AGEs-RAGE相互作用對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇流出功能影響的研究

徐 雷， 王一茹， 李沛城

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200120)

?

·基礎(chǔ)研究·

AGEs-RAGE相互作用對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇流出功能影響的研究

徐 雷， 王一茹， 李沛城

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200120)

目的 觀察糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products， AGEs)及其受體(receptor of advanced glycation end products, RAGE)對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇流出功能的影響。方法 培養(yǎng)THP-1細(xì)胞株并用佛波酯誘導(dǎo)分化使其成為巨噬細(xì)胞，與100μg/ml的氧化LDL(oxidized LDL, oxLDL)孵育細(xì)胞使其轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。分別以濃度為300μg/ml的AGEs、600μg/ml的AGEs對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，用濃度為10μg/ml的抗RAGE抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)油紅“O”染色測(cè)定來(lái)反映細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量，通過(guò)RT-PCR及Western Blot的方法來(lái)檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞RAGE表達(dá)以及與膽固醇流出相關(guān)因子ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子(ATP-binding cassette, ABC)G1、ABCA1及肝X受體-α(Liver X Receptor-α， LXR α的表達(dá)變化)，通過(guò)將干預(yù)后的巨噬細(xì)胞與熒光標(biāo)記的oxLDL共同孵育，并加入HDL及載脂蛋白A1(apolipoprotein A1， apoA1)介導(dǎo)膽固醇流出，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中的熒光強(qiáng)度，動(dòng)態(tài)觀察巨噬細(xì)胞在不同干預(yù)條件下膽固醇流出功能變化。結(jié)果 經(jīng)AGEs誘導(dǎo)后，巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加，RAGE表達(dá)增加，ABCG1表達(dá)下降，巨噬細(xì)胞膽固醇流出能力減弱。AGEs效應(yīng)呈濃度依賴性。應(yīng)用抗體阻斷RAGE功能后，AGEs引起的改變均有明顯恢復(fù)。結(jié)論 AGEs-RAGE相互作用可以抑制巨噬細(xì)胞流出膽固醇，增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積，從而易于形成泡沫細(xì)胞。

糖基化終末產(chǎn)物； 糖基化終末產(chǎn)物受體； 巨噬細(xì)胞； 膽固醇流出； ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子G1

糖尿病患者心血管疾病的發(fā)病率和病死率都高于血糖正常的人群。約有50%的糖尿病相關(guān)性死亡和大血管并發(fā)癥尤其是動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)[1]。動(dòng)脈粥樣硬化作為心血管疾病的病理基礎(chǔ)，其發(fā)生和發(fā)展中關(guān)鍵一步為巨噬細(xì)胞膽固醇代謝紊亂，從而形成泡沫細(xì)胞[2]。糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products， AGEs) 是非酶糖基化反應(yīng)的終末產(chǎn)物，主要由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子在沒(méi)有酶參與的條件下，自發(fā)地與葡萄糖或其他還原單糖反應(yīng)所生成的穩(wěn)定的共價(jià)加成物。已經(jīng)有明確證據(jù)證明，AGEs可以促使糖尿病大血管病變的發(fā)生和發(fā)展[3- 4]，但是AGEs對(duì)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂及泡沫細(xì)胞形成的影響目前尚無(wú)明確結(jié)論。本研究應(yīng)用AGEs干預(yù)人單核細(xì)胞株分化的巨噬細(xì)胞，對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇流出改變進(jìn)行研究，并檢測(cè)其對(duì)AGEs受體(receptor of advanced glycation end products, RAGE)以及巨噬細(xì)胞膽固醇流出相關(guān)因子ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子(ATP-binding cassette, ABC)A1及G1、肝X受體-α(Liver X Receptor -α, LXR-α)表達(dá)的影響，從而明確AGEs對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇流出功能的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

THP-1細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；人血清白蛋白、佛波酯(phorbol myristate acetate, PMA)、油紅“O”染色液均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；D-葡萄糖為美國(guó)Amersco公司產(chǎn)品；載脂蛋白A1(apolipoprotein A1， apoA1)、HDL、ox-LDL、熒光標(biāo)記ox-LDL(Dil-oxLDL)為上海經(jīng)科生物工程有限公司產(chǎn)品；臺(tái)盼藍(lán)為上海國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄、PCR試劑盒為日本TAKARA產(chǎn)品；PCR引物由上海生工合成；兔抗人RAGE、ABCA1、ABCG1、LXR-α、GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自北京博奧森公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 AGEs 的制備

采用人血清白蛋白(human serum albumin, HAS)與D- 葡萄糖37℃孵育12周方法制備AGE-HAS[5]，經(jīng)篩選鑒定后，制備成凍干粉，4℃保存待用。

1.3 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

THP-1細(xì)胞株應(yīng)用含10%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基在37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基加入青霉素、鏈霉素各0.06g/L，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前加入160nmol/L PMA, 置恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及貼壁情況。

1.4 巨噬細(xì)胞分組干預(yù)

將誘導(dǎo)分化成功的巨噬細(xì)胞換用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5h后，加入處理因素。按干預(yù)因素不同分成如下4組： 第一組： 對(duì)照組，不加入任何干預(yù)試劑；第二組： 低濃度AGE組，加入終濃度為 300μg/ml 的AGEs 進(jìn)行干預(yù)；第三組： 高濃度AGE組，加入終濃度為600μg/ml的AGEs進(jìn)行干預(yù)；第四組： 抗RAGE抗體組，在加入600μg/ml的AGEs進(jìn)行干預(yù)之前，先加入10μg/ml抗RAGE抗體進(jìn)行預(yù)處理。四組細(xì)胞分別與干預(yù)試劑共同孵育2h，然后與100μg/ml ox-LDL共同孵育48h，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活率。

1.5 油紅“O”染色

用50%異丙醇固定2min，PBS輕緩沖洗3次，油紅“O”染色液(Sigma)染色10min，用75%酒精漂洗，去離子水沖洗3次，每次2min，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。采用 518nm 波長(zhǎng)下油紅“O”提取物的光密度值(D)對(duì)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)含量進(jìn)行半定量分析。

1.6 熒光定量RT-PCR檢測(cè)

用Trizol法提取干預(yù)后6組細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行純度及完整度鑒定應(yīng)用RT reagent kit試劑盒，按說(shuō)明書(shū)配成反應(yīng)體系，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin作為內(nèi)參照基因。引物序列如下： RAGE： Forward primer GAAACTGAACACAGGCCGGA；Reverse primer CACGGACTCGGTAGTTGGAC；ABCG1： Forward primer TGTCTGATGGCCGCTTTCT；Reverse primer CACCTCATCCACCGAGACAC；ABCA1： Forward primer AGGGAGAGCACAGGCTTTGAC；Reverse primer CCCCACTCACTCTCGCTCG；LXR-α： Forward primer AGCCAAGGTACAGGTAACGA；Reverse primer GATTACAACGGTGATGGCGG。應(yīng)用SYBR Green RT-PCR試劑盒，按說(shuō)明書(shū)配成體系后進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)各組細(xì)胞的靶基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件為： 95℃ 30s，循環(huán)1次；95℃ 5s，60℃ 30s，循環(huán)40次；反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線，得出Ct值，計(jì)算RAGE基因的Ct值與β-actinCt值的差值ΔCt，以2-ΔΔCt作為RAGE mRNA的相對(duì)含量。

1.7 Western Blot 檢測(cè)

RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，10000r/min，離心半徑10cm，離心3～5min，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)定量結(jié)果，加入5×上樣緩沖液，混勻，沸水中加熱 10min 變性，經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，RAGE、ABCA1、ABCG1、LXR-α、GAPDH一抗加入封閉液中稀釋到1∶1000濃度，和膜室溫孵育2h。加入1∶5000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，與膜37℃孵育 1h。ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，應(yīng)用凝膠電泳圖像掃描儀對(duì)PVDF膜進(jìn)行圖像掃描，并對(duì)電泳條帶進(jìn)行D值分析，計(jì)算目標(biāo)靶蛋白條帶與GAPDH內(nèi)參條帶值之比，其代表各組細(xì)胞的目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

1.8 膽固醇流出實(shí)驗(yàn)

如1.4所述方法干預(yù)細(xì)胞后，應(yīng)用40μg/ml Dil-oxLDL代替oxLDL孵育(室溫下)48h。撤去含Dil-oxLDL培養(yǎng)基，以PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，改用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。并分別加入100μg/ml HDL及10μg/ml apoA1，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，留取細(xì)胞培養(yǎng)基，離心半徑10cm，12000r/min，離心10min，除去細(xì)胞碎片，熒光化學(xué)發(fā)光微孔板檢測(cè)儀讀取培養(yǎng)基熒光強(qiáng)度。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 油紅“O”染色檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積

經(jīng)油紅“O”染色后，各組巨噬細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)紅染物質(zhì)。其中經(jīng)AGEs誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞(包括低濃度AGEs及高濃度AGEs)，其細(xì)胞內(nèi)紅染顆粒明顯較對(duì)照組增多，顏色深于對(duì)照組，且高濃度AGEs誘導(dǎo)后期紅染顆粒增加更加明顯。應(yīng)用高濃度AGEs及抗RAGE抗體雙重干預(yù)后的細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)紅染顆粒較高濃度AGEs組明顯減少。各組細(xì)胞油紅“O”染色圖片進(jìn)行分析,半定量分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比，高AGEs誘導(dǎo)組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積顯著增加(P<0.01)，低濃度AGEs誘導(dǎo)組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積有所增加(P<0.05)，經(jīng)過(guò)抗RAGE抗體預(yù)處理組其脂質(zhì)沉積量，與高濃度AGEs組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2 AGEs對(duì)巨噬細(xì)胞RAGE表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，AGEs干預(yù)后巨噬細(xì)胞RAGE mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比有明顯升高，其中高濃度AGEs(19.5±0.43vs1.15±0.07，P=0.000)干預(yù)后其升高程度較低濃度AGEs(3.53±0.57vs1.15± 0.07，P=0.049)更為顯著。加入抗RAGE抗體進(jìn)行預(yù)處理后，RAGE表達(dá)明顯低于高濃度AGEs干預(yù)組(5.70±0.45vs19.5±0.43)，見(jiàn)圖2A。

Western Blot顯示RAGE在蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)與mRNA水平具有一致性，見(jiàn)圖2B。

圖1 AGEs濃度依賴性增加巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積Fig.1 AGEs increase lipid accumulation in macrophages in a concentration-dependent mannerA～D： 各組巨噬細(xì)胞油紅“O”染色結(jié)果，可見(jiàn)AGEs干預(yù)后巨噬細(xì)胞內(nèi)紅染顆粒增多且顏色較深，以高濃度AGEs組更為明顯，加入抗RAGE抗體后紅染顆粒明顯減弱；A： 對(duì)照組；B： 低濃度AGEs組；C： 高濃度AGEs組；D： 抗RAGE抗體組；E為對(duì)油紅“O”染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析結(jié)果。高濃度AGEs組*P<0.05

圖2 AGEs干預(yù)巨噬細(xì)胞引起RAGE表達(dá)變化Fig.2 Effect of AGEs on RAGE expression in macrophagesA： 各組巨噬細(xì)胞RAGE mRNA表達(dá)水平；B： 各組巨噬細(xì)胞RAGE蛋白表達(dá)水平表達(dá)及半定量分析結(jié)果。對(duì)照組*P<0.05；高濃度AGEs 組△P<0.05

2.3 AGEs對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇流出功能的影響

如圖3所示，在加入HDL共同孵育后，高濃度AGEs干預(yù)組其培養(yǎng)基熒光強(qiáng)度低于對(duì)照組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。應(yīng)用抗RAGE抗體預(yù)處理組，其培養(yǎng)基熒光強(qiáng)度則明顯強(qiáng)于高濃度AGEs干預(yù)組并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而加入apoAI共同孵育組各組培養(yǎng)基熒光強(qiáng)度并無(wú)顯著差異。

圖3 AGEs通過(guò)上調(diào)RAGE表達(dá)降低由HDL介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固醇流出Fig.3 AGEs decreased cholesterol efflux to HDL in macrophages through regulating expression of RAGE各組細(xì)胞分別與Dil-oxLDL共同孵育，并加入HDL介導(dǎo)膽固醇流出。測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度并以此來(lái)表示巨噬細(xì)胞流出能力。對(duì)照組*P<0.05；高濃度AGEs組△P<0.05

2.4 AGEs對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇流出相關(guān)因子表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)低濃度AGEs干預(yù)后，巨噬細(xì)胞與膽固醇攝取相關(guān)的分子ABCG1 mRNA的表達(dá)均較對(duì)照組已有明顯改變且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，用高濃度AGEs干預(yù)后其表達(dá)進(jìn)一步下降，與對(duì)照組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)?？筊AGE抗體干預(yù)后，ABCG1 mRNA表達(dá)較高濃度AGEs組有明顯下降(P<0.01)，見(jiàn)圖4B。應(yīng)用WB的方法檢測(cè)ABCG1的蛋白水平表達(dá)，結(jié)果與mRNA表達(dá)有較好一致性，見(jiàn)圖4E。

而對(duì)另一與巨噬細(xì)胞膽固醇流出有密切關(guān)系的分子ABCA1進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是mRNA水平還是蛋白水平，AGEs干預(yù)后其表達(dá)均無(wú)明顯變化(圖4A、D)。對(duì)ABCG1及ABCA1經(jīng)典調(diào)控因子LXR-α進(jìn)行檢測(cè)，得出其表達(dá)與ABCG1呈完全相反的趨勢(shì)，見(jiàn)圖4C、F。

圖4 AGEs通過(guò) RAGE下調(diào)ABCG1表達(dá)Fig.4 AGEs down-regulate ABCG1 expression in macrophages via RAGEA： 各組巨噬細(xì)胞ABCA1 mRNA表達(dá)水平；B： 各組巨噬細(xì)胞ABCG1 mRNA表達(dá)水平；C： 各組巨噬細(xì)胞LXR-α mRNA表達(dá)水平；D： 各組巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)水平；E： 各組巨噬細(xì)胞ABCG1蛋白表達(dá)水平；F： 各組巨噬細(xì)胞LXR-α蛋白表達(dá)水平。對(duì)照組*P<0.05；高濃度AGEs組△P<0.05

3 討 論

巨噬細(xì)胞膽固醇代謝平衡是防止動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要環(huán)節(jié)。而巨噬細(xì)胞膽固醇流出功能障礙在膽固醇代謝失衡進(jìn)而脂質(zhì)累積形成泡沫細(xì)胞的過(guò)程中起到重要作用[6]。膽固醇流出是清除巨噬細(xì)胞內(nèi)過(guò)剩膽固醇從而防止其累積的重要途徑，在這一過(guò)程中，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1和ABCG1發(fā)揮重要的作用，介導(dǎo)了脂質(zhì)分別向相關(guān)載脂蛋白apoAI及細(xì)胞外載體HDL轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。目前的研究認(rèn)為巨噬細(xì)胞ABCA1及ABCG1的表達(dá)主要受到LXRα依賴性信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)[8]。

目前，有充足的研究證據(jù)表明AGEs與其受體RAGE結(jié)合，與糖尿病大血管與微血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展均有密切的關(guān)系[9]。關(guān)于AGEs-RAGE通路對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇流出功能的影響，目前研究較少，且觀點(diǎn)并不一致。有研究認(rèn)為AGEs主要通過(guò)影響ABCA1的表達(dá)，減弱巨噬細(xì)胞膽固醇流出功能[10]，也有研究認(rèn)為AGEs可能主要通過(guò)影響ABCG1表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用[11]。

本部分研究采用油紅“O”染色及酶法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量?jī)煞N方法證明，AGEs可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積增加，且這種增加對(duì)AGEs呈濃度依賴性，即AGEs濃度越高，其誘導(dǎo)下的巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量越高。這也可能是血糖控制不佳的患者其大血管動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展較快且程度較重的病理基礎(chǔ)之一。同時(shí)，AGEs上調(diào)了巨噬細(xì)胞表面RAGE在mRNA 和蛋白水平的表達(dá)，且也呈明顯的濃度依賴性。在應(yīng)用了抗RAGE抗體對(duì)巨噬細(xì)胞表面RAGE進(jìn)行封閉后，AGEs誘導(dǎo)后升高的脂質(zhì)含量明顯下降，這提示AGEs-RAGE相互作用確實(shí)可以增加巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)累積。對(duì)RAGE進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量也明顯下降，考慮與AGEs-RAGE正反饋調(diào)節(jié)相關(guān)，由于配體的下降或功能的降低而引起受體表達(dá)的下降[12]。

利用將巨噬細(xì)胞與熒光標(biāo)記的oxLDL共同孵育，并加入HDL或apoAI協(xié)助流出膽固醇，最后對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)的膽固醇熒光水平進(jìn)行檢測(cè)的方法，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)AGEs干預(yù)后加入HDL，巨噬細(xì)胞外流膽固醇能力確實(shí)較對(duì)照組下降。其機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AGEs干預(yù)后巨噬細(xì)胞ABCG1的表達(dá)無(wú)論從mRAN水平還是蛋白水平都有明顯下降，且呈濃度依賴性，這與巨噬細(xì)胞膽固醇流出能力變化相符合，且與RAGE表達(dá)變化相一致。在加入抗RAGE抗體阻斷了AGEs-RAGE通路后，巨噬細(xì)胞膽固醇流出能力有所恢復(fù)，而ABCG1的表達(dá)也明顯升高，這提示AGEs作用發(fā)揮需要依賴RAGE的存在。值得注意的是，本研究并未發(fā)現(xiàn)AGEs干預(yù)對(duì)ABCA1有明顯的影響。且無(wú)論分子水平還是蛋白水平，高濃度AGEs干預(yù)后巨噬細(xì)胞LXRα的表達(dá)水平都有明顯的升高，與ABCG1表達(dá)趨勢(shì)正好相反，這與通常認(rèn)為的膽固醇外流調(diào)節(jié)途徑并不相符。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)AGEs與RAGE結(jié)合后，不通過(guò)LXRα途徑，而是通過(guò)核因子κB(nuclear factor κB， NFκB)途徑，通過(guò)調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorsγ-γ， PPAR-γ)反應(yīng)啟動(dòng)子元件[11]或固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein， SREBP)[13]直接下調(diào)巨噬細(xì)胞ABCG1的表達(dá)，而此通路對(duì)ABCA1的影響較小。由此可進(jìn)一步推測(cè)，2型糖尿病患者巨噬細(xì)胞膽固醇流出可能更多依賴于ABCG1而不是ABCA1來(lái)進(jìn)行。本研究中顯示加入HDL組其膽固醇外流增強(qiáng)，而加入apoA1組膽固醇外流并未發(fā)生明顯變化也間接證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)。

本研究闡明AGEs對(duì)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積以及膽固醇流出功能的影響主要是通過(guò)上調(diào)RAGE的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，且與ABCG1及HDL的聯(lián)系更為密切。這為深入了解AGEs在糖尿病大血管并發(fā)癥尤其是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用提供了理論支持，并提出了HDL可能在糖尿病患者中具有特別意義的假設(shè)。同時(shí)，由于在本研究中AGEs的作用呈濃度依賴性，故而再次強(qiáng)調(diào)了糖尿病患者嚴(yán)格控制血糖的重要性。

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doi： 10.16118/j.1008-0392.2016.06.012

AGEs-RAGE interaction decreases the cholesterol efflux in macrophages

XULei,WANGYi-ru,LIPei-cheng

(Dept. of Endocrinology, East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China)

Objective To investigate the interaction of advanced glycation end products(AGEs) and receptor of advanced glycation end products(RAGE) in cholesterol efflux of macrophage. Methods Human THP-1 monocytes were treated with PMA(100ng/ml) for 48h, and then induced with oxLDL(100μg/ml) Dil-oxLDL(40μg/ml) for differentiating to macrophage foam cells. Cells was pretreated by AGEs(300μg/ml or 600μg/ml) for 2h, and pre-stimulated with antibody for RAGE(10μg/ml). The staining of oil red O and testing of cholesterol ester in macrophages were used for evaluating the accumulation of lipid in macrophages. RT-PCR and Western blotting analysis were using to test the expression of RAGE, ABCG1, ABCA1 and LXR-α. After adding HDL and apoAI to mediate cholesterol efflux, the fluorescence intensity in the cell medium was tested to reflect the ability of cholesterol efflux in macrophages. Results AGEs can increase the content of lipid and RAGE expression in macrophages in a concentration-dependent manner. The ability of macrophage for cholesterol efflux was decreased accompanied with the reduction of ABCG1 expression after treating with AGEs. For blocking up the AGEs-RAGE axis by antibody for RAGE, all the changes were reversed. Conclusion AGEs-RAGE interaction can decrease cholesterol efflux in macrophages, which can easily transform to foam cell.

AGEs; RAGE; macrophage; cholesterol efflux; ABCG1

10.16118/j.1008-0392.2016.06.005

2016-06-28

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81300699)；上海市衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)青年科研項(xiàng)目(20124Y106);上海市浦東新區(qū)優(yōu)秀青年醫(yī)學(xué)人才計(jì)劃(PWRq2013-04)

徐 雷(1981—)，女，主治醫(yī)師，碩士.E-mail: shirley_ok1@126.com

R 587

A

1008-0392(2016)06-0023-06