產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)時(shí)熒光PCR和實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)方法的建立和比較

劉立兵，李睿文，陳志敏，王金鳳，孫曉霞，袁萬(wàn)哲,*，王建昌,*

（1.石家莊海關(guān)，河北 石家莊 050051；2.河北省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，河北 石家莊 050051；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens），又稱為魏氏梭菌（Clostridiumwelchii），是一種革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌，也是一種人獸共患病病原體[1]。根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的α、β、ε、ι四種主要毒素，可以將之分為A、B、C、D和E型[2-3]。不同型的產(chǎn)氣莢膜梭菌可以導(dǎo)致不同的疾病，均具有發(fā)病急、死亡率高等特點(diǎn)[4]。產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛分布在土壤、污水等自然環(huán)境中，引起的食物中毒事件在我國(guó)非常嚴(yán)重，攝入被產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的食物后，能夠引起惡心、腹瀉等臨床癥狀，從而引發(fā)肌壞死性疾病[5]；羔羊、仔豬、牛犢、雛雞等動(dòng)物感染產(chǎn)氣莢膜梭菌，會(huì)導(dǎo)致壞死性腸炎、腸毒血癥等疾病[6]。產(chǎn)氣莢膜梭菌污染給人類健康和畜牧業(yè)健康發(fā)展造成了巨大的危害，因此對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速檢測(cè)對(duì)于疫病防控和食品安全保障具有重要意義。

目前，針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)、細(xì)胞素方法、卵磷脂水解實(shí)驗(yàn)和反向間接乳凝膠結(jié)實(shí)驗(yàn)等[7-9]，存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、技術(shù)要求高、過(guò)程繁瑣等不足。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一系列針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的新方法被建立并得到了廣泛應(yīng)用。孫佳芝等[10]建立了靈敏度為4.57 μg/L的雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)方法；鮑長(zhǎng)磊[11]建立了產(chǎn)氣莢膜梭菌不同毒素型多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和α毒素抗體ELISA檢測(cè)方法；石玉玲等[12]根據(jù)16S rRNA基因建立了實(shí)時(shí)熒光PCR方法，靈敏度則為9h102CFU/mL；劉哲等[13]建立了特異性檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法，靈敏度為2.92h102CFU/mL。ELISA方法檢測(cè)靈敏度不高，試劑盒價(jià)格昂貴，且需要特異性設(shè)備；LAMP方法需要4～6 條引物，設(shè)計(jì)復(fù)雜，且極易造成假陽(yáng)性結(jié)果[14]。因此，建立一種反應(yīng)快速、操作簡(jiǎn)便、靈敏性高的檢測(cè)方法對(duì)于產(chǎn)氣莢膜梭菌的有效控制依然具有重要意義。

聚合酶重組酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，主要依賴于重組酶、具有聚合鏈置換功能的DNA聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白3 種核心蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的等溫?cái)U(kuò)增[15]。在反應(yīng)過(guò)程中，重組酶結(jié)合引物形成蛋白-DNA混合物并啟動(dòng)尋找模板DNA上的同源序列。同源序列定位后，則會(huì)引發(fā)鏈置換反應(yīng)，引物結(jié)合到對(duì)應(yīng)模板上，具有鏈置換功能的DNA聚合酶進(jìn)而從引物3’末端開始啟動(dòng)DNA合成，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增[9]。RPA能夠在37～42 ℃恒溫條件下20 min內(nèi)完成對(duì)靶基因的有效擴(kuò)增，特別適用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種食源性致病菌的快速檢測(cè)[16-18]。

本研究根據(jù)編碼A～E型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的plc基因的高度保守區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立實(shí)時(shí)熒光PCR和實(shí)時(shí)熒光RPA方法，并使用人工污染樣品對(duì)兩種方法進(jìn)行驗(yàn)證和比較，以期為食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速檢測(cè)提供有效技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用菌種見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株Table 1 Bacterial strains used in this study

胰胨亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、0.1%蛋白胨水 北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；Premix ExTaq寶生物工程（大連）有限公司；TwistAmpTMexokit 英國(guó)TwistDx公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7 5 0 0實(shí)時(shí)熒光P C R儀 美國(guó)A B I公司；Genie III等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng) 英國(guó)OptiGene公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

參考GenBank中登錄的產(chǎn)氣莢膜梭菌plc基因（登錄號(hào)：NC_008261.1），比對(duì)確定特異性保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物和探針。所有引物探針均由生工生物工程（上海）有限公司合成，序列信息見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物及探針Table 2 Primers and probes used in real-time RPA and real-time PCR

1.3.2 基因組DNA的提取

將產(chǎn)氣莢膜梭菌（ATCC 13124）接種到液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)20 h。取純培養(yǎng)菌液1 mL，加入到1.5 mL離心管中，11 500 r/min離心1 min，收集沉淀。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取，使用NanoDrop 2000 C超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光RPA方法的建立

以1.3.2節(jié)制備的產(chǎn)氣莢膜梭菌DNA為模板，采用引物RPA-F/R和exo探針，使用TwistAmpTMexokit配制實(shí)時(shí)RPA反應(yīng)體系（50 μL）：RPA-F/R（10 μmol/L）各2.1 μL，exo探針（10 μmol/L）0.6 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 12.2 μL，將其混勻，加入到裝有凍干酶制劑的反應(yīng)管中，吹吸至完全溶解，再加入2.5 μL 280 mmol/L MgAc，蓋緊管蓋，瞬時(shí)離心并渦旋后，放入Genie III中，39 ℃反應(yīng)20 min。在擴(kuò)增過(guò)程實(shí)時(shí)收集檢測(cè)熒光信號(hào)，目的基因擴(kuò)增后熒光信號(hào)會(huì)明顯增加。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光 PCR方法的建立

以1.3.2節(jié)制備的產(chǎn)氣莢膜梭菌DNA為模板，采用引物PCR-F/R和探針TaqMan Probe建立實(shí)時(shí)熒光PCR體系為（25 μL）：Premix ExTaq12.5 μL，PCR-F/R（10 μmol/L）各1.0 μL，PCR-Probe（10 μmol/L）1 μL，DNA模板1 μL，補(bǔ)水至25 μL。將上述體系充分振蕩混勻后，瞬時(shí)離心，放入7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀中，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸35 s，40 個(gè)循環(huán)，60 ℃收集熒光信號(hào)。

1.3.5 特異性和靈敏度實(shí)驗(yàn)

以表1所示菌株DNA為模板，根據(jù)1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，分析實(shí)時(shí)熒光RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR方法的特異性。

提取1 mL純培養(yǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌的基因組DNA，并測(cè)定其濃度，進(jìn)行10 倍倍比稀釋，以不同稀釋度的基因組DNA作為模板，根據(jù)1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，分析比較實(shí)時(shí)熒光RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR方法的靈敏度。

1.3.6 對(duì)人工污染樣品的檢測(cè)比較

使用經(jīng)GB 4789.13ü2012《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)》檢測(cè)確定不含產(chǎn)氣莢膜梭菌的奶粉、雞肉、牛肉和羊肉樣品，分別取25 g加入到225 mL滅菌的0.1%蛋白胨水中，拍打均勻。取出9 mL樣品均液，加入一定濃度的產(chǎn)氣莢膜梭菌純培養(yǎng)液，使之濃度為1.0h106CFU/mL。拍打混勻，取1 mL人工污染產(chǎn)氣莢膜梭菌的樣品均液，用未污染產(chǎn)氣莢膜梭菌的樣品均液進(jìn)行10 倍倍比稀釋，每個(gè)稀釋度分別取1 mL進(jìn)行核酸提取，并以之作為模板分別通過(guò)實(shí)時(shí)熒光RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)取各個(gè)稀釋的樣品菌液按照GB 4789.13ü2012方法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，將3 種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR方法的特異性

通過(guò)建立的實(shí)時(shí)熒光RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR方法，分別以產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA和表1中的其他細(xì)菌基因組DNA為模板，進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)分析。表3表明，兩種方法僅產(chǎn)氣莢膜梭菌有特異性擴(kuò)增曲線，而其他菌株均無(wú)擴(kuò)增曲線。上述結(jié)果表明建立的實(shí)時(shí)熒光RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR方法均具有良好的特異性。

表3 實(shí)時(shí)熒光RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性分析Table 3 Speci fi cities of real-time RPA and real-time PCR assays

2.2 實(shí)時(shí)熒光RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度

圖1 產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)時(shí)熒光RPA（A）和實(shí)時(shí)熒光PCR（B）方法的敏感性Fig. 1 Sensitivities of real-time RPA (A) and real-time PCR (B) for C. perfringens detection

測(cè)定所提取的產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組D N A為1.3h105pg/μL，將其10 倍倍比稀釋至1.3h10-1pg/μL，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢出限一致，均為1.3 pg/μL（圖1）。

2.3 人工污染樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)于人工污染產(chǎn)氣莢膜梭菌的奶粉、雞肉、牛肉和羊肉樣品，每個(gè)稀釋度取1 mL模擬污染液，提取核酸，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)，與按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 4789.13ü2012）的檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR方法的最低檢出限均為1.0h102CFU/mL，與標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.13ü2012檢測(cè)方法的靈敏度一致（表4）。實(shí)時(shí)熒光RPA能夠在20 min內(nèi)完成檢測(cè)，僅需要3～13 min即可實(shí)現(xiàn)對(duì)所有陽(yáng)性樣品的檢測(cè)，而實(shí)時(shí)熒光PCR完成整個(gè)反應(yīng)則需要55 min左右，需要24～46 min（Ct值為17.45～33.65）實(shí)現(xiàn)對(duì)陽(yáng)性樣品的檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光RPA方法在陽(yáng)性樣品的確認(rèn)時(shí)間上明顯優(yōu)于實(shí)時(shí)熒光PCR方法，而在標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)中，需要在36 ℃進(jìn)行20～24 h的增菌，在檢測(cè)時(shí)間方面較前兩種方法更長(zhǎng)。

表4 人工污染樣品檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of detection of artificially contaminated samples

3 討 論

食源性致病菌是影響食品安全的重要因素之一。由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒報(bào)道事件逐年上升，對(duì)人類的健康造成了嚴(yán)重影響。建立一種快速、特異、精準(zhǔn)的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)方法，對(duì)人類的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展有重要意義。本研究采用實(shí)時(shí)熒光RPA技術(shù)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌。實(shí)時(shí)熒光RPA反應(yīng)是基于RPA反應(yīng)體系中加入exo探針，擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的熒光信號(hào)通過(guò)熒光檢測(cè)儀實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)，作為一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，它具有特異性強(qiáng)、靈敏性高、反應(yīng)快速等優(yōu)點(diǎn)，在細(xì)菌檢測(cè)方面、病毒檢測(cè)等方面應(yīng)用廣泛[19-23]。實(shí)時(shí)熒光PCR是PCR體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行分析的技術(shù)，該技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在食源性致病菌檢測(cè)[12,24-25]、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)[26]，以及致病性鉤端螺旋體[27]和兔熱病桿菌檢測(cè)[28]中都得到廣泛的應(yīng)用。

plc基因編碼的α毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要外毒素，存在于A～E型產(chǎn)氣莢膜梭菌中，是導(dǎo)致畜禽壞死性腸炎、腸毒血癥、氣性壞疽等疾病的主要致死因素，其毒性最強(qiáng)，是國(guó)內(nèi)外研究產(chǎn)氣莢膜梭菌最多的毒素[29-30]。本研究根據(jù)plc基因設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，建立的實(shí)時(shí)熒光RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌具有很好的特異性，不同類型的標(biāo)準(zhǔn)株和分離株均得到了特異性擴(kuò)增。對(duì)于人工污染樣品，兩種方法的最低檢出限均為1.0h102CFU/g，但實(shí)時(shí)熒光RPA方法的檢測(cè)時(shí)間（20 min）明顯少于實(shí)時(shí)熒光PCR方法（55 min），極大地縮短了實(shí)際樣品的檢測(cè)周期，更適合于實(shí)際樣品的快速檢測(cè)。

本研究使用Genie III實(shí)時(shí)熒光RPA運(yùn)行設(shè)備，大小為25 cmh16.5 cmh8.5 cm，質(zhì)量?jī)H為1.75 kg左右，具有體積小、便攜式的特點(diǎn)，而且適用鋰電池充電工作，可以維持設(shè)備24 h的運(yùn)行，非常適合實(shí)驗(yàn)設(shè)備相對(duì)落后的基層檢測(cè)部門，以及食源性疫情的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，為產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速現(xiàn)場(chǎng)診斷提供了有效的技術(shù)手段。