谷物及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其衍生物的檢測(cè)及污染規(guī)律分析

龔 蕾，韓 智，程 慧，劉 杰，彭青枝*

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070）

真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，谷物在生產(chǎn)、儲(chǔ)藏或加工不當(dāng)時(shí)，均可能發(fā)生霉變，從而產(chǎn)生真菌毒素[1]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）又稱嘔吐毒素，DON及其衍生物是糧食類作物霉變產(chǎn)生的分布最廣泛、影響較大的單端孢霉烯族化合物之一[2]。世界各地均發(fā)現(xiàn)DON及其衍生物存在，主要是小麥、玉米、燕麥等農(nóng)作物；DON及其衍生物除引起腹瀉、嘔吐、發(fā)燒甚至死亡等癥狀外，還可能會(huì)導(dǎo)致貧血、食管癌、克山病等疾病發(fā)生[3]。DON及其衍生物可以和其他毒素產(chǎn)生協(xié)同作用而加強(qiáng)毒性，使得中毒癥狀更為復(fù)雜[4]。

李瑞園等[5]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法測(cè)定分析200 份糧食類樣品中DON及其衍生物的含量，其中小麥、大麥、玉米及燕麥均有DON檢出，其檢出率分別為32%、40%、51%和25%。DON含量范圍為7.7～244 mg/kg，另外，47 份的玉米中DON含量已超過(guò)國(guó)家1 000 μg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)。有研究表明[6]，利用含有DON的小麥做加工實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)磨粉并不會(huì)使DON總含量減少，只是小麥不同組分間進(jìn)行了重新分配，其中，DON含量最高的是麩皮和胚芽部分。面條、饅頭和包子等都屬于谷物加工品，有研究者認(rèn)為經(jīng)加工處理后，谷物中DON應(yīng)該有所去除，然而，DON在不同的加工過(guò)程中（粉碎、混合、發(fā)酵等）其含量隨之變化，并不是一直處于下降趨勢(shì)[7-8]。

近年來(lái)，隨著DON研究的深入，隱蔽型DON（即DON的衍生物）逐步成為關(guān)注的焦點(diǎn)。其中，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-葡萄糖苷（deoxynivalenol-3-glucoside，D3G）是目前研究較多的隱蔽型DON，也是隱蔽型DON的主要種類之一。D3G廣泛存在于谷物中，李鳳琴等[9]對(duì)中國(guó)7 個(gè)省2007ü2008年DON在谷物中污染狀況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明小麥和玉米樣品均有D3G存在，小麥的中位數(shù)為21.4 μg/kg，玉米的中位數(shù)為34.6 μg/kg。更重要的是，谷物在深加工過(guò)程中，所含有的D3G可轉(zhuǎn)移到其加工制品中，如啤酒、面包。隱蔽型D3G在動(dòng)物和人腸道中經(jīng)消化酶的作用，可能釋放出DON單體而同樣產(chǎn)生毒性[10]。目前，國(guó)內(nèi)外多對(duì)谷物中的DON規(guī)定了限量。GB 2761ü2017《食品中真菌毒素限量》[11]中谷物及其制品，具體涉及到玉米、玉米面（渣、片）、小麥、大麥、麥片及小麥粉，其DON限量值為1 000 μg/kg。但若谷物制品的生產(chǎn)工藝不同，那么相同的食品原料生產(chǎn)不同產(chǎn)品時(shí)，DON最大殘留量則不確定。國(guó)外對(duì)DON最大殘留限量值有不同的規(guī)定，如歐盟[12]分別規(guī)定了谷物、面粉和面包中DON的限量，分別不能超過(guò)1 250、750 μg/kg和500 μg/kg；美國(guó)食品及藥品管理局規(guī)定[13]，用于食用的小麥制品如面粉等，其DON允許最大殘留量為1 000 μg/kg；而用于磨粉的小麥DON不得超過(guò)2 000 μg/kg；飼料的限量稍高一些，用于飼料的小麥制品DON的限量為4 000 μg/kg。加拿大衛(wèi)生部規(guī)定[14]嬰兒食品中DON不得超過(guò)1 000 μg/kg。

國(guó)內(nèi)外檢測(cè)糧食中痕量DON及其衍生物的方法主要有薄層色譜法[15]、試紙條法[16-17]、氣相色譜法[18]、HPLC法[19-21]和HPLC-MS法[22-24]。其中薄層色譜法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，對(duì)設(shè)備和操作人員要求不高，但可重復(fù)性和再現(xiàn)性差；氣相色譜需要進(jìn)行衍生化處理，實(shí)驗(yàn)繁瑣復(fù)雜，技術(shù)上存在的問(wèn)題也在一定程度上限制了其的推廣應(yīng)用；HPLC假陽(yáng)性干擾大；HPLC-MS/MS法具有前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中多組分真菌毒素的定性和準(zhǔn)確定量。本實(shí)驗(yàn)采用HLB固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，建立小麥粉、掛面、大米、玉米糝等谷物及其制品中DON及其3 種衍生物同時(shí)測(cè)定的HPLC-MS/MS法，用于谷物中DON及其3 種衍生物的確證分析，方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，可為衛(wèi)生監(jiān)督部門提供相對(duì)有效的監(jiān)督手段，完善我國(guó)谷物及其制品的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)方法，并對(duì)不同谷物及其制品的毒素分布規(guī)律進(jìn)行探討，旨在為系統(tǒng)評(píng)估隱蔽型毒素對(duì)人和動(dòng)物的潛在危害做數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

96 份樣品來(lái)源于湖北省武漢市、黃石市、宜昌市、十堰市市區(qū)超市。

DON標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL） 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-acetyldeoxynivalenol，3ADON）標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）、D3G（50 μg/mL）美國(guó)Sigma公司；15-乙?；撗跹└牭毒┐迹?5-acetyldeoxynivalenol，15ADON）（100 μg/mL）新加坡Pribolab公司；乙腈、甲醇、乙酸銨、正己烷為色譜純，水為Millipore凈化的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Qtrap 6500 HPLC-MS/MS儀 美國(guó)AB SCIEX公司；SB25-12DTS雙頻超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；ME204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；MS3 digital渦旋儀 德國(guó)IKA公司；Centrifuge 5810離心機(jī) 艾本德中國(guó)有限公司；0.22 μm水相濾膜 天津津騰公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器 美國(guó)Millipore公司；Oasis HLB柱（6 mL，500 mg） 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：A c q u i t y U P L C H S S T 3色譜柱（100 mmh2.1 mm，1.8 μm）；進(jìn)樣量5 μL；柱溫35 ℃；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為2 mmol/L乙酸銨溶液，流速0.3 mL/min；梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；掃描方式：正負(fù)離子模式同時(shí)掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電噴霧電壓5 500 V（ESI+），-4 500V（ESI-）；離子源溫度600 ℃；氣簾氣（氮?dú)猓毫?5 psi；碰撞氣（氮?dú)猓毫χ械?；霧化氣（氮?dú)猓毫?5 psi；輔助氣（氮?dú)猓毫?0 psi；入口電壓10.0 V；碰撞室出口電壓10.0 V；掃描時(shí)間3.5～8.5 min。各真菌毒素的質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

表2 4 種化合物的定性離子、定量離子、去簇電壓和碰撞能量Table 2 Qualitative ions, quantitative ions, cone voltage and collision energy for four mycotoxins

1.3.3 樣品處理

稱取2.00 g（準(zhǔn)確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加20.0 mL乙腈-水溶液（84∶16，V/V），超聲20 min，5 000 r/min離心10 min，收集上清液。

取5.0 mL上清液置于50 mL離心管中，加入10.0 mL乙腈飽和正己烷溶液，渦旋混合2 min，5 000 r/min離心5 min，棄去正己烷層后，于40～50 ℃氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL水充分溶解殘?jiān)齼艋?/p>

將HLB固相萃取柱連接到固相萃取裝置，先后用3.0 mL甲醇和3.0 mL水活化平衡。將5.0 mL上述水復(fù)溶液上柱，控制流速1～2 滴/s。用3.0 mL水、1.0 mL 5%甲醇-水溶液依次淋洗柱子后徹底抽干。用5.0 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液后在40～50 ℃氮?dú)獯蹈?。加?.0 mL初始流動(dòng)相溶解殘留物，渦旋混勻10 s，過(guò)0.22 μm，待進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件與色譜條件的優(yōu)化

研究不同電離模式下4 種真菌毒素的響應(yīng)情況。3ADON和15ADON是同分異構(gòu)體，在[M+H]+及[MH]-模式均有較高的響應(yīng)，但在[M+H]+模式下離子對(duì)相互干擾較大，故使用[M-H]-模式；D3G在[M+H]+和[M-H]-下的響應(yīng)值均低，在[M+NH4]+下響應(yīng)較好，故采用[M+NH4]+；DON采用[M-H]-，此模式下有較少基線干擾，相對(duì)響應(yīng)較高。4 種化合物中，3ADON與15ADON是同分異構(gòu)體，D3G脫去葡萄糖苷基團(tuán)后成為DON，為得到最佳的分離度，對(duì)色譜柱的選擇及洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明使用Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mmh2.1 mm，1.8 μm）進(jìn)行表1所示的梯度洗脫時(shí)，4 種化合物均得到有效分離，圖1為真菌毒素的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子色譜圖。

圖1 D3G、DON、3ADON和15ADON的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of four mycotoxins

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

表3 不同前處理方式回收率的對(duì)比Table 3 Comparison of recoveries of four mycotoxins with different pretreatment methods

分別考察不同的前處理方式：1）稱取樣品2.5 g，加10.0 mL水，超聲提取20 min，5 000 r/min離心10 min，過(guò)0.22 μm膜待測(cè)；2）稱取樣品2.0 g，加20.0 mL乙腈-水溶液（84:16，V/V），超聲提取20 min，5 000 r/min離心10 min，取5.0 mL上清液過(guò)HLB柱，取過(guò)柱液5.0 mL氮吹干，定容至1.0 mL，過(guò)膜后待測(cè)；3）如1.3.3節(jié)進(jìn)行前處理。如表3所示，前處理方式3）樣品上機(jī)液干凈且4 種真菌毒素的回收率均比較穩(wěn)定，重復(fù)性好。因此，本方法采用3）樣品前處理方式。

2.3 4 種毒素的線性關(guān)系與回收率

配制一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)的儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，得出4 種毒素在5.0～250 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，檢出限均為10 μg/kg，定量限（limit of quantification，LOQ）為20 μg/kg。

在大米、掛面、小麥粉和玉米糝樣品中分別添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理。在1.3.1和1.3.2節(jié)條件下進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6 份，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見(jiàn)表4。方法的平均回收率為88.5%～117.0%，RSD為1.5%～8.6%。

表4 D3G、DON、3ADON和15ADON的回收率（n=6）Table 4 Recoveries of four mycotoxins in spiked samples (n= 6)

2.4 樣品污染規(guī)律分析

表5 谷物及制品中DON及D3G的含量Table 5 Detection rates of DON and D3G in cereals and their products

對(duì)96 份樣品進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示，15ADON均無(wú)檢出，只有一個(gè)小麥粉樣品檢出3ADON，DON和D3G均有不同程度的檢出，DON檢出率大于D3G，其中在掛面中的含量最高，結(jié)果見(jiàn)表5。此外，不同食品種類毒素檢出率有所不同，其中掛面＞小麥粉＞其他＞大米。

2.4.1 同一類谷物中不同毒素的污染分布

從表5可以看出，大米樣品中只有1 份檢出DON，含量為120.3 μg/kg，其他3 種衍生物均未檢出。其他谷物樣品結(jié)果與大米類似，只有1 份檢出DON，含量為99.0 μg/kg，其他3 種衍生物均未檢出。小麥粉中DON和D3G檢出率分別為69.2%和30.8%，DON含量基本小于500 μg/kg，有1 份樣品則達(dá)到2 133.2 μg/kg（國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)為≤1 000 μg/kg）；D3G含量不超過(guò)300 μg/kg。掛面中DON和D3G檢出率分別為83.3%和50.0%，DON含量基本小于400 μg/kg，而有6 份樣品大于1 000 μg/kg，最高的則達(dá)到了2 156.4 μg/kg；D3G含量小于DON，最高含量為552.8 μg/kg。從小麥粉和掛面中DON和D3G的檢出可以看出，當(dāng)DON達(dá)到最高時(shí)，D3G也是最高。

對(duì)96 份樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，有DON檢出的樣品不一定會(huì)有其他3 種衍生物檢出，有其他3 種衍生物檢出則一定會(huì)有DON的檢出，因此在本研究中，DON的檢出率可以代表整個(gè)樣品的檢出率。DON等4 種毒素在不同谷物樣品中的含量不同，且同類谷物中DON和D3G的中位數(shù)一般不等于算數(shù)平均數(shù)，這有可能是因?yàn)镈ON等4 種毒素在谷物中含量的分布可能不服從正態(tài)分布。

2.4.2 不同谷物中毒素含量的區(qū)別

對(duì)96 份樣品進(jìn)行檢測(cè)，僅有1 份小麥粉樣品檢出3ADON，含量為78.5 μg/kg，大米、小麥粉、掛面和其他谷物均未檢出3ADON和15ADON。DON和D3G均有不同程度的檢出，所有樣品中DON等毒素檢出率的高低順序依次為DON（41.7%）＞D3G（20.8%）＞3ADON（1.0%）＞15ADON（0.0%）。4 類谷物中，毒素檢出率最高的是掛面，達(dá)到了83.3%，其次是小麥粉，因此可以看出，掛面的污染最為嚴(yán)重。

圖2 D3G與DON的線性擬合圖Fig. 2 Linear curve fi tting of D3G versus DON content

DON和D3G有一定的正相關(guān)關(guān)系，具體擬合直線見(jiàn)圖2。其方程為Y=3.89X，相關(guān)系數(shù)為0.925。這在一定程度上說(shuō)明，高含量DON存在時(shí)，D3G也會(huì)有高含量存在，反過(guò)來(lái)亦是如此。由于DON主要是禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生，而D3G是DON的隱蔽型，所以二者同時(shí)出現(xiàn)的概率很大，本研究所得到二者的結(jié)果有一定的相關(guān)性是合理的。D3G往往與其DON原型及乙酰衍同時(shí)廣泛存在于小麥、大麥、燕麥、啤酒等糧食及制品中，Malachova等[25]檢測(cè)捷克的谷物和面粉樣品（共116 份），數(shù)據(jù)表明，DON在樣品中的污染率為75%，含量在13～594 μg/kg范圍內(nèi)；而D3G的污染率甚至達(dá)到80%，但含量卻低于DON，為5～72 μg/kg。Simsek等[26]對(duì)美國(guó)不同地區(qū)的春麥進(jìn)行考察，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，影響DON和D3G含量的最大因素是地域，且隱蔽型D3G含量與原型DON含量呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系。本研究在一定程度上契合了前者的報(bào)道。

在已有研究中[27]，雖然暫時(shí)沒(méi)有直接證據(jù)證明隱蔽型真菌毒素是強(qiáng)于其原型的真菌毒性，但有研究數(shù)據(jù)表明[28-31]，一些隱蔽型真菌毒素在代謝過(guò)程中可能會(huì)水解，并釋放出毒素原型，因此，隱蔽型真菌毒素是危害人類健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)之一。美國(guó)已將隱蔽型毒素D3G與其原DON（D3G/DON）作為小麥抗赤霉病毒素的重要評(píng)估指標(biāo)，歐洲將隱蔽型DON列入例行DON毒素監(jiān)測(cè)對(duì)象，并提出其日允許攝入量值與原型等同，聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織下的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)在2010年4月第72次會(huì)議上決定，將原來(lái)針對(duì)DON的每日最大允許攝入量改為針對(duì)DON及其乙?；苌铮?-A-DON及15-A-DON）化合物組的每日最大允許攝入量（1 μg/kg）[32]。本研究的數(shù)據(jù)進(jìn)一步印證了這種風(fēng)險(xiǎn)的存在，DON與其隱蔽型D3G含量之和大于DON含量，隱蔽型毒素在谷物中的污染不容忽視。

3 結(jié) 論

本研究建立HPLC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)小麥粉、掛面、玉米糝、大米等谷物及其制品中DON、D3G、3ADON和15ADON含量的方法，方法經(jīng)過(guò)優(yōu)化和驗(yàn)證，滿足谷物及其制品的檢測(cè)要求。

分析96 份谷物及其制品中4 種真菌毒素的分布規(guī)律，結(jié)果表明，15ADON無(wú)檢出，只有1 個(gè)樣品檢出3ADON，DON和D3G均有不同程度的檢出，DON檢出率大于D3G。不同食品種類主要污染的毒素種類均以DON為主，其中掛面的污染最為嚴(yán)重。此外，統(tǒng)計(jì)分析顯示D3G與DON含量相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.925，而這兩種毒素的協(xié)同作用造成的危害目前仍然比較空白?？傮w而言，D3G/DON在30%左右，在谷物及其制品中污染比較普遍。而谷物及其制品是我國(guó)人民的主要糧食，因此，探尋谷物中DON及其衍生物4 種真菌毒素污染的控制措施，保證谷物安全具有重要意義。