輔助性T淋巴細胞17/調節(jié)性T淋巴細胞平衡在乙型肝炎病毒感染相關肝纖維化進展過程中的作用研究

劉懷鄂，游 晶，洪 敏，張艷梅，張 祿，陸麗蓉，張茹薏，丁 潔

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·論著·

輔助性T淋巴細胞17/調節(jié)性T淋巴細胞平衡在乙型肝炎病毒感染相關肝纖維化進展過程中的作用研究

劉懷鄂，游 晶，洪 敏，張艷梅，張 祿，陸麗蓉，張茹薏，丁 潔

650032云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院感染科(劉懷鄂，游晶，張艷梅，張祿，陸麗蓉，張茹薏，丁潔)，腫瘤治療中心(洪敏)

【摘要】目的探討輔助性T淋巴細胞17(Th17)/調節(jié)性T淋巴細胞(Treg)平衡在乙型肝炎病毒(HBV)感染相關肝纖維化進展過程中的作用。方法選取2011年1月—2015年6月昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院收治的未經抗病毒治療的HBV感染者104例為研究對象，依據肝臟硬度測量值(LSM)將患者分為輕度肝纖維化組29例(LSM<9.7 kPa)、中度肝纖維化組53例(9.7 kPa≤LSM<17.5 kPa)、重度肝纖維化組22例(LSM≥17.5 kPa)。記錄所有患者性別、年齡、乙型肝炎家族史、體質指數(BMI)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)。采用流式細胞儀檢測外周血中Th17、Treg表達率，計算Th17/Treg比值。結果3組患者性別、乙型肝炎家族史、BMI比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；中度肝纖維化組、重度肝纖維化組患者年齡大于輕度肝纖維化組，ALT水平高于輕度肝纖維化組(P<0.05)；重度肝纖維化組患者年齡大于中度肝纖維化組(P<0.05)。中度肝纖維化組患者Th17表達率、Th17/Treg比值高于輕度肝纖維化組(P<0.05)；重度肝纖維化組患者Treg表達率低于輕度肝纖維化組，Th17/Treg比值高于輕度肝纖維化組(P<0.05)。Th17表達率為2.5%(3.6%)，Treg表達率為1.0%(1.0%)，ALT水平為47.2(36.2)U/L，LSM為12.8(6.9)kPa。Th17表達率與Treg表達率呈正相關(rs=0.231，P=0.018)；LSM與Th17表達率(rs=0.162，P=0.428)、ALT水平(rs=0.201，P=0.526)無直線相關關系；LSM與Treg表達率呈負相關(rs=-0.215，P=0.041)；LSM與Th17/Treg比值呈正相關(rs=0.268，P=0.019)。結論在HBV感染致相關肝纖維化進程中，Th17調控作用不明確，Treg有明顯的負向調控作用，Th17/Treg平衡具有重要意義。

【關鍵詞】乙型肝炎病毒；肝纖維化；T淋巴細胞，輔助；T淋巴細胞，調節(jié)性

劉懷鄂，游晶，洪敏，等.輔助性T淋巴細胞17/調節(jié)性T淋巴細胞平衡在乙型肝炎病毒感染相關肝纖維化進展過程中的作用研究[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(18)：2126-2129.[www.chinagp.net]

Liu HE，You J，Hong M,et al.Study on the role of the balance Th17/Treg in the development of hepatitis B virus-related liver fibrosis[J].Chinese General Practice，2016，19(18)：2126-2129.

肝硬化及其相關并發(fā)癥是導致乙型肝炎病毒(HBV)感染相關肝臟疾病患者死亡的主要原因，據世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年約有65萬人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化、肝癌[1]。而導致肝硬化，甚至肝硬化失代償的病理學基礎是肝組織纖維化進展。但究竟對肝臟炎性反應具有調節(jié)作用的輔助性T淋巴細胞17(Th17)和調控作用的調節(jié)性T淋巴細胞(Treg)在HBV感染患者肝纖維化進展過程中的作用如何，尚缺乏足夠的研究。本研究通過比較不同肝纖維化程度的HBV感染患者外周血Th17、Treg表達率及Th17/Treg比值的變化情況，觀察Th17/Treg細胞平衡在HBV感染患者肝纖維化進展過程中的作用。

1材料和方法

1.1納入與排除標準納入標準：(1)符合2010版《慢性乙型肝炎防治指南》[2]中乙型肝炎的診斷標準；(2)體質指數(body mass index,BMI)<28 kg/m2[3]；(3)丙氨酸氨基轉移酶(ALT)<80 U/L[4]。排除標準：(1)甲、丙、丁、戊型肝炎及免疫缺陷性疾病；(2)肝癌、自身免疫性疾病、脂肪肝、酒精肝；(3)吸毒史及毒物接觸史；(4)孕婦和體內植入活性醫(yī)療器械；(5)B超提示腹腔積液。

1.2研究對象選取2011年1月—2015年6月昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院門診及住院部收治的未經抗病毒治療的HBV感染者104例為研究對象，均符合納入與排除標準。依據肝臟硬度測量值(liver stillness measurement，LSM)將患者分為輕度肝纖維化組29例(LSM<9.7 kPa)、中度肝纖維化組53例(9.7 kPa≤LSM<17.5 kPa)、重度肝纖維化組22例(LSM≥17.5 kPa)。本研究經昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.3方法

1.3.1一般資料記錄所有患者性別、年齡、乙型肝炎家族史、BMI、ALT。清晨空腹采集所有患者靜脈血2～3 ml，置入EDTA抗凝管中，采用全自動生化分析儀奧林巴斯AU-5400及配套試劑檢測ALT水平；患者取平臥位，按照FibroScan-502肝纖維化掃描儀(法國愛科森公司)操作說明測量患者體表相同部位的LSM。

1.3.2Th17、Treg表達率檢測采集所有患者清晨空腹靜脈血2～3 ml，置入EDTA抗凝管中，采用密度梯度離心法提取外周血單個核細胞(PBMC)備用。每1×106個細胞加入佛波酯(PMA，SIGMA公司)50 ng/ml、離子霉素(Ion，SIGMA公司)1 μg/ml，并在含高爾基蛋白轉換抑制劑的1640培養(yǎng)基中刺激5 h。以250×g離心5 min后，將重懸的細胞按流式細胞儀檢測試劑盒(BD公司)要求進行固定、染色、透化處理〔Th17采用白介素17細胞內染色，Treg采用叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子(Foxp3)細胞內染色〕，標記后的細胞采用流式細胞儀檢測，并采用Diva軟件分析Th17、Treg表達率，計算Th17/Treg比值。

2結果

2.13組患者一般資料比較3組患者性別、乙型肝炎家族史、BMI比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；3組患者年齡、ALT水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中度肝纖維化組、重度肝纖維化組患者年齡大于輕度肝纖維化組，ALT水平均高于輕度肝纖維化組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；重度肝纖維化組患者年齡大于中度肝纖維化組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.23組患者外周血中Th17、Treg表達率、Th17/Treg比值比較3組患者Th17、Treg表達率、Th17/Treg比值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。中度肝纖維化組患者Th17表達率、Th17/Treg比值高于輕度肝纖維化組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；重度肝纖維化組患者Treg表達率低于輕度肝纖維化組，Th17/Treg比值高于輕度肝纖維化組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

表1　3組患者一般資料比較

注：a為χ2值；與輕度肝纖維化組比較，bP<0.05；與中度肝纖維化組比較，cP<0.05；BMI=體質指數，ALT=丙氨酸氨基轉移酶

表23組患者外周血中Th17、Treg表達率及Th17/Treg比值比較

〔M(QR)〕

Table 2Comparison of Th17 and Treg frequency,Th17/Treg ratio in peripheral blood among the three groups

組別例數Th17表達率(%)Treg表達率(%)Th17/Treg比值輕度肝纖維化組291.6(1.9)1.1(1.3)1.2(2.0)中度肝纖維化組533.0(4.3)a1.0(1.1)3.3(4.4)a重度肝纖維化組222.9(2.8)0.7(0.6)a3.5(5.5)aH值7.6546.11515.580P值0.0220.0470.001

注：與輕度肝纖維化組比較，aP<0.05；Th17=輔助性T淋巴細胞17，Treg=調節(jié)性T淋巴細胞

2.3相關性分析Th17表達率為2.5%(3.6%)，Treg表達率為1.0%(1.0%)，ALT水平為47.2(36.2)U/L，LSM為12.8(6.9)kPa。Th17表達率與Treg表達率呈正相關(rs=0.231，P=0.018)；LSM與Th17表達率(rs=0.162，P=0.428)、ALT水平(rs=0.201，P=0.526)無直線相關關系；LSM與Treg表達率呈負相關(rs=-0.215，P=0.041)；LSM與Th17/Treg比值呈正相關(rs=0.268，P=0.019)。

3討論

既往關于肝纖維化進展機制的相關研究主要集中在肝星形細胞活化、肝內細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的異常堆積、轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)在肝纖維化進展中的作用等方面。多數研究認為，當肝臟受到炎性反應機械刺激等損傷時，肝星形細胞將被激活，從而產生膠原、蛋白多糖、糖蛋白等細胞外基質，導致ECM異常堆積，最終導致肝纖維化的發(fā)生[5-9]。TGF-β可以通過激活Smad信號通路活化肝星形細胞，促進ECM的產生，同時抑制膠原酶分解[10]。也有研究認為，肝臟非特異性免疫細胞在肝纖維化進展中發(fā)揮重要作用，如自然殺傷細胞可以通過清除活化的肝星形細胞來減少肝纖維化[11]，但究竟肝臟炎癥的調控細胞在肝纖維化進展過程中的作用如何并不清楚。

肝臟的損傷與修復失衡是肝纖維化進展的重要原因之一，而既往研究一定程度上忽視了肝臟炎癥調控細胞在肝臟纖維化進展過程中的意義，尤其是對于慢性持續(xù)性肝臟炎性反應患者，如慢性乙型肝炎，其肝臟炎癥調控細胞在肝纖維化進展過程中的作用可能更為重要。早期臨床研究發(fā)現，Treg通過白介素10調控TGF-β在組織纖維化中的作用[12]。而近期關于丙型肝炎、血吸蟲肝硬化、阻塞性黃疸的研究亦證實，活化Treg對組織纖維化進程存在控制作用[13-15]。也有研究提出，Th17在HBV感染過程中具有促進肝纖維化進展的作用[16]，Th17/Treg失衡可能在四氯化碳誘導的肝纖維化進展中發(fā)揮促進作用[17]。有關腹膜纖維化的研究結果發(fā)現，使用能夠活化Treg和減少白介素17產生的免疫調節(jié)藥物可以減少纖維化的發(fā)生[18]。但關于HBV感染的相關研究認為，Treg會抑制針對HBV的免疫反應，最終可能使HBV無法清除，進而導致炎癥持續(xù)活動、肝纖維化進展。Th17、Treg以及Th17/Treg平衡在HBV感染患者相關肝纖維化進展中的作用研究非常有限，這使得對炎癥調控具有重要意義的Th17及Treg在HBV感染患者相關肝纖維化進展中的作用尚不清楚。

本研究結果顯示，3組患者性別、乙型肝炎家族史、BMI間無差異，而年齡間差異明顯，且重度肝纖維化組患者年齡最大，輕度肝纖維化組患者年齡最小，提示隨著年齡的增加，肝纖維化程度有進行性加重趨勢。中度肝纖維化患者及重度肝纖維化患者的ALT水平均高于輕度肝纖維化患者，提示肝臟炎性反應在肝臟纖維化進展中存在促進作用。中度肝纖維化組患者Th17表達率、Th17/Treg比值高于輕度肝纖維化組；重度肝纖維化組患者Treg表達率低于輕度肝纖維化組，Th17/Treg比值高于輕度肝纖維化組，提示Th17在HBV感染患者肝纖維化進展過程中并不能獨立發(fā)揮促進作用，而Treg在肝纖維化進展過程中的負向調節(jié)作用比較明確，Th17/Treg比值可以獨立、準確地反映肝纖維化進展情況。有研究顯示，Th17/Treg失衡可能廣泛存在于肝纖維化進展的患者中，這可能是導致肝星形細胞活化的重要原因[19]。相關性分析結果顯示，Th17表達率與Treg表達率呈正相關。LSM與Th17表達率、ALT水平無直線相關關系，LSM與Treg表達率呈負相關,LSM與Th17/Treg比值呈正相關；提示對于HBV感染患者，其外周血Th17、Treg間存在平衡關系，單獨的Th17表達率及ALT水平無法反映肝臟實際的纖維化情況，而Treg表達率、Th17/Treg比值與肝纖維化程度有較好的一致性，本研究結果與相關研究結果類似[11-13]。但本研究缺乏動態(tài)的延續(xù)性試驗結果，連續(xù)性地觀察多個時間點的外周血Th17、Treg表達率可提高結果的可靠性。

綜上所述，Th17、Treg雖然同為HBV感染患者肝纖維化進展過程中炎性反應的重要調控細胞，但Th17在肝纖維化進展過程中調控作用不明確，Treg有明顯的負向調控作用，且Th17/Treg平衡具有重要意義。這為臨床在慢性乙型肝炎患者抗病毒治療的同時如何能最大限度的保存肝臟功能、維持肝臟的正常組織學形態(tài)提供了新的思路。

作者貢獻：劉懷鄂、游晶進行試驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；洪敏、張艷梅、張祿、陸麗蓉、張茹薏、丁潔進行試驗實施、評估、資料收集；游晶進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：毛亞敏)

Study on the Role of the Balance Th17/Treg in the Development of Hepatitis B Virus-related Liver Fibrosis

LIUHuai-e，YOUJing，HONGMin,etal.

DepartmentofInfectiousDisease，theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650032，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of the balance between T helper 17 cells(Th17) /regulatory T cells(Treg) in the development of hepatitis B virus-related(HBV-related) liver fibrosis.MethodsA total of 104 HBV-infected people from the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University were recruited from January 2011 to June 2015,all patients had no antiviral treatment history.Based on the liver stiffness measurements(LSM),all patients were divided into mild hepatic fibrosis group(LSM <9.7 kPa,29 cases),moderate liver fibrosis group(9.7 kPa≤LSM <17.5 kPa,53 cases) and severe liver fibrosis group(LSM≥17.5 kPa,22 cases).The sex,age,family history of hepatitis B,body mass index(BMI),and alanine aminotransferase(ALT) were recorded in all patients.To find cell frequency of Th17 and Treg in peripheral blood by using flow cytometry,then the ratio of Th17/Treg was calculated.ResultsThere was no significant difference in the sex,family history of hepatitis B and BMI among the three groups(P>0.05).The age of moderate hepatic fibrosis group and severe liver fibrosis group were higher than that in mild hepatic fibrosis group,and ALT levels were higher than that in the mild hepatic fibrosis group(P<0.05).The age of severe liver fibrosis group was higher than that in moderate hepatic fibrosis group(P<0.05).Th17 frequency and the ratio of Th17 to Treg in moderate liver fibrosis group was significantly higher than those in mild liver fibrosis group(P<0.05)；Treg frequency in severe liver fibrosis group was significantly lower than that in mild liver fibrosis group,but the ratio of Th17 to Treg in severe liver fibrosis group was significantly higher than that in mild liver fibrosis group(P<0.05).Th17 frequency was 2.5%(3.6%),Treg frequency was 1.0%(1.0%),ALT level was 47.2(36.2) U/L,LSM was 12.8(6.9) kPa.The frequency of Th17 were positively correlated with frequency of Treg(rs=0.231，P=0.018)； there was no linear correlation between the LSM and the Th17 frequency(rs=0.162，P=0.428) or ALT levels (rs=0.201，P=0.526)； the frequency of Treg was negatively correlated with LSM(rs=-0.215，P=0.041)； the ratio of Th17/Treg was positively correlated with LSM (rs=0.268，P=0.019).ConclusionIn the development of HBV-related liver fibrosis，the regulatory effects of Th17 was not clear,Treg have obvious regulatory effects，the balance Th17/Treg has important significance.

【Key words】Hepatitis B virus；Liver fibrosis；T-lymphocytes,helper；T-lymphocytes,regulatory

基金項目:云南省科技廳應用基礎研究面上項目(2011FZ121)

通信作者：游晶，650032云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院感染科；E-mail：jingyoukm@126.com

【中圖分類號】R 575.2

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.18.003

(收稿日期：2016-03-08；修回日期：2016-05-15)

·專題研究·