鐵皮石斛中有機磷的檢測方法分析

□ 厲 芬 王鳳麗 朱佳茜 王新財 顧寬宇 湖州市食品藥品檢驗研究院

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鐵皮石斛中有機磷的檢測方法分析

□ 厲 芬 王鳳麗 朱佳茜 王新財 顧寬宇 湖州市食品藥品檢驗研究院

摘 要：本文研究的目的是制定一套成熟的鐵皮石斛藥材中有機磷農藥多殘留檢測方法，以期為中藥材中農藥多殘留檢測方法的制定和完善提供依據(jù)。在空白鐵皮石斛中加入41種有機磷標品，用水浸潤樣品，以丙酮和乙腈作為提取溶劑，高速均漿為提取手段，GPC和Carb-NH2柱固相萃取聯(lián)用作為凈化方式，用FPD-GC檢測，發(fā)現(xiàn)各個農藥的回收率在84.2%～105.8%，重復性在2.76%～6.58%，方法定量限在0.002～0.01 mg/kg，符合農藥殘留檢測要求。

關鍵詞：鐵皮石斛；有機磷；凝膠凈化

鐵皮石斛為蘭科植物石斛屬鐵皮石斛新鮮或干燥的莖，其含有多糖、芪類、生物堿、氨基酸和微量元素等多種成分，具有增強免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖和養(yǎng)陰生津等多種保健功能。鐵皮石斛的鮮莖可直接食用，也可燉湯、泡茶、浸酒，通常加工成干品，如鐵皮楓斗等。近年來，以鐵皮石斛為原料的保健品越來越多，暢銷國內和國外市場。但由于野生鐵皮石斛資源較少，目前市場上多為栽培品，難免使用農藥防治病蟲害，如農藥使用不當，農藥殘留超標將危及食品安全。

農藥多殘留是指使用農藥之后一個時期內沒有被分降解而殘留于生物體內、土壤、水體、大氣中的農藥原體、降解物和有毒代謝物及雜質的總稱。人們食用了被污染的中草藥及其保健制品后，殘留在其中的農藥便會積聚在體內，因其代謝緩慢，最終將導致急性或慢性中毒，產(chǎn)生嚴重的后果。因此，世界各國對此高度重視，歐美國家都對傳統(tǒng)藥和草藥制定了非常嚴格的農藥多殘留限量標準。農藥多殘留檢測屬于復雜混合物中痕量組分分析技術，中藥材保健品農藥多殘留檢測具有以下特點：既需要精細的微量操作手段，又需要高靈敏度的痕量檢測技術［1］。農藥多殘留量檢測方法的研究已成為影響中藥國際貿易的最重要技術要求之一，影響中藥保健品走向國際化與現(xiàn)代化。因此，研制簡單、快速、準確，并可同時定性、定量的農藥多殘留檢測方法是保障人民食品藥品安全，推動中藥材保健食品的現(xiàn)代化建設迫切需要解決的問題之一。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

所用水為經(jīng)過二次蒸餾的重蒸水；丙酮、乙腈、二氯甲烷（色譜純，默克公司）；41種有機磷標準品（國家標準物質研究中心）；無水硫酸鈉（分析純，麥克林）。

本實驗采用的鐵皮石斛，采購自湖州仁皇山街道康龍保健食品商行。

1.2 設備儀器

GC-FPD（Agilent7890B）、自動固相萃取儀（LAB TECH）、高速勻漿機（德國 IKA）、氮吹儀（美國Organomation）、旋轉蒸發(fā)儀（德國IKA）、恒溫水浴振蕩器（上海精風儀器有限公司）、旋渦混勻器（IKAM S1）、高速冷凍離心機（貝克曼）。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

提?。悍Q取2 g飲片樣品粉狀于均質杯中（新鮮的鐵皮石斛先干燥至水分含量低于12.0%），加入6 mL水和5 m L丙酮，充分膨脹，振蕩渦旋，然后加入20 mL乙腈，12 000 r/min均質1分鐘；再用20 mL乙腈，均質1分鐘，濾紙過濾于裝有10 m L飽和氯化鈉溶液中，收集濾液，蓋上蓋，劇烈震蕩2 min，室溫靜置20 min，分層；取濾液過無水硫酸鈉，旋轉蒸發(fā)至2～3 m L，氮氣吹至近干，用丙酮定容至2 mL［2］。

凈化：Carb-NH2柱進一步凈化。在Carb-NH2 柱中加入 1 cm無水硫酸鈉，預先用 5 mL丙酮+二氯甲烷（1∶1）活化小柱，把待凈化液加到已活化好的 Carb-NH2柱上，使其逐滴流下，用5 mL×2次丙酮+二氯甲烷（1∶1）洗脫。41℃以下水浴氮吹濃縮至近干，用2 mL丙酮溶解定容，供GC-FPD分析。

1.3.2 GC色譜條件

色譜柱：安捷倫DB-17（30 m ×0.32 mm× 0.25 μm）；進樣口溫度：220℃；檢測器溫度：250℃；柱溫程序升溫：150℃保持2分鐘，以8℃/ min升至250℃，保持12分鐘；柱流速：1 mL/min；不分流進樣；載氣：氮氣，純度≥99.999%［2］。

2 結果與分析

2.1 提取過程加水的考察

本試驗考察樣品在提取前加不加適量的水來考察提取效果，發(fā)現(xiàn)水浸潤后提取液澄清透明，因為加入適量的水能增加粉狀樣品之間的吸附力，經(jīng)過離心后能完全達到固液分離。不加水，提取后提取液渾濁，并且有粉末和纖維漂浮在上面，從而影響下面的試驗。并且加了水能使提取溶劑更好地浸入樣品中，從而有利于農藥殘留的提?。?］。

通過試驗發(fā)現(xiàn)不加水各個農藥回收率為53.1%～82.5%，而加水回收率提升到了86.2%～103.7%。因此，在有機溶劑提取樣品前應先加入適量的水浸潤。

2.2 提取溶劑的選擇

本試驗考察了正己烷、丙酮及乙腈這3種溶劑，發(fā)現(xiàn)丙酮和乙腈的提取效果最佳，正己烷不適合，正己烷雖然對于色素溶解性差，但是單獨不能充分滲透到樣品內部［3］，且不能與水相溶，使提取效率較低，41種有機磷回收率在32.9%～67.2%。丙酮這種極性物質雖然滲透性強，但是在提取過程中也同時提取出大量的雜質，使樣品的目標峰被某些雜質所干擾。

乙腈滲透性強，并且對于雜質的提取效果沒有丙酮有效。鑒于最后檢測的檢測器為FPD檢測器，特征光經(jīng)過磷濾光片，再由光電倍增管進行光電轉換后只產(chǎn)生相應的電信號，因此可排除大量溶劑峰及烴類的干擾，經(jīng)過后續(xù)的凈化可以滿足檢測的要求。各個有機磷的回收率為84.6%～103.8%。

表1 不同提取方法的比較

圖1 第一有機磷標準品色譜圖

圖2 第二有機磷標準品色譜圖

圖3 第三有機磷標準品色譜圖

圖4 第四有機磷標準品色譜圖

2.3 提取方式的選擇

中藥材基質復雜，提取難滲透，選用適宜的提取方法，能讓提取溶劑與鐵皮石斛基質充分接觸、滲透。本試驗選用振蕩提取、超聲波提取和高速均漿提取3種方法考察，發(fā)現(xiàn)振蕩提取效果較差，超聲波提取其次，高速勻漿法提取效果最好。

樣品中加入的提取溶劑的量對于振蕩提取影響比較大，通過試驗發(fā)現(xiàn)提取溶劑加入量越大，提取的回收率越高，但是隨著提取溶劑增加，回收率提升的幅度越來越小。加入少量的溶劑，在振蕩提取中不能充分與樣品內部接觸，從而導致提取不充分，但是大量的溶劑增加會相應的增加成本，并且振蕩提取的時間也相對比較長［4］。

超聲波提取也是農藥殘留中常見的提取方法，但是在提取過程中，超聲波內部水溫會隨著提取時間增長而升高，而部分農藥殘留具有熱不穩(wěn)定性及揮發(fā)性，因此造成了部分農藥殘留回收率低下。在整個超聲容器中超聲波場的分布是不均勻的，類似在波場的分布中有死角，這會使部分樣品的提取效率顯著下降，從而導致重現(xiàn)性較差。

使用高速均漿法能在較短時間，用較少溶劑得到較好的回收率，并且重現(xiàn)性也較好。高速均漿是樣品在高速攪拌下從攪拌縫隙高速噴出，高壓高速情況下使鐵皮石斛的粉末進一步被破壞細化，從而使提取溶劑與鐵皮石斛粉末充分接觸，提高了提取效率，并且提取時間也進一步縮短。

本試驗也考察了超聲波與振蕩聯(lián)用、超聲波與均漿聯(lián)用、振蕩與均質聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)超聲波與振蕩聯(lián)用回收率有了提高，但是還是沒有達到試驗要求。后面兩者回收率與單獨使用均漿法相差不多，因此選用高速勻漿法作為本試驗的提取方法。

2.4 SPE凈化柱的選擇

樣品經(jīng)過提取，含有大量的色素、糖類物質，因此選用合適的固相萃取柱對樣品的檢測非常重要。本試驗選用Carb- NH2柱、弗羅里硅土柱、C18柱和氨基柱，發(fā)現(xiàn)通過Carb-NH2柱能有效除去色素及糖類物質，而弗羅里硅土柱、C18柱和氨基柱這3款柱子經(jīng)過樣品凈化，凈化液還是呈現(xiàn)綠色，通過氣相色譜檢測，還是有很多雜質干擾。

因此選用Carb-NH2柱，經(jīng)過FPD檢測器檢測，基本凈化完全，滿足藥材中有機磷的檢測要求，各個有機磷的回收率在84.7%～102.7%。

2.5 前處理方法學考證

樣品中加入分成四組的41種有機磷標準品，進行加標回收、檢出限及重復性試驗［5］。

精密稱取鐵皮石斛樣品40份，各個農藥加標濃度為0.05 mg/kg和0.5 mg/kg兩個添加水平，重復實驗5次，通過GC- FPD檢測，發(fā)現(xiàn)各個農藥的回收率在84.2%～105.8%，重復性在2.76%～6.58%，符合農藥殘留檢測要求。

圖5 空白樣品色譜圖

圖6 空白樣品第一組有機磷加標濃度0.05 mg/kg色譜圖

圖7 空白樣品第二組有機磷加標濃度0.05 mg/kg色譜圖

圖8 空白樣品第三組有機磷加標濃度0.05 mg/kg色譜圖

圖9 空白樣品第四組有機磷加標濃度0.05 mg/kg色譜圖

3 結論

本文建立了41種有機磷在飲片鐵皮石斛中的GC- FPD的前處理方法：根據(jù)實驗室的實際條件，用水浸潤樣品，以丙酮和乙腈作為提取溶劑，高速均漿為提取手段，Carb-NH2柱固相萃取作為凈化方式。該方法既可有效提取鐵皮石斛中農藥殘留，又可完全去除雜質干擾，簡便、省時、結果準確。所建立的分析方法各個農藥的回收率在84.2%～105.8%，重復性在2.76%～6.58%，方法定量限在0.002～0.01 mg/kg符合農藥殘留檢測要求。

參考文獻：

［1］田金改，杜慶鵬，高天兵.HPLC測定中藥中農藥滅幼脲殘留量的方法研究［J］.中草藥，2000，31（3）：179-181.

［2］中華人民共和國農業(yè)部.蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定（NY/T761-2008）［S］.2008.

［3］李慶，劉漢蘭.中草藥農藥殘留分析的研究進展［J］.華中農業(yè)大學學報.2002，21（2）：195-200

［4］董順玲，胡家熾，何志強，等.中藥材中氨基甲酸酯類農藥殘留量的反相高效液相色譜法［J］.藥物分析雜志，2002，22（3）：178-182

［5］巢志茂.瓜萎中有機氯農藥殘留量的含量測定［J］.中國藥學雜志，2004，39（3）：179-181.