一株好氧反硝化細(xì)菌的篩選、鑒定及紫外誘變

摘要：從牛蒡（Arctium lappa L.）根際土壤中分離到1株具有較高反硝化能力的好氧細(xì)菌YB000，對該菌株采用生理生化及分子生物學(xué)方法進(jìn)行了鑒定，并且對該菌株進(jìn)行了以提高反硝化性能為目的的紫外誘變。結(jié)果表明，分離自牛蒡根際的反硝化細(xì)菌經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），該菌株于距離30 W紫外燈30 cm處照射240 s可獲得具有較強(qiáng)脫氮能力且遺傳性狀穩(wěn)定的誘變菌株YB004和YB005，其脫氮能力分別達(dá)到93.43%、92.03%。

關(guān)鍵詞：好氧反硝化細(xì)菌；牛蒡（Arctium lappa L.）；根際土壤；篩選；鑒定；紫外誘變

中圖分類號：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）13-3305-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.010

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展、含氮工業(yè)廢水的排放及農(nóng)業(yè)中化肥的過量施用，導(dǎo)致水體氮素含量嚴(yán)重超標(biāo)而影響水體的使用安全[1，2]。氮素超標(biāo)是導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化的重要原因之一，生物脫氮可有效去除水體中的氮元素[3]。傳統(tǒng)的生物脫氮包括硝化和反硝化兩個(gè)過程，反硝化脫氮能將硝酸鹽氮或亞硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮，從根本上解決水體中氮素超標(biāo)的問題。反硝化細(xì)菌是能夠引起反硝化作用的細(xì)菌，多為異養(yǎng)、兼性厭氧細(xì)菌[4]，但近期研究表明，一些微生物在較高的氧分壓條件下也能表現(xiàn)出反硝化能力[5-8]。好氧反硝化作用實(shí)現(xiàn)了硝化和反硝化作用的同時(shí)進(jìn)行，不僅簡化了生物脫氮流程、降低了投資成分，而且還表現(xiàn)出了傳統(tǒng)廢水處理方法所無法比擬的優(yōu)勢，如硝化過程無需加堿中和、脫氮效率高、對氨態(tài)氮耐受能力強(qiáng)等[9]。所以好氧反硝化作用是生物脫氮的全新途徑，好氧反硝化菌的發(fā)現(xiàn)為該途徑的充分應(yīng)用提供了可能。本研究從牛蒡（Arctium lappa L.）根際土壤分離純化出1株具有較高反硝化性能的好氧細(xì)菌，并對該菌進(jìn)行了以提高反硝化能力為目的的紫外誘變，以其獲得高效、穩(wěn)定的好氧反硝化細(xì)菌，為好氧反硝化在生物脫氮過程中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

分離自牛蒡根際。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×Amplification buffer購自生工生物工程（上海）有限公司。所用其余試劑均為分析純。

主要儀器：9700型PCR儀（Applied Biosystems公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad Gel Doc XR+美國伯樂）；DYCZ-40D型電泳儀（北京六一儀器廠）；HH.B11.600-S-II型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠）；7230G型可見分光光度計(jì)（上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）；BBS-SSC型潔凈工作臺（上海京工實(shí)業(yè)有限公司）；HNY-100C型恒溫培養(yǎng)搖床（常州中誠儀器制造有限公司）；YXQ型手提式壓力蒸汽滅菌鍋（嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司）。

1.3 引物

16S rDNA引物A1序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；引物A2序列：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′，分別對應(yīng)大腸桿菌（Escherichia coli） 16S rDNA的8～27 bp和1 495～1 514 bp，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 培養(yǎng)基

富集液體培養(yǎng)基：20%KNO3，2%MgSO4，10%K2HPO4，10%KH2PO4，50%檸檬酸鈉，pH 7.2～7.6。

富集固體培養(yǎng)基：20%KNO3，2%MgSO4，10%K2HPO4，10%KH2PO4，50%檸檬酸鈉，2%瓊脂，pH 7.2～7.6。

反硝化顯色固體培養(yǎng)基：10%葡萄糖，1%酒石酸鉀鈉，20%KNO3，2%K2HPO4，5%CaCl2，2%瓊脂，1%BTB（溴麝香草酚蘭）乙醇溶液[10]。

1.5 方法

1.5.1 牛蒡根際土壤的采集 于江蘇省徐州市豐縣牛蒡種植基地，使用五點(diǎn)采樣法采集牛蒡根際土壤于無菌袋中避光、低溫保存。

1.5.2 反硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)及分離純化 準(zhǔn)確稱取土樣1.0 g于10 mL去離子水中，并在振蕩器上充分振蕩15 s。待土樣沉淀后取1 mL上清液接種于反硝化液體培養(yǎng)基，并于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～14 d至培養(yǎng)基渾濁。

取1 mL上述富集培養(yǎng)菌液涂布于反硝化顯色固體培養(yǎng)基，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長出菌落，取單菌落接種在富集固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)上述操作，直至獲得純菌種[11，12]。

1.5.3 反硝化細(xì)菌生理生化鑒定

1）革蘭氏染色。在干凈玻片上滴1滴去離子水，用接種針挑取少量菌落涂布于水中，風(fēng)干固定。加入結(jié)晶紫混合液作用1 min，水洗。碘液染色1 min，水洗，吸干。95%乙醇溶液脫色，水流洗脫至洗脫液無色（約30 s）。用番紅液染色2～3 min，水洗、風(fēng)干。挑取生長良好的菌落進(jìn)行染色，顯微觀察多個(gè)視野。

2）鞭毛染色。挑取少許菌苔，涂布在玻片上的無菌水中，風(fēng)干固定。滴加酸化的FeCl3溶液染色10 min，沖洗后將殘水瀝干，加2%AgNO3溶液染色30～60 s，加熱，冷卻后用去離子水沖洗。顯微觀察。

3）半固體瓊脂穿刺法。用接種針穿刺接種菌液于半固體培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃培養(yǎng)10 d，用透射光目測其生長狀況。

4）甲基紅試驗(yàn)。接種菌液在加入甲基紅試劑的培養(yǎng)基中于30 ℃培養(yǎng)2～6 d，同時(shí)以不加入甲基紅試劑的培養(yǎng)基為對照。

5）V-P試驗(yàn)。接種菌液于甲基紅培養(yǎng)液中，30 ℃培養(yǎng)6 d。取培養(yǎng)液和40%NaOH等量混合，加入少量肌酸作用10 min。

6）顯色培養(yǎng)。將富集培養(yǎng)液接種于反硝化顯色培養(yǎng)基中，劃線接種反硝化菌種，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。

1.5.4 反硝化細(xì)菌特殊生理生化鑒定

1）反硝化試驗(yàn)。配制反硝化培養(yǎng)基，接種反硝化菌種，封管后以不含硝酸鉀的培養(yǎng)基作為對照。培養(yǎng)1～7 d，觀察含有硝酸鉀的培養(yǎng)基中有無生長和是否產(chǎn)生氣泡，如產(chǎn)生氣泡表示有反硝化作用產(chǎn)生氮?dú)?，是陽性反?yīng)，不產(chǎn)生氣泡則為陰性。

2）硝酸鹽還原試驗(yàn)（格利斯試驗(yàn)）。在干凈的白瓷板中倒入少許培養(yǎng)1、3、5 d的菌液，再各加1滴磺胺-乙酸溶液及α-萘酚-乙酸溶液，觀察其顏色變化。

3）氮元素檢測方法[13]。α-萘胺分光光度法測定亞硝酸鹽氮；納氏試劑分光光度法測定氨氮含量；酚二磺酸分光光度法測定硝酸鹽氮。

1.5.5 分子生物學(xué)鑒定

1）菌種DNA的提取與檢測。參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行。取2 μL DNA樣品采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2）菌種16S rDNA基因PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系ddH2O 29.7 μL，10×Amplification buffer（不含Mg2+） 5 μL，dNTPs（2 mmol/L）5 μL，Mg2+（25 mmol/L）3 μL， A1（10 μmol/L）2 μL，A2（10 μmol/L）2 μL，基因組DNA（30 ng/μL）3 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.3 μL，反應(yīng)總體積50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次；72 ℃ 延伸10 min。將100 μL PCR產(chǎn)物送交生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。

1.5.6 菌種的紫外誘變 取50 μL菌液均勻涂布于反硝化固體培養(yǎng)基中，于距離30 W紫外燈下30 cm處進(jìn)行誘變。誘變時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60、120、240、360、480、600 s。將誘變后的平板用黑布包裹后置于30 ℃通風(fēng)干燥培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。觀察固體培養(yǎng)基中菌落生長情況，確定誘變時(shí)間范圍，計(jì)算致死率。致死率=（未誘變的再生菌落數(shù)-誘變后的再生菌落數(shù)）/未誘變的再生菌落數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)特征分析

菌種經(jīng)反復(fù)富集、分離培養(yǎng)后，接種于分離培養(yǎng)基上，其菌落形態(tài)見圖1。從圖1可以看出，菌種菌落呈圓形、白色、邊緣整齊、表面光滑濕潤。

2.2 生理生化鑒定結(jié)果

菌種為革蘭氏陰性菌，有鞭毛，有運(yùn)動性，甲基紅陰性，能發(fā)酵葡萄糖，V-P反應(yīng)呈陽性，可分解利用淀粉，菌液中有過氧化氫酶存在，具有硝酸鹽還原能力。菌種生理生化特征總結(jié)見表1。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 DNA電泳檢測 取2 μL DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，D1、D2的條帶清晰，無斷裂、拖尾現(xiàn)象，說明提取的DNA較完整，可用其進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。

2.3.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，該試驗(yàn)菌采用引物A1、A2進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，得到約 1 500 bp的片段，條帶單一，沒有其他雜帶，可用于測序。

在Genbank上查找其同源序列發(fā)現(xiàn)，該序列與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CGL-2（登錄號EU147006）相似度達(dá)95.8%。

2.4 高脫氮性能菌株的紫外誘變篩選

2.4.1 紫外誘變時(shí)間的確定 將分離純化出的原始好氧反硝化菌株命名為YB000，將經(jīng)不同劑量的紫外線誘變處理后的YB000菌株單孢子菌懸液分別涂布于固體培養(yǎng)基平板上，每批單孢子菌懸液涂布3只平板。平板培養(yǎng)后計(jì)數(shù)存活菌落數(shù)，以不經(jīng)誘變的平板菌落數(shù)為對照，計(jì)算誘變致死率，結(jié)果見表2。從表2可以看出，隨著紫外線處理時(shí)間的延長，菌體的致死率隨之上升，照射360 s時(shí)達(dá)到81.7%，到600 s時(shí)達(dá)到100%。研究表明，致死率在80%左右的突變一般為正突變[15]，因此，本研究選用的誘變時(shí)間為360 s。

2.4.2 高脫氮性能菌株的篩選 菌株經(jīng)紫外誘變后，獲得6株生長較快的誘變菌株。對原始菌株（YB000）及誘變菌株（YB001-YB006）進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵（100 mL培養(yǎng)液/250 mL三角瓶），每天測定發(fā)酵液中硝酸鹽氮含量以確定菌株的脫氮能力，測定結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，培養(yǎng)液中硝酸鹽氮的含量逐漸降低，后期逐漸趨于平緩。誘變菌株中YB003菌株、YB004菌株、YB005菌株脫氮能力較強(qiáng)，脫氮率分別達(dá)到80.72%、92.23%、91.81%。

2.4.3 菌株遺傳穩(wěn)定性檢測 對經(jīng)過誘變后獲得的突變菌株YB003、YB004和YB005利用群體傳代法進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析。發(fā)現(xiàn)YB004和YB005菌株的脫氮性能和遺傳特征穩(wěn)定，YB003菌株傳至第三代時(shí)，其脫氮性能顯著下降，說明YB003菌株遺傳性狀不穩(wěn)定。故選擇YB004和YB005菌株為高效脫氮誘變菌株。

2.4.4 誘變菌株與原始菌株脫氮能力的比較 對原始菌株YB000和誘變菌株YB004、YB005進(jìn)行脫氮能力比較，發(fā)現(xiàn)在相同培養(yǎng)條件下原始菌株的脫氮能力為63.78%，而YB004和YB005脫氮能力分別達(dá)到93.43%、92.03%，顯著高于原始菌株。說明經(jīng)紫外誘變選育獲得的誘變菌株的脫氮能力得到了較大幅度的提高。

3 小結(jié)與討論

1）物理誘變中紫外線誘變操作簡便，誘變時(shí)間易于控制，且作用相對溫和，因而是誘變育種的首選方式之一。本試驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了紫外誘變這一優(yōu)勢。誘變后的黑暗處理必不可少，可防止發(fā)生光復(fù)活效應(yīng)。有報(bào)道稱，致死率在80%左右發(fā)生正向突變概率高[15]，也有報(bào)道表明致死率在90%～99%誘變效果好[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，致死率在80%左右獲得的反硝化細(xì)菌誘變株反硝化性能較好，主要由于反硝化細(xì)菌反應(yīng)活性及生長速度易受到外界條件的影響，在高致死率下菌種很難生長，因此在紫外誘變中，正向突變可能較多地出現(xiàn)在偏低劑量中。

2）具有反硝化功能的微生物分布非常廣泛，與系統(tǒng)分化無關(guān)，在近20年，Zumft[17]就記錄了130余種，有超過50個(gè)屬的生物具有反硝化功能。目前，更多的研究證實(shí)具有反硝化功能的微生物從遺傳距離很遠(yuǎn)的細(xì)菌到太古菌甚至是真菌中都有發(fā)現(xiàn)。因?yàn)榇嬖诙鄻有裕S多反硝化菌也執(zhí)行氮循環(huán)過程中的其他功能，例如氨氧化[如亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira）]和固氮[如根瘤菌屬（Rhizobium）、固氮螺菌屬（Azospirillum）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）]。因此，反硝化群落的研究并不像其他群落研究那樣容易，擁有反硝化功能的反硝化菌在進(jìn)化上沒有緊密的聯(lián)系，不適合用16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹來分析。因此，利用編碼反硝化酶的功能基因來研究反硝化菌應(yīng)是下一步研究的重點(diǎn)。根據(jù)生理生化和分子生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合細(xì)菌分類學(xué)手冊，判斷從牛蒡根際微生物中分離到的具有反硝化功能的試驗(yàn)菌為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

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