60℃加熱1小時(shí)滅活病毒方法對(duì)常規(guī)臨床檢測(cè)指標(biāo)的影響研究

李曉東，廖　昊，劉　妍，李　樂，陳容娟，李　奇，陳　麗，黃鵬宇，王學(xué)晶，徐東平

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60℃加熱1小時(shí)滅活病毒方法對(duì)常規(guī)臨床檢測(cè)指標(biāo)的影響研究

李曉東，廖昊，劉妍，李樂，陳容娟，李奇，陳麗，黃鵬宇，王學(xué)晶，徐東平

［摘要］目的 基于60 ℃加熱1 h可有效滅活埃博拉病毒的觀點(diǎn)，探討用該條件加熱處理對(duì)常規(guī)臨床檢測(cè)指標(biāo)的影響。方法 對(duì)40例受檢者用枸櫞酸鈉抗凝管和EDTA-K2抗凝管分別采集靜脈血，標(biāo)本分為2份，檢測(cè)未進(jìn)行加熱滅活處理（滅活前）和進(jìn)行了加熱滅活處理（滅活后）樣本的生物化學(xué)、免疫、凝血和血常規(guī)指標(biāo)，比較熱滅活前后各指標(biāo)的差異。結(jié)果 與滅活前相比，滅活后樣本的生物化學(xué)和免疫項(xiàng)目中總蛋白、總膽紅素、肌酐、總膽固醇、甘油三酯、鈉、鉀、氯、C-反應(yīng)蛋白、尿素氮、葡萄糖、HBsAb水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；白蛋白、球蛋白、前白蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和乳酸脫氫酶有較顯著降低，但下降幅度不到80％且滅活前、后數(shù)據(jù)存在相關(guān)性（r＞0.80，P＜0.01），用回歸方程校正后檢測(cè)數(shù)據(jù)仍具有參考價(jià)值；堿性磷酸酶、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶、膽堿酯酶和肌酸激酶的測(cè)定值下降非常明顯（P均＜0.01），且滅活前后2組數(shù)據(jù)無(wú)顯著相關(guān)性。凝血檢測(cè)項(xiàng)目中，D-二聚體在2組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余項(xiàng)目均受到熱滅活嚴(yán)重影響。血常規(guī)項(xiàng)目中，血紅蛋白、白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)在2組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但樣本須要事先稀釋。結(jié)論 60 ℃加熱1 h滅活處理對(duì)部分生物化學(xué)、免疫和血常規(guī)項(xiàng)目無(wú)明顯影響，部分項(xiàng)目檢測(cè)值明顯降低，但其中有6項(xiàng)指標(biāo)經(jīng)校正后仍具參考價(jià)值。

［關(guān)鍵詞］埃博拉病毒屬；臨床試驗(yàn)；檢疫

埃博拉病毒主要通過接觸患者或感染動(dòng)物的血液、體液、分泌物和排泄物等而引起感染，臨床表現(xiàn)主要為突起發(fā)熱、出血和多臟器損害［1］。埃博拉病毒對(duì)化學(xué)藥品敏感，乙醚、去氧膽酸鈉、β-丙內(nèi)酯、福爾馬林、次氯酸鈉等消毒劑可以完全滅活病毒；鈷60照射、γ射線也可使之滅活。該病毒在常溫下較穩(wěn)定，在4 ℃存放1個(gè)月，感染性無(wú)明顯變化，但對(duì)加熱比較敏感，我國(guó)《埃博拉出血熱防控方案》中明確60 ℃加熱1 h或100℃加熱5 min即可滅活［2］。

埃博拉病毒的傳染性強(qiáng)，接觸患者和患者樣本須要高度防護(hù)［3］。對(duì)患者樣本檢測(cè)須在移動(dòng)生物安全防護(hù)三級(jí)（P3）實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，但受限于空間狹小，不適宜在內(nèi)開展臨床常規(guī)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)。由于無(wú)臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)，使患者的治療以及相關(guān)科研工作受到極大影響。如果對(duì)患者血液標(biāo)本在P3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行簡(jiǎn)單地離心和加熱滅活處理，再對(duì)滅活后的血液或血清標(biāo)本在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)，既可解決P3實(shí)驗(yàn)室條件限制，又可消除實(shí)驗(yàn)室工作人員在檢測(cè)中的感染風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過對(duì)樣品加熱60 ℃ 1 h以模擬滅活埃博拉病毒的條件，分析滅活前和滅活后臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的差異，為今后在沒有P3實(shí)驗(yàn)室條件下通過熱滅活病毒開展臨床實(shí)驗(yàn)檢測(cè)提供參考。

1　對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 共40例受檢對(duì)象，其中20例為解放軍第三○二醫(yī)院收治的慢性HBV感染者，20例為健康志愿者。

1.2 儀器 生物化學(xué)項(xiàng)目由日立生物化學(xué)分析儀

（日本）完成檢測(cè)，免疫項(xiàng)目由羅氏化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（日本）完成檢測(cè)，血凝項(xiàng)目由希斯美康血凝分析儀（日本）完成檢測(cè)，血紅蛋白由希斯美康血細(xì)胞分析儀（日本）完成檢測(cè)，血小板和白細(xì)胞由2人分別計(jì)數(shù)各3次，取平均值。加熱滅活采用恒溫水浴箱（中國(guó)上海）中60 ℃放置1 h。

1.3 血液樣品處理方法 對(duì)每例受試對(duì)象分別用枸櫞酸鈉抗凝管和EDTA-K2抗凝管抽取2管外周靜脈血。其中枸櫞酸鈉抗凝管血液樣品進(jìn)行離心后，將血漿平均分成2份，取其中1份樣本進(jìn)行加熱處理，隨后對(duì)2份樣本同時(shí)進(jìn)行生物化學(xué)項(xiàng)目、免疫項(xiàng)目和血凝項(xiàng)目檢測(cè)。將EDTA-K2抗凝管樣品平均分為3組共6份：其中2份用0.9％氯化鈉稀釋5倍以防止加熱過程中血液凝固，取其中1份樣本進(jìn)行加熱處理，隨后對(duì)2份樣本同時(shí)進(jìn)行血紅蛋白檢測(cè)；另外2份用1％草酸銨稀釋20倍破壞血液中的紅細(xì)胞和白細(xì)胞，取其中1份樣本進(jìn)行加熱處理，隨后對(duì)2份樣本同時(shí)進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)；另外2份用3％冰醋酸稀釋20倍溶解血液中的紅細(xì)胞，取其中1份樣本進(jìn)行加熱處理，隨后對(duì)2份樣本同時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4 結(jié)果評(píng)價(jià) 對(duì)滅活前和滅活后的樣本檢測(cè)數(shù)值進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明加熱處理對(duì)該檢測(cè)指標(biāo)無(wú)顯著影響。加熱后檢測(cè)值變化幅度＜5倍，且統(tǒng)計(jì)分析熱滅活前、后兩組的檢測(cè)值有顯著相關(guān)性時(shí)，建立回歸方程校正檢測(cè)結(jié)果。加熱后檢測(cè)值變化幅度5倍以上時(shí)，提示該指標(biāo)不適于加熱后檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16 .0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料呈符合正態(tài)分布，用±s表示，各指標(biāo)熱滅活前后水平差異比較用自身配對(duì)t檢驗(yàn)。對(duì)部分指標(biāo)熱滅活前后水平進(jìn)行直線回歸分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2　結(jié)　　果

2.1 生物化學(xué)和免疫檢測(cè)項(xiàng)目 滅活前組與滅活后組相比，總蛋白、總膽紅素、肌酐、總膽固醇、甘油三酯、鈉、鉀、氯、C-反應(yīng)蛋白、尿素氮、葡萄糖和HBsAb水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；白蛋白、球蛋白、前白蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和乳酸脫氫酶水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01），但2組數(shù)據(jù)存在相關(guān)性（r＞0.80，P＜0.01）；堿性磷酸酶、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶、膽堿酯酶和肌酸激酶的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01），2組數(shù)據(jù)無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。見表1。

2.2 血常規(guī)和凝血檢測(cè)項(xiàng)目 滅活前組與滅活后組相比，血常規(guī)項(xiàng)目血紅蛋白、白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；凝血檢測(cè)項(xiàng)目D-二聚體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余項(xiàng)目如凝血酶原活動(dòng)度、凝血酶原時(shí)間、纖維蛋白原等均受到熱滅活嚴(yán)重影響，無(wú)法得到具體數(shù)值。見表2。

2.3 檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果校正 為了對(duì)熱滅活后檢測(cè)數(shù)值下降5倍以內(nèi)的項(xiàng)目進(jìn)行校正，即用滅活后的檢測(cè)值反推滅活前的檢測(cè)值（真實(shí)值），對(duì)滅活前后的指標(biāo)數(shù)值進(jìn)行直線相關(guān)和回歸分析，得到的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，如表3和圖1所示。

3　討　　論

2014年3月非洲暴發(fā)的埃博拉疫情嚴(yán)重威脅世界公共衛(wèi)生安全［4］。埃博拉病毒易于在人群中傳播，感染后病死率較高，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)將其歸屬于第一類、四級(jí)生物危害等級(jí)的病原微生物［5］。培養(yǎng)埃博拉病毒必須在生物安全四級(jí)實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)須在P3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行［6］。目前我國(guó)和非洲均缺乏P3實(shí)驗(yàn)室，而且很多臨床檢測(cè)項(xiàng)目在P3實(shí)驗(yàn)室中無(wú)法進(jìn)行。對(duì)埃博拉病毒感染患者治療須要監(jiān)測(cè)肝、腎、心功能等生物化學(xué)和免疫指標(biāo)。如果不作任何處理即對(duì)血液進(jìn)行相關(guān)臨床項(xiàng)目檢測(cè)，極易因職業(yè)暴露增加醫(yī)護(hù)工作者感染風(fēng)險(xiǎn)［7］。在檢測(cè)之前先進(jìn)行病毒滅活處理，可消除檢測(cè)人員的職業(yè)暴露危險(xiǎn)。

埃博拉出血熱防控方案明確了60 ℃加熱1 h可徹底滅活埃博拉病毒［2］。在本研究中我們對(duì)血液樣本進(jìn)行了同樣的處理，發(fā)現(xiàn)滅活處理對(duì)總蛋白、總膽紅素、總膽固醇、甘油三酯、鈉、鉀、氯、C-反應(yīng)蛋白、肌酐、尿素氮、葡萄糖、 HBsAb、血紅蛋白、白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)和D-二聚體這些指標(biāo)無(wú)顯著影響，此前國(guó)外的研究結(jié)果也得到了類似的結(jié)論［8-10］。白蛋白、球蛋白、前白蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和乳酸脫氫酶等指標(biāo)熱滅活前后數(shù)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以通過線性回歸方程校正滅活后的結(jié)果，使其仍具有臨床參考價(jià)值。堿性磷酸酶、 γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶、膽堿酯酶、肌酸激酶等指標(biāo)受加熱滅活的影響顯著，無(wú)法通過校正得到有意義的檢測(cè)結(jié)果。此外，熱滅活后凝血功能相關(guān)的蛋白活性明顯下降，無(wú)具體的檢測(cè)結(jié)果，不建議熱滅活后檢測(cè)。因此本研究結(jié)果提示，對(duì)于熱滅活后數(shù)值降低在5倍以內(nèi)的指標(biāo)，可以通過標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正。即已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與檢測(cè)樣品采取相同的處理措施，然后用標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)值建立回歸方程，將待測(cè)樣品滅活后的檢測(cè)值代入方程即可得到滅活前的校正檢測(cè)數(shù)值。

表1　生物化學(xué)和免疫檢測(cè)項(xiàng)目熱滅活前后結(jié)果Table 1 Biochemical and immunological indicators before and after heating inactivation

表2　白細(xì)胞、血小板和血紅蛋白熱滅活前后檢測(cè)結(jié)果Table 2 WBC， PLT and HGB levels before and after heat inactivation

表3　熱滅活后部分檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果的校正方程Table 3 Regression equation of some laboratory indicators after heating inactivation

圖1　部分檢測(cè)指標(biāo)熱滅活前后水平散點(diǎn)圖注：ALB.白蛋白； GLO.球蛋白； PAL.前白蛋白； ALT.丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶； AST.天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶； LDH.乳酸脫氫酶Figure 1 Scatter plot of some laboratory indicators before and after heating inactivation

本研究涵蓋了大多數(shù)常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目，一般情況須要應(yīng)用3種采集管：真空干燥管用于生物化學(xué)及免疫項(xiàng)目的檢測(cè)，枸櫞酸鈉抗凝管用于凝血項(xiàng)目的檢測(cè)，EDTA-K2抗凝管用于血常規(guī)的檢測(cè)。本研究直接應(yīng)用血漿進(jìn)行生物化學(xué)項(xiàng)目檢測(cè)，減少了對(duì)受試者血液采集量，簡(jiǎn)化了操作步驟，可提高P3實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)效率。

本研究的結(jié)果顯示加熱滅活處理對(duì)大部分生物化學(xué)和免疫項(xiàng)目并無(wú)影響或影響較小，部分檢測(cè)項(xiàng)目可通過校正消除影響。60 ℃1 h加熱滅活埃博拉病毒不需昂貴的儀器設(shè)備，簡(jiǎn)單易行，對(duì)多數(shù)臨床檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果不會(huì)造成影響，且部分可以校正，可考慮作為一種臨床實(shí)驗(yàn)室工作人員防止醫(yī)源性感染切實(shí)可行的標(biāo)本處理方法。

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（2015-11-27 收稿 2016-01-20 修回）

（責(zé)任編委 曲 芬 本文編輯 張?jiān)戚x）

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］［中國(guó)圖書資料分類號(hào)］ R512.62 A

［文章編號(hào)］1007-8134（2016）03-0160-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.009

*Corresponding author. WANG Xue-jing， E-mail： wangxuejing@263.net； XU Dong-ping， E-mail： xudongping302@sina.com

［基金項(xiàng)目］北京市科委科技計(jì)劃項(xiàng)目（D131100005313016），全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”科研項(xiàng)目重點(diǎn)課題（BWS11J048），新發(fā)突發(fā)傳染病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（2014XFTF04）

［作者單位］100039 北京，解放軍第三〇二醫(yī)院臨床研究管理中心（李曉東、廖昊、劉妍、李樂、陳容娟、李奇、陳麗、黃鵬宇、徐東平）；100123 北京，民航總醫(yī)院檢驗(yàn)科（王學(xué)晶）

［通訊作者 ］王學(xué)晶，wangxuejing@263.net； 徐東平，E-mail∶xudongping302@sina.com

Effects of sample processing by heating at 60 ℃for one hour on routine clinical laboratory indicators

LI Xiao-dong， LIAO Hao， LIU Yan， LI Le， CHEN Rong-juan， LI Qi， CHEN Li， HUANG Peng-yu， WANG Xue-jing*， XU Dong-ping*
Research Center for Clinical and Translational Medicine， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China

［Abstract］Objective To evaluate the influence of the heating procedure on clinical laboratory indicators based on the understanding that heating at 60 ℃ for 1 hour is an effective assay for inactivation of Ebola virus. Methods Blood samples of 40 subjects involved in this study were collected in sodium citrate anticoagulation tubes and EDTA-K2 anticoagulation tubes respectively， and divided into two equal aliquots. One aliquot was analyzed for biochemical， immunological， coagulation and blood routine examination parameters without preheating （prior-inactivation group）， and the other was analyzed for these parameters after heating at 60 ℃ for 1 hour （post-inactivation group）. The differences in these parameters between prior-inactivation group and post-inactivation group were compared. Results In terms of biochemical and immunological tests， as compared with prior-inactivation group， total protein， TBIL， CRE， TC， TG， NA， K， CL， CRP， BUN， GLU and HBsAb in post-inactivation group were not significantly different （P＞0.05）； ALB， GLO， PAL， ALT， AST and LDH decreased significantly， but the decreased variations were less than 80％ and there was a correlation between the levels of the two groups （r＞0.80， P＜0.01）， thus the data were still interpretable after calibration with regression equation； ALP， GGT， CHE and CK had a significant decrease （P＜0.01） and no correlation was observed between the two groups. In terms of coagulation tests， D-dimer showed no significant difference between the two groups （P＞0.05）； the other coagulation indicators were significantly different between the two groups. In terms of blood routine tests， HGB， WBC and PLT had no significant differences between the two groups （P＞0.05）， provided that samples were diluted beforehand. Conclusions Heat inactivation at 60 ℃ for 1 hour has no significant influence on some biochemical， immunological and blood routine tests， but significantly affects some other tests， among which 6 items are still interpretable after calibration.

［Key words］Ebolavirus； clinical trial； quarantine