration

綜上所述，CD4/CD45單平臺(tái)法檢測(cè)HIV感染者的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、適用性強(qiáng)［23］，有助于了解機(jī)體的免疫狀態(tài)以確定疾病分期、檢測(cè)疾病進(jìn)程、評(píng)估疾病預(yù)后以及評(píng)估抗病毒治療療程等，能夠作為我國(guó)臨床檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行推廣。

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（2015-10-14 收稿 2015-11-08 修回）

（責(zé)任編委 李 軍 本文編輯 盧福昱）

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］［中國(guó)圖書資料分類號(hào)］ R392.12；R512.91 A

［文章編號(hào)］1007-8134（2016）03-0176-05

*Corresponding author， E-mail： xiaoyao@chinaaids.cn

［作者單位］730000 蘭州，甘肅省疾病預(yù)防控制中心（許亞寧）；102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心（張輝、肖瑤）

［通訊作者］肖瑤， E-mail∶ xiaoyao@chinaaids.cn

Research advances in CD4+T lymphocyte enumeration using two-color CD4/CD45 single-platform protocol in HIV-infected patients

XU Ya-ning， ZHANG Hui， XIAO Yao*
Gansu Center for Disease Control and Prevention， Lanzhou， Gansu 730000， China

［Abstract］CD4+T lymphocyte count is regarded as a major marker for evaluating disease progression and antiretroviral therapy efficacy in HIV-infected individuals. In this review， the authors introduce the development of CD4+T lymphocyte enumeration using flow cytometry， and compare CD4/CD45 two-color single-platform protocol with other protocols in terms of accuracy， reliability and economics. CD4/CD45 two-color single-platform protocol is considered to be convenience， cheap and practical. In addition， the authors introduce specific characteristics and performance of various kinds of flow cytometers using CD4/CD45 two-color single-platform protocol for CD4+T lymphocyte enumeration.

［Key words］HIV； CD4 lymphocyte count； antigens， CD45； flow cytometry