銀線(xiàn)草HPLC指紋圖譜研究

袁琴琴

(1．菏澤學(xué)院生命科學(xué)系，山東菏澤 274000；2．陜西師范大學(xué)藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710062)

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銀線(xiàn)草HPLC指紋圖譜研究

袁琴琴1，2

(1．菏澤學(xué)院生命科學(xué)系，山東菏澤 274000；2．陜西師范大學(xué)藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710062)

摘要[目的]建立銀線(xiàn)草HPLC指紋圖譜研究方法，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。[方法]采用高效液相色譜法，色譜柱為Phenomenex C18(250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相甲醇-0.1%甲酸線(xiàn)性梯度洗脫，流速為 0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm；柱溫25 ℃。[結(jié)果]建立了銀線(xiàn)草HPLC指紋圖譜共有模式，并標(biāo)定12個(gè)共有峰，13批樣品指紋圖譜相似度在0.714～0.957。[結(jié)論]不同產(chǎn)地的銀線(xiàn)草化學(xué)成分存在一定差異，所建立的指紋圖譜方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，為銀線(xiàn)草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞銀線(xiàn)草；HPLC；指紋圖譜

Key wordsChloranthusjaponicusSieb.; HPLC; Fingerprint

銀線(xiàn)草(ChloranthusjaponicusSieb.)為金粟蘭科金粟蘭屬多年生草本植物[1]，主產(chǎn)于我國(guó)黑龍江、遼寧、吉林、陜西、山西和甘肅等省，以根或全草入藥[2]，多生于海拔500～2 300 m的山坡、山谷雜木林下陰濕處或溝邊草叢中，喜富含腐殖質(zhì)、濕潤(rùn)而排水良好的土壤[3]。由于受產(chǎn)地、氣候和生態(tài)因子等的影響，不同產(chǎn)地的銀線(xiàn)草成分有一定差異，然而僅對(duì)其主要成分的含量進(jìn)行測(cè)定不能有效地控制銀線(xiàn)草的質(zhì)量。目前，指紋圖譜技術(shù)已成為控制中藥材質(zhì)量的最重要手段之一，可以從整體上評(píng)價(jià)中藥材的質(zhì)量[4-5]。筆者以13個(gè)主產(chǎn)區(qū)的銀線(xiàn)草為研究對(duì)象，選擇迷迭香酸為參照峰，構(gòu)建銀線(xiàn)草HPLC的指紋圖譜，為銀線(xiàn)草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料2011年6～8月對(duì)陜西、吉林、遼寧及黑龍江4個(gè)主產(chǎn)省份的銀線(xiàn)草資源進(jìn)行調(diào)查和收集，經(jīng)陜西師范大學(xué)生命科學(xué)院田先華教授鑒定為金粟蘭科金粟蘭屬植物銀線(xiàn)草(ChloranthusjaponicusSieb.)(表1)。

表1　銀線(xiàn)草樣品的來(lái)源

1.2儀器與試劑LC2010 AHT 高效液相色譜儀(日本島津公司)，SL202N 電子秤(賽多里斯科學(xué)儀器北京有限公司)，MILLI-Q 超純水儀器(MILLIPORE公司)，RE250AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器(上海亞榮儀器公司)，KQ5200超聲波清洗器(江蘇昆山儀器有限公司)，DFT-50手提式粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)，甲醇(美國(guó)Fisher公司，色譜純)，甲酸(天津市天力化學(xué)試劑有限公司，分析純)，所用水均為超純水。標(biāo)準(zhǔn)品：迷迭香酸(批號(hào)：07902PH，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，色譜柱Phenomenex C18(250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)(美國(guó)Phenomenex公司)。

1.3方法

1.3.1HPLC色譜條件。色譜柱采用Phenomenex C18(250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動(dòng)相A：甲酸水，流動(dòng)相B：甲醇；洗脫條件：0～5 min，甲醇15%～25%；5～20 min，甲醇25%～30%；20～45 min，甲醇30%～40%；45～95 min，甲醇40%～60%。流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm，柱溫25 ℃，記錄時(shí)間95 min；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2溶液的制備。

1.3.2.1對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取迷迭香酸對(duì)照品適量，溶于甲醇溶液，濃度為0.12 mg/mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后作為對(duì)照品溶液備用。

1.3.2.2供試品溶液的制備。取銀線(xiàn)草粉末1.0 g，精密加5 mL 70%甲醇超聲提取30 min，提取2次，合并提取液，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得銀線(xiàn)草樣品溶液。

2結(jié)果與分析

2.1方法學(xué)考察

2.1.1精密度。精密稱(chēng)取S12號(hào)樣品(陜西寶雞紅河谷)粉末，按照“1.3.2.2”方法進(jìn)行樣品提取，按照“1.3.1”的色譜條件進(jìn)樣5次，通過(guò)中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件計(jì)算各色譜的相似度均大于0.92，以11號(hào)峰為參照峰，12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明該儀器的精密度良好，符合指紋圖譜的要求。

2.1.2穩(wěn)定性。取S13號(hào)樣品(陜西寶雞太白山)粉末，按照“1.3.2.2”方法制備供試品溶液，按照“1.3.1”的色譜條件，分別在0、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，所測(cè)得的色譜指紋圖譜無(wú)明顯變化，通過(guò)中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件計(jì)算各色譜的相似度均大于0.92。以11號(hào)峰為參照峰，12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3重復(fù)性。準(zhǔn)確稱(chēng)取S13號(hào)樣品(陜西寶雞太白山)粉末5份，按“1.3.2.2”方法制備樣品溶液，按照“1.3.1”的色譜條件分別進(jìn)樣，通過(guò)中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件計(jì)算各色譜的相似度均大于0.92。以11號(hào)峰為參照峰，12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性較好，符合指紋圖譜的要求。

2.2銀線(xiàn)草HPLC指紋圖譜的建立與分析

2.2.1銀線(xiàn)草指紋圖譜的測(cè)定。稱(chēng)取13個(gè)地點(diǎn)的銀線(xiàn)草粉末1 g，按“1.3.2.2”的方法制備供試品溶液，按照“1.3.1”的色譜條件依次將13批次銀線(xiàn)草樣品進(jìn)行HPLC檢測(cè)，將13個(gè)銀線(xiàn)草指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”進(jìn)行色譜峰匹配，共有模式指紋圖譜中標(biāo)定12個(gè)共有峰，構(gòu)成銀線(xiàn)草指紋圖譜的特征峰，并得到共有模式對(duì)照指紋圖譜(圖1、2) 。

圖1　13批次銀線(xiàn)草樣品HPLC色譜Fig.1　The HPLC of 13 batches of Chloranthus japonicus Sieb.

圖2　共有模式對(duì)照指紋圖譜Fig.2　Fingerprint of common pattern

2.2.2銀線(xiàn)草指紋圖譜的技術(shù)參數(shù)。《中國(guó)藥典》(2010)規(guī)定金粟蘭科草珊瑚屬腫節(jié)風(fēng)藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為異秦皮啶和迷迭香酸，且含量不低于0.02%[6-7]，迷迭香酸在銀線(xiàn)草中含量較高，遠(yuǎn)高于藥典規(guī)定的0.02%，且較穩(wěn)定，故選11號(hào)峰迷迭香酸為參照峰。利用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”，依據(jù)13批次銀線(xiàn)草供試品HPLC圖譜所給出的相關(guān)技術(shù)參數(shù)，通過(guò)色譜峰的自動(dòng)匹配，確定了13批次供試品的12個(gè)共有峰，即為其共有指紋峰。迷迭香酸設(shè)為參照峰S，設(shè)置參照峰的保留時(shí)間和峰面積為1.000，計(jì)算出其他共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間(表2、3)。

2.2.3相似度評(píng)價(jià)。將13批次銀線(xiàn)草的指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”，以S2號(hào)批次(黑龍江省哈爾濱市帽兒山)圖譜為對(duì)照?qǐng)D譜，使用中位數(shù)矢量法，生成了參照?qǐng)D譜。選擇迷迭香酸這個(gè)共有峰作為校正的mark峰，生成13個(gè)產(chǎn)地的銀線(xiàn)草指紋圖譜。不同批次的銀線(xiàn)草指紋圖譜的相似度是以S2號(hào)銀線(xiàn)草的圖譜作為對(duì)照?qǐng)D譜生成的參照?qǐng)D譜，計(jì)算各指紋圖譜間的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積與參照譜圖比較 。結(jié)果顯示，13個(gè)產(chǎn)地的銀線(xiàn)草樣品指紋圖譜具有較高的相似性，但也表現(xiàn)出一定差異，S4號(hào)吉林永吉縣雙河鎮(zhèn)、S5號(hào)吉林磐石市煙筒山、S7號(hào)吉林磐石市新發(fā)北山相似度較高，在0.944以上；S6號(hào)吉林磐石市大荒山、S12陜西省寶雞市紅河谷的相似度較低；其他批次的指紋圖譜相似度在0.816～0.897。

表2　銀線(xiàn)草共有蜂的相對(duì)保留時(shí)間

表3　銀線(xiàn)草共有蜂的相對(duì)峰面積

表4　不同產(chǎn)地銀線(xiàn)草指紋圖譜相似度

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)對(duì)銀線(xiàn)草處理方法和HPLC色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)不同提取溶劑及濃度進(jìn)行了篩選，結(jié)果以70%甲醇提

取效果較高。在提取方法上，比較了超聲與加熱回流以及不同提取時(shí)間，結(jié)果表明，采用超聲提取30 min提取效率較高。在流動(dòng)相選擇上，比較了乙腈、甲醇與水、甲酸、醋酸、磷酸溶液等組合，確定以甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫效果最佳。在檢測(cè)波長(zhǎng)選擇方面，采用DAD 檢測(cè)器于 200～400 nm 下檢測(cè)樣品，結(jié)果顯示，在 323 nm 下各峰有良好的吸收。

該研究采用HPLC方法，對(duì)陜西、黑龍江、吉林和遼寧4個(gè)主產(chǎn)省份銀線(xiàn)草藥材的指紋圖譜進(jìn)行了研究。以迷迭香酸為參照峰，13批次銀線(xiàn)草的特征指紋圖譜中有12個(gè)共有峰，盡管共有峰的保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，但相對(duì)峰面積卻有一定的差異，表現(xiàn)為各產(chǎn)地銀線(xiàn)草藥材的相似度降低。表明不同產(chǎn)地的銀線(xiàn)草成分存在一定差異，可能由于藥材受氣候、海拔、產(chǎn)地、經(jīng)緯度等生態(tài)因子的影響。

該研究以穩(wěn)定性、精密度和重現(xiàn)性為依據(jù)，考查了銀線(xiàn)草指紋圖譜的方法學(xué)，結(jié)果表明，主要峰的相對(duì)峰面積以及相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均低于3%，說(shuō)明該方法適用于建立銀線(xiàn)草指紋圖譜，且系統(tǒng)穩(wěn)定，符合中藥指紋圖譜建立的技術(shù)要求。運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)軟件對(duì)銀線(xiàn)草指紋圖譜的相似度進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)13個(gè)產(chǎn)地的銀線(xiàn)草指紋圖譜存在一定差異，S4號(hào)吉林永吉縣雙河鎮(zhèn)、S5號(hào)吉林磐石市煙筒山、S7號(hào)吉林磐石市新發(fā)北山相似度很高，在0.944以上；S6吉林磐石市大荒山、S12陜西省寶雞市紅河谷的相似度較低；其他批次的指紋圖譜相似度在0.816～0.897。

該研究建立的HPLC方法能夠適用于銀線(xiàn)草的指紋圖譜分析，符合中藥指紋圖譜建立的要求，為銀線(xiàn)草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

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基金項(xiàng)目西安市科技創(chuàng)新支撐計(jì)劃項(xiàng)目[CXY1018(3)]；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(CK201002010)。

作者簡(jiǎn)介袁琴琴(1986- )，女，山東菏澤人，助教，碩士，從事植物生物技術(shù)研究。

收稿日期2016-03-26

中圖分類(lèi)號(hào)S 188

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)13-138-03

HPLC Fingerprint ofChloranthusjaponicusSieb.

YUAN Qin-qin1，2

(1. Department of Life Science, Heze University, Heze, Shandong 274000; 2. Key Laboratory of Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry of Ministry of Education, National Engineering Laboratory for Resource Developing of Endangered Chinese Crude Drug in Northwest of China, Shaanxi Normal University, Xi’an, Shaanxi 710062)

Key words[Objective] To establish a method of HPLC fingerprint analysis on Chloranthus japonicus Sieb., and to provide references for the quality control. [Method] High-performance liquid chromatography was adopted. The chromatographic column was Phenomenex C18(250.0 mm × 4.6 mm, 5.0 μm); mobile phase was methanol-0.1% formic acid with linear gradient elution; flow rate was 0.8 mL/min; detection wavelength was 323 nm and the column temperature was maintained at 25 ℃. [Result] HPLC fingerprint of C. japonicus was established. Twelve main marker peaks were selected. Fingerprint similarities of 13 sample batches were distributed between 0.714 and 0.957. [Conclusion] There are certain differences in the chemical components of C. japonicus in different production areas. The established fingerprint method is simple, accurate, reliable and repeatable, which provides scientific references for the quality standard establishment of C. japonicus.