不同熱量限制方法對胰島素抵抗肥胖大鼠糖脂代謝及脂肪細(xì)胞分化的作用研究

楊玉彬，柯 斌，秦 鑒

?

·論著·

不同熱量限制方法對胰島素抵抗肥胖大鼠糖脂代謝及脂肪細(xì)胞分化的作用研究

楊玉彬，柯 斌，秦 鑒

510080廣東省廣州市，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科

【摘要】目的探討不同熱量限制方法對胰島素抵抗肥胖大鼠糖脂代謝和脂肪細(xì)胞分化的作用。方法2013年10月—2014年3月選取SPF級5周齡Wistar雄性大鼠40只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，空白組(n=5)采用普通飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組(n=35)采用高脂飼料喂養(yǎng)。8周后選取高脂飲食組符合胰島素抵抗肥胖模型造模標(biāo)準(zhǔn)的大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、熱量限制50%組(CR50%組) 、間斷禁食組(IF組) ?？瞻捉M大鼠繼續(xù)給予普通飼料，模型組大鼠繼續(xù)給予高脂飼料，CR50%組大鼠每日高脂飼料供給量為模型組前1 d平均供給量的50%，IF組大鼠給予間斷禁食方法，干預(yù)時間均為8周。實驗結(jié)束后處死大鼠，取上層血清檢測空腹血糖水平、空腹胰島素水平、穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。分別采用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)及Western blotting法檢測過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR)α、PPARβ、PPARγ mRNA及其蛋白表達(dá)水平。結(jié)果造模后，高脂飲食組大鼠空腹血糖水平、空腹胰島素水平、HOMA-IR較空白組升高(P<0.05)。干預(yù)8周后，模型組大鼠空腹血糖水平、空腹胰島素水平、HOMA-IR較空白組升高(P<0.05)；CR50%組大鼠空腹血糖水平較模型組降低(P<0.05)；IF組大鼠空腹血糖水平、空腹胰島素水平、HOMA-IR較模型組和CR50%組降低(P<0.05)。模型組大鼠血清TC、LDL-C水平較空白組升高(P<0.05)；CR50%組大鼠血清LDL-C水平較模型組降低(P<0.05)；IF組大鼠血清TC水平較模型組降低，血清HDL-C水平較模型組升高，血清LDL-C水平較CR50%組升高(P<0.05)。模型組大鼠PPARβ mRNA及其蛋白表達(dá)水平較空白組降低，PPARγ mRNA及其蛋白表達(dá)水平較空白組升高(P<0.05)；CR50%組、IF組大鼠PPARβ mRNA及其蛋白表達(dá)水平較模型組升高，PPARγ mRNA及其蛋白表達(dá)水平較模型組降低(P<0.05)。結(jié)論CR50%和IF可通過調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的作用，改善胰島素抵抗肥胖大鼠的糖脂代謝，IF對胰島素抵抗有更好的改善作用，其作用機(jī)制可能是通過PPRA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用。

【關(guān)鍵詞】胰島素抵抗；肥胖癥；脂代謝障礙；脂細(xì)胞；大鼠

楊玉彬，柯斌，秦鑒.不同熱量限制方法對胰島素抵抗肥胖大鼠糖脂代謝及脂肪細(xì)胞分化的作用研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(18)：2156-2161.[www.chinagp.net]

Yang YB,Ke B,Qin J.Effects of different calorie restriction methods on glycolipid metabolism and adipocytes differentiation in obesity and insulin resistance rat[J].Chinese General Practice，2016，19(18)：2156-2161.

胰島素是由胰島細(xì)胞分泌的內(nèi)分泌激素，與其受體結(jié)合后通過一系列信號傳遞的網(wǎng)絡(luò)級聯(lián)反應(yīng)，引起基因表達(dá)改變，生成效應(yīng)蛋白，參與體內(nèi)代謝調(diào)節(jié)。胰島素作用的外周靶器官或靶組織主要有肝臟、脂肪組織、骨骼肌。胰島素抵抗是指胰島素作用的靶器官對胰島素作用的敏感性下降。胰島素抵抗與十余種代謝性疾病有關(guān)，包括中心性肥胖、脂代謝紊亂〔高三酰甘油血癥和/或高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平降低〕、高血壓、冠心病、糖代謝異常、2型糖尿病、微量清蛋白尿、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)等，胰島素抵抗是這些疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ)。1988年，Reaven[1]在美國糖尿病學(xué)會(ADA)第48屆年會的報告中率先提出了以胰島素抵抗為基本特征的“X綜合征(syndrome X)”概念，這種綜合征包括高胰島素血癥、葡萄糖耐量減低、極低密度脂蛋白膽固醇、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)水平升高、HDL-C水平降低、高血壓和冠心病等。1992年DeFronzo[2]將之命名為“胰島素抵抗綜合征(insulin resistance syndrome,IRS)”,強調(diào)了在這一綜合征診斷中胰島素抵抗的核心作用。

熱量限制是指有計劃地減少由食物提供熱量的進(jìn)食方式，一般是指在生物體所攝入營養(yǎng)成分保證其不發(fā)生營養(yǎng)不良的情況下，將正常自由進(jìn)食(ad libitum，AL)的熱量按一定比例減少?？刂骑嬍呈且葝u素抵抗治療方案中的重要內(nèi)容。但是目前國內(nèi)對胰島素抵抗熱量限制具體方法和量效關(guān)系等方面研究較少，尚未見從脂肪細(xì)胞分化角度探討熱量限制對胰島素抵抗作用機(jī)制的研究。本研究觀察不同熱量限制方法對胰島素抵抗肥胖大鼠糖脂代謝的作用，并從脂肪細(xì)胞分化角度探討熱量限制的作用機(jī)制。

本研究背景及創(chuàng)新點：

我國自1978年改革開放以來，經(jīng)濟(jì)發(fā)展取得了舉世矚目的成就，人民生活條件得到極大改善，可是健康狀況并沒有得到相應(yīng)的提高。不正確的生活方式導(dǎo)致越來越多慢性代謝性疾病，如肥胖、高血壓、糖尿病、血脂異常、代謝綜合征等，已成為威脅國民健康的突出問題，而普遍認(rèn)為，胰島素抵抗是上述疾病共同的病理基礎(chǔ)。目前，針對胰島素抵抗的一線用藥有雙胍類、噻唑烷二酮類(TZDs)等。但大量的報道(包括《新英格蘭醫(yī)學(xué)》《柳葉刀》等)提到此類藥物可能增加心血管事件以及肝損害、肌溶解綜合征、患癌風(fēng)險等不良反應(yīng)發(fā)生率。因此，探索治療胰島素抵抗安全有效的藥物或方法已成為全球研究熱點和亟待解決的難題。熱量限制作為一種古老的自然療法已被證實是改善糖脂代謝、胰島素抵抗的安全有效的方法，本研究從分子生物學(xué)角度探討熱量限制的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實驗動物2013年10月—2014年3月選取SPF級5周齡Wistar雄性大鼠40只，購于中山大學(xué)動物實驗中心，體質(zhì)量(60±12)g，分籠(4只/籠)飼養(yǎng)于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗中心明暗各12 h的動物實驗室內(nèi)，普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2飼料普通飼料含57.0%無氮浸出物、16.0%蛋白質(zhì)、9.0%水分、5.0%粗灰分、4.0%維生素和礦物質(zhì)、4.0%粗纖維、3.0%脂肪、1.3%賴氨酸、0.7%蛋氨酸+胱氨酸，產(chǎn)熱系數(shù)309 kcal/100 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。高脂飼料含45.2%無氮浸出物、18.0%粗蛋白、16.2%脂肪、8.6%水分、5.0%粗灰分、3.0%粗纖維、2.0%礦物質(zhì)、1.3%賴氨酸、0.7%蛋氨酸+胱氨酸，產(chǎn)熱系數(shù)379 kcal/100 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.3胰島素抵抗肥胖模型造模及干預(yù)方法(1)分組：適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，40只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，空白組(n=5)大鼠采用普通飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組(n=35)大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)，均自由飲水，連續(xù)喂養(yǎng)8周。(2)胰島素抵抗肥胖模型造模：8周后采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取高脂飲食組大鼠10只及空白組大鼠5只，禁食不禁水12 h，尾靜脈采血，測定空腹血糖、空腹胰島素水平，并計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR),HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mU/L)/22.5。根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]所述，高脂飲食組大鼠HOMA-IR較空白組明顯升高，提示胰島素抵抗模型造模成功。根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]所述，在胰島素抵抗模型大鼠中挑選空腹體質(zhì)量大于空白組大鼠空腹平均體質(zhì)量20%作為大鼠肥胖的成模標(biāo)準(zhǔn)。(3)干預(yù)方法：采用隨機(jī)數(shù)字表法將符合胰島素抵抗肥胖模型造模標(biāo)準(zhǔn)的肥胖大鼠分為模型組、熱量限制50%組(CR50%組)、間斷禁食組(IF組)?？瞻捉M大鼠繼續(xù)給予普通飼料；模型組大鼠繼續(xù)給予高脂飼料；CR50%組大鼠每日高脂飼料供給量為模型組前1 d平均供給量的50%；IF組大鼠給予間斷禁食方法，1個周期包括2 d禁食(不禁水)，5 d自由進(jìn)食，共重復(fù)8個周期。各組干預(yù)時間均為8周。

1.4血液及組織標(biāo)本的采集干預(yù)8周后，禁食12 h，處死大鼠。0.3%戊巴比妥鈉(1 ml/100 g)腹腔麻醉，麻醉狀態(tài)下仰臥位固定大鼠，沿腹正中線逐層打開腹腔，下腔靜脈取血約6 ml，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min(離心半徑8 cm)，取上清液，-20 ℃存放，用于檢測空腹血糖、空腹胰島素、血脂〔TC、TG、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)〕水平。快速取肝臟、骨骼肌、內(nèi)臟脂肪組織(腸系膜、附睪和腎周脂肪)稱重，分別剪取部分組織，液氮保存，用于檢測基因、蛋白表達(dá)水平。

1.5實驗室指標(biāo)檢測方法采用微量血糖儀測定空腹血糖水平，采用放射免疫分析法測定空腹胰島素水平，采用全自動生化分析儀測定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

1.6實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)法檢測過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR)α、PPARβ、PPARγ mRNA表達(dá)水平RT-qPCR具體步驟：應(yīng)用Trizol試劑(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)提取大鼠內(nèi)臟脂肪組織細(xì)胞總RNA，紫外分光光度試劑盒測定RNA濃度及鑒定純度。使用PrimeScript RT kit(Takara,大連)將0.5 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用ABI 7500進(jìn)行qPCR檢測。以β-actin作為內(nèi)參，以PPARα、PPARβ、PPARγ作為目的基因。β-actin上游引物為5′- TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3′,下游引物為5′- TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度129 bp；PPARα上游引物為5′- GACGCTGGGTCCTCTGGTT-3′,下游引物為5′- TCAGTCTTGGCTCGCCTCTA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度128 bp；PPARβ上游引物為5′- TCACACAACGCTATCCGTTT-3′,下游引物為5′- TGCACGCCATACTTGAGAAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度143 bp；PPARγ上游引物為5′- TCCAAGAATACCAAAGTGCG-3′,下游引物為5′- GCTTCAATCGGATGGTTCTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度135 bp。qPCR反應(yīng)體系20 μl：蒸餾水(dH2O)7 μl，上、下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，Taq酶10 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃變性10 s，58 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s，共45個循環(huán)。使用2-ΔΔCT法測定目的基因mRNA表達(dá)水平。每組重復(fù)檢測3次取均值。

1.7Western boltting 法檢測PPARα、PPARβ、PPARγ表達(dá)水平將同組內(nèi)所有樣品進(jìn)行等量混合以消除組內(nèi)差異，取混合物50 mg進(jìn)行液氮研磨，加入150 μl RIPA裂解液及1.5 μl 苯甲基磺酰氟(PMSF)液冰上孵育30 min，4 ℃ 1 500 r/mim離心15 min(離心半徑13.5 cm)，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。每個樣本各取50 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PDVF)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST沖洗3次，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，HRP偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法在IS 2000 MM圖像工作站進(jìn)行曝光拍照，Molecular Imaging Software Version 4.0(美國Media Cybernetics公司) 軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參。每組重復(fù)檢測3次，取均值。

2結(jié)果

2.1空白組與高脂飲食組大鼠造模后空腹血糖水平、空腹胰島素水平、HOMA-IR比較造模后，高脂飲食組大鼠空腹血糖水平、空腹胰島素水平、HOMA-IR較空白組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。高脂飲食組35只大鼠中符合胰島素抵抗肥胖模型造模標(biāo)準(zhǔn)的大鼠16只，成模率為45.7%。其中模型組5只，CR50%組5只，IF組6只。

2.24組大鼠干預(yù)8周后空腹血糖水平、空腹胰島素水平、HOMA-IR比較干預(yù)8周后，空白組、模型組、CR50%組、IF組大鼠空腹血糖水平、空腹胰島素水平、HOMA-IR比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組大鼠空腹血糖水平、空腹胰島素水平、HOMA-IR較空白組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CR50%組大鼠空腹血糖水平較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；IF組大鼠空腹血糖水平、空腹胰島素水平、HOMA-IR較模型組和CR50%組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.34組大鼠血脂水平比較干預(yù)8周后，空白組、模型組、CR50%組、IF組大鼠血清TC、HDL-C、LDL-C水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組大鼠血清TC、LDL-C水平較空白組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CR50%組大鼠血清LDL-C水平較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；IF組大鼠血清TC水平較模型組降低，血清HDL-C水平較模型組升高，血清LDL-C水平較CR50%組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

2.44組大鼠PPARα、PPARβ、PPARγ mRNA及其蛋白表達(dá)水平比較空白組、模型組、CR50%組、IF組大鼠PPARα mRNA及其蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。空白組、模型組、CR50%組、IF組大鼠PPARβ、PPARγ mRNA及其蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組大鼠PPARβ mRNA及其蛋白表達(dá)水平較空白組降低，PPARγ mRNA及其蛋白表達(dá)水平較空白組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CR50%組、IF組大鼠PPARβ mRNA及其蛋白表達(dá)水平較模型組升高，PPARγ mRNA及其蛋白表達(dá)水平較模型組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

Table 1Comparison of levels of FBG,fasting insulin and HOMA-IRbetween control group and HFT group after modeled

注：HOMA-IR=穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)

Table 2Comparison of levels of FBG,fasting insulin and HOMA-IR among four groups of rats after 8 weeks

組別只數(shù)空腹血糖(mmol/L)空腹胰島素(mU/L)HOMA-IR空白組56.18±0.963.80±0.981.33±0.52模型組511.26±1.26a6.30±2.03a2.85±1.72aCR50%組58.38±2.53b5.43±1.262.02±0.68IF組64.31±1.17bc3.85±1.51bc0.88±0.43bcF值9.5737.9188.534P值0.0090.0480.020

注：CR50%=熱量限制50%，IF=間斷禁食；與空白組比較,aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與CR50%組比較，cP<0.05

表3　4組大鼠血脂水平比較

注：TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇；與空白組比較,aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與CR50%組比較，cP<0.05

表4　4組大鼠PPARα、PPARβ、PPARγ mRNA及其蛋白表達(dá)水平比較

注：PPAR=過氧化物酶體增殖劑激活受體；與空白組比較,aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3討論

大量研究已證實，熱量限制可增強胰島素敏感性[5]，降低空腹血糖、空腹胰島素、血脂水平[6]，改善炎癥狀態(tài)，減少動脈粥樣硬化和冠心病發(fā)生風(fēng)險[7]。在超重或肥胖人群中，熱量限制能改善胰島素抵抗，降低2型糖尿病發(fā)病率[8]。除此之外，熱量限制還可以降低心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等發(fā)病率[9]。本研究中發(fā)現(xiàn)，CR50%組大鼠空腹血糖水平較模型組降低，但空腹胰島素水平及HOMA-IR與模型組無差異，提示CR50%對空腹血糖的控制較好，但對空腹胰島素及胰島素敏感性的提高有待進(jìn)一步探討。與CR50%組比較,IF組大鼠空腹血糖水平、空腹胰島素水平、HOMA-IR均明顯降低，提示在改善糖代謝、胰島素抵抗方面，IF可能比熱量限制更有優(yōu)勢。

既往研究關(guān)于肥胖、胰島素抵抗與血清LDL-C水平的線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，兩者與血清LDL-C水平呈高度正相關(guān)，提示隨著肥胖和胰島素抵抗嚴(yán)重程度增加，血清LDL-C水平升高，腦血管疾病的發(fā)生風(fēng)險也明顯增加[10]。人體試驗和動物實驗均證實，TC和LDL-C是動脈粥樣硬化的獨立危險因素[11]，降低TC水平可以降低腦血管疾病患者病死率[12]，而HDL-C是機(jī)體的保護(hù)因素，可以回收體內(nèi)衰老細(xì)胞和死亡細(xì)胞上的膽固醇,并將其運送至肝臟而被代謝和清除，血清HDL-C水平升高可降低動脈粥樣硬化的發(fā)生風(fēng)險。在本研究中，模型組大鼠血清TC、LDL-C水平較空白組升高，說明高脂飲食可以誘導(dǎo)胰島素抵抗肥胖模型大鼠的脂代謝紊亂；與模型組和IF組比較，CR50%組大鼠血清LDL-C水平降低，提示長期低熱量飲食可通過降低血清LDL-C水平進(jìn)而降低動脈粥樣硬化、腦血管疾病的患病風(fēng)險；與模型組比較，IF組大鼠血清TC水平降低，HDL-C水平升高，提示IF可能具有較好的心血管保護(hù)作用。

根據(jù)脂肪組織的形態(tài)和功能劃分，人體有兩種脂肪組織，白色脂肪組織(white adipose tissue,WAT)和棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)[13]。WAT是以TG的形式儲存能量，主要由大量蘊含豐富脂滴的白色脂肪細(xì)胞組成。當(dāng)機(jī)體能量攝入不足時，WAT通過釋放游離脂肪酸的形式供能；當(dāng)機(jī)體能量過剩時，多余的能量以脂肪形式儲存，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加和體積的過度增大，最終導(dǎo)致肥胖。肥胖的發(fā)生是遺傳、基因突變、飲食、行為等因素綜合作用的結(jié)果,其核心環(huán)節(jié)在于脂肪細(xì)胞的過度增殖和分化，產(chǎn)生了過多的WAT[14]。肥胖是糖尿病、冠心病、動脈粥樣硬化、高血壓、高脂血癥等多種疾病的共同危險因素，因此近十年來,脂肪細(xì)胞分化逐漸成為肥胖和糖尿病等代謝性疾病研究領(lǐng)域所關(guān)注的熱點問題。脂肪細(xì)胞分化與肥胖、胰島素抵抗有著密切的關(guān)系[14]。通過調(diào)節(jié)WAT內(nèi)脂肪細(xì)胞的大小和體積、減少脂肪促炎因子的分泌，是改善胰島素抵抗的有效途徑。

PPAR作為核受體超家族的成員，是一種激素激活核受體和轉(zhuǎn)錄因子，目前已知有3種亞型：PPARα、PPARβ/δ和PPARγ。PPAR是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞生成、胰島素敏感性、炎性反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞生長和分化的重要因子[15]，其中PPARα主要存在于與脂肪酸分解代謝密切相關(guān)的組織中，包括肝臟、腎臟、心臟以及肌肉中。PPARα在脂代謝中發(fā)揮重要作用，激活 PPARα 可上調(diào)ApoA-Ⅴ表達(dá)水平，下調(diào)ApoC-Ⅲ表達(dá)水平，由此減少乳糜微粒和極低密度脂蛋白(VLDL)對TG的運送情況[16]。具有PPARα活性的貝特類調(diào)脂藥物目前廣泛用于高脂血癥的治療[17]，本研究結(jié)果顯示，各組大鼠PPARα mRNA及其蛋白表達(dá)水平無差異，分析原因可能為PPARα主要分布在肝臟、腎臟、心臟以及肌肉，在脂肪中表達(dá)極低，因此未出現(xiàn)組間差異。PPARβ廣泛分布在人體各組織中，PPARβ激活后可促進(jìn)脂肪和肌肉組織中的脂肪酸β氧化，通過抑制STAT3的轉(zhuǎn)錄活性，參與白介素6(IL-6)介導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗的形成[18]，因此PPARβ有望成為開發(fā)胰島素抵抗藥物新的有效靶點[19]。研究發(fā)現(xiàn)，PPARβ活化可以升高血清HDL-C水平，降低血清TC水平、改善高脂飲食誘發(fā)的肥胖及糖代謝紊亂[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠內(nèi)臟脂肪組織PPARβ mRNA及其蛋白表達(dá)水平較空白組降低，CR50%組和IF組大鼠內(nèi)臟脂肪組織PPARβ mRNA及其蛋白表達(dá)水平較模型組均升高，這可能是熱量控制可以提高胰島素抵抗肥胖模型大鼠血清HDL-C水平的機(jī)制之一。

PPARγ基因轉(zhuǎn)錄時由于所用啟動子和拼接方式的不同產(chǎn)生PPARγ1、PPARγ2 和PPARγ3 3種不同的亞型，PPARγ2主要在脂肪組織中表達(dá)，是脂肪細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，除此之外還參與脂肪酸氧化和脂質(zhì)代謝[21]，噻唑烷二酮類降糖藥(thiazolidinediones，TZDs)作為PPARγ的激活劑廣泛用于糖尿病的治療。本研究推測在高脂飲食的誘導(dǎo)下，胰島素抵抗肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪細(xì)胞中被激活的PPARγ啟動了脂肪細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄和分化調(diào)控，促進(jìn)了前脂肪細(xì)胞過度增殖和分化。因此，本研究通過高脂飲食成功誘導(dǎo)建立了胰島素抵抗肥胖大鼠模型，其機(jī)制可能是促進(jìn)了前脂肪細(xì)胞增殖和過度分化，這可能是模型大鼠肥胖、胰島素抵抗及糖脂代謝紊亂的機(jī)制之一。本研究中模型組大鼠PPARγ mRNA及其蛋白表達(dá)水平較空白組升高，而CR50%組、IF組大鼠PPARγ mRNA及其蛋白表達(dá)水平較模型組降低，提示CR50%和IF兩種熱量限制的干預(yù)方法可能抑制了前脂肪細(xì)胞增殖，減少了脂肪細(xì)胞數(shù)量，降低了內(nèi)臟脂肪含量，減輕了脂毒性，進(jìn)一步調(diào)節(jié)了糖脂代謝和改善了胰島素抵抗。

本課題組前期研究已證明，熱量限制不良反應(yīng)少，安全可行，能明顯改善胰島素抵抗、降低體質(zhì)指數(shù)、調(diào)節(jié)糖脂代謝[22]。本研究中也發(fā)現(xiàn)，熱量限制能降低空腹血糖、空腹胰島素水平，改善胰島素抵抗，改善脂肪代謝，其機(jī)制可能與通過抑制被激活的PPARγ，抑制內(nèi)臟脂肪組織的過度增殖和分化有關(guān)，但其內(nèi)在的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，熱量限制作為胰島素抵抗肥胖大鼠治療環(huán)節(jié)的首要內(nèi)容，伴隨著治療的始末。本研究初步探討了不同熱量限制對胰島素抵抗肥胖大鼠的作用效應(yīng)及可能機(jī)制，臨床中可根據(jù)患者能量代謝情況設(shè)置不同的熱量限制方法。

作者貢獻(xiàn)：楊玉彬進(jìn)行實驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負(fù)責(zé)；柯斌進(jìn)行實驗實施、評估、資料收集；秦鑒進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

參考文獻(xiàn)

[1]Reaven GM.Role of insulin resistance in human disease[J].Diabetes,1988,37(12):1595-1607.

[2]DeFronzo RA.Insulin resistance,hyperinsulinmia,and coronary heart disease:a complex metabolic web[J].J Cardiovasc Pharacol,1992,20(Suppl 11):S1-16.

[3]Wang JY，Gao YL，Zuo L,et al.High-glucose and high-fat diet induced insulin resistance rat model and its evaluation[J].Journal of South-Central University for Nationalities(Natural Science Edition),2013,32(1):54-57.(in Chinese)

王繼勇,高云麗,左洛,等.高糖高脂飲食誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗模型和評價[J].中南民族大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2013,32(1):54-57.

[4]Tang JH,Yan HD.Establishment and evaluation of rats model with nutritional obesity[J].Journal of Tongji University(Medical Science)，2010,31(1)：32-34.(in Chinese)

湯錦花,嚴(yán)海東.營養(yǎng)性肥胖大鼠模型的建立及評價[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2010,31(1)：32-34.

[5]Baumeier C,Kaiser D,Heeren J,et al.Caloric restriction and intermittent fasting alter hepatic lipid droplet proteome and diacylglycerol species and prevent diabetes in NZO mice[J].Biochim Biophys Acta,2015,1851(5):566-576.

[6]Omodei D,Fontana L.Calorie restriction and prevention of age-associated chronic disease[J].FEBS Lett,2011,585(11):1537-1542.

[7]Bales CW,Kraus WE.Caloric restriction:implications for human cardiometabolic health[J].J Cardiopulm Rehabil Prev,2013,33(4):201-208.

[8]Sung MM,Dyck JR.Age-related cardiovascular disease and the beneficial effects of calorie restriction[J].Heart Fail Rev,2012,17(4/5):707-719.

[9]Ryder JR,Vega-López S,Djedjos CS,et al.Abdominal adiposity,insulin resistance,and oxidized low-density lipoproteins in Latino adolescents[J].Diabetol Metab Syndr,2013,5(1):72.

[10]Wilkins JT,Li RC,Sniderman A,et al.Discordance between apolipoprotein B and LDL-Cholesterol in young adults predicts coronary artery calcification:the CARDIA study[J].J Am Coll Cardiol,2016,67(2):193-201.

[11]Zhu CG,Zhang Y,Xu RX,et al.Circulating non-HDL-C levels were more relevant to atherogenic lipoprotein subfractions compared with LDL-C in patients with stable coronary artery disease[J].J Clin Lipidol,2015,9(6):794-800.

[12]Mazalin Protulipac J,Sonicki Z,Reiner Z.Cardiovascular disease(CVD) risk factors in older adults-perception and reality[J].Arch Gerontol Geriatr,2015,61(1):88-92.

[13]Hilton C,Karpe F,Pinnick KE.Role of developmental transcription factors in white,brown and beige adipose tissues[J].Biochim Biophys Acta,2015,1851(5):686-696.

[14]Alponti RF,Silveira PF.Adipocyte aminopeptidases in obesity and fasting[J].Mol Cell Endocrinol,2015,415:24-31.

[15]Mello T.Nuclear receptors in the regulation of lipid metabolism[J].Curr Cardiovasc Risk Rep,2010,4(2):142-149.

[16]Desai NK,Ooi EM,Mitchell PD,et al.Metabolism of apolipoprotein A-Ⅱ containing triglyceride rich ApoB lipoproteins in humans[J].Atherosclerosis,2015,241(2):326-333.

[17]Liu S,Hatano B,Zhao M,et al.Role of peroxisome proliferator-activated receptor δ/β in hepatic metabolic regulation[J].J Biol Chem,2011,286(2):1237-1247.

[18]Serrano-Marco L,Barroso E,El Kochairi I,et al.The peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR) β/δ agonist GW501516 inhibits IL-6-induced signal transducer and activator of transcription 3(STAT3) activation and insulin resistance in human liver cells[J].Diabetologia,2012,55(3):743-751.

[19]Bojic LA,Burke AC,Chhoker SS,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor δ agonist GW1516 attenuates diet-induced aortic inflammation,insulin resistance,and atherosclerosis in low-density lipoprotein receptor knockout mice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2014,34(1):52-60.

[20]Tenenbaum A,Fisman EZ.Balanced pan-PPAR activator bezafibrate in combination with statin:comprehensive lipids control and diabetes prevention?[J].Cardiovasc Diabetol,2012,11:140.

[21]Tontonoz P,Hu E,Spiegelman BM.Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2,a lipid-activated transcription factor[J].Cell,1994,79(7):1147-1156.

[22]Yang YB,Qin J,Ke B,et al.Effect of linguizhugan decoction on hyperlipidemia rats with intermittent fasting[J].J Tradit Chin Med,2013,33(2):250-252.

(本文編輯：陳素芳)

Effects of Different Calorie Restriction Methods on Glycolipid Metabolism and Adipocytes Differentiation in Obesity and Insulin Resistance Rat

YANGYu-bin,KEBin,QINJian.

DepartmentofTraditionalChineseMedicine,theFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effects of different calorie restriction methods on glycolipid metabolism and adipocytes differentiation in obesity and insulin resistance(IR) rat.MethodsFrom October 2013 to March 2014,40 Wistar male of SPF grade rats aged 5 weeks were randomly divided into control group(n=5) and high fat diet(HFD) group(n=35) by random number table method.Rats in control group were fed with standard diet,and rats in HFD group were fed with high fat diet.Obesity & IR rats were randomly divided into three groups by random number table method:model group,CR50% group and IF group.Rats in control group were keep on fed with standard diet,and rats in model group were keep on fed with high fat diet,Diet supplied for CR50% group was one half that of model group,rats in IF group were fed with incontinuous diet,8 weeks.After the experiment,all rats were sacrificed.Serum levels of FBG,fasting insulin,homeostasis model assessment for insulin resistance(HOMA-IR),total cholesterol(TC),triglyceride(TG),low density lipoprotein-cholesterol(LDL-C) and high density lipoprotein-cholesterol(HDL-C) were measured.Expression levels of mRNA and protein of PPARα,PPARβ,PPARγ were determined by RT-qPCR and Western blotting.ResultsAfter modeled,levels of FBG,fasting insulin and HOMA-IR of rats in HFD group were significantly higher than those of rats in control group(P<0.05).After 8 weeks,levels of FBG,fasting insulin and HOMA-IR of rats in model group were significantly higher than those in control group(P<0.05).FBG level of rats in CR50% group were significantly lower than that in model group(P<0.05).Levels of FBG,fasting insulin and HOMA-IR of rats in IF group were significantly lower than those in model group and CR50% group(P<0.05).Levels of TC and LDL-C of rats in model group were significantly higher than those in control group(P<0.05).LDL-C level of rats in CR50% group was significantly lower than that in model group(P<0.05).TC level of rats in IF group was significantly lower than that in model group,HDL-C level of rats in IF group was significantly higher than that in model group,LDL-C level of rats in IF group was significantly higher than that in CR50% group(P<0.05).Expression levels of mRNA and protein of PPARβ in model group were significantly lower than those in control group,expression levels of mRNA and protein of PPARγ in model group were significantly higher than those in control group(P<0.05).Expression levels of mRNA and protein of PPARβ in CR50% group and IF group were significantly higher than those in model group,expression levels of mRNA and protein of PPARγ in CR50% group and IF group were significantly lower than those in model group(P<0.05).ConclusionFor obesity and IR rats,CR50% and IF can improve their glycolipid metabolism by adjusting adipocyte differentiation,IF can improve insulin resistance better.The mechanism may be related to PPRA signal transduction pathway.

【Key words】Insulin resistance；Obesity；Lipid metabolism disorders；Adipocytes;Rats

基金項目：廣東省自然科學(xué)基金博士科研啟動項目(2014A030310249)；廣東省中醫(yī)藥管理局科研課題(20151160)

通信作者：秦鑒，510080廣東省廣州市，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科；E-mail：myxs32@126.com

【中圖分類號】R 589.25

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.18.009

(收稿日期：2015-08-16；修回日期：2016-03-02)