Q-Orbitrap高分辨質譜法測定牛奶中賴丙氨酸及其含量隨溫度變化的規(guī)律

聶雪梅，王 菡，許秀麗，張 峰,*，陳 達

（1.天津大學精密儀器與光電子工程學院，天津 300072；2.中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所，北京 100176；3.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西 西安 710021）

牛奶富含蛋白質，在高溫加熱時發(fā)生美拉德反應易產生一種副產物氨基酸——賴丙氨酸[1]。賴丙氨酸的產生不僅使牛奶的營養(yǎng)價值降低[2]，在毒理實驗中還發(fā)現其能螯合金屬酶，特異地引發(fā)小鼠腎鈣質沉著、腎細胞巨大及腎小管細胞壞死[3]，尤其對常飲用牛奶的嬰幼兒的健康有重要影響[4-5]。隨著研究深入，發(fā)現賴丙氨酸的形成有很多因素，包括食品組分、食品加工方式、食品儲存條件[6-8]等，而其中熱加工方式是對賴丙氨酸含量影響最大的因素[9]，賴丙氨酸也在很多熱加工食品中被測出[10-12]，尤其在很多嬰兒配方食品中，賴丙氨酸已經開始作為一個質量指標，用以衡量其對嬰兒是否造成傷害[13]。Faist等[14]研究顯示賴丙氨酸能夠評估奶制品熱處理程度的靈敏的指示劑。Calabrese等[15]在酪蛋白鈣和奶粉中檢測到高含量的賴丙氨酸，也證明賴丙氨酸可作為牛奶加工工藝評定的重要指示物之一[16]。因此開展牛奶中賴丙氨酸分析方法研究，并研究其在熱加工溫度下的含量變化規(guī)律，對于準確了解市場上牛奶中賴丙氨酸的含量水平，科學制定牛奶中賴丙氨酸的限量水平，都具有重要意義。

對于賴丙氨酸的檢測方法主要包括氨基酸分析儀法[17]、氣相色譜（gas chromatography，GC）法[18]、液相色譜（liquid chromatography，LC）法[19]以及液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯用法[20]、脈沖-傅里葉變換核磁共振譜儀法[21]等。目前并未檢索到高分辨質譜檢測方法，其中脈沖-傅里葉變換核磁共振譜儀分析過程不需要衍生，處理簡單，但其只適于合成的賴丙氨酸及其標準品的檢測，并不適合成分復雜的食品中賴丙氨酸的分析。而GC、LC和LC-MS均需要衍生，其中GC衍生理由為賴丙氨酸作為一種交聯氨基酸[21]，不能直接用GC進行檢測，必須經過衍生得到弱極性、低揮發(fā)性和良好熱穩(wěn)定性的衍生物才能進行GC分離測定。LC衍生理由為由于賴丙氨酸在紫外-熒光檢測器響應值較低，因此需引入衍生試劑提高其響應值。LC-MS衍生理由為由于引入衍生試劑后更易離子化，可提高質譜響應。且目前測定乳制品中賴丙氨酸的方法大多需要衍生，樣品基質復雜且干擾物質多[22-24]，定性準確度差[25-27]。例如Lourdes等[28]用6 mol/L鹽酸溶液110 ℃水解24 h，用硅烷化試劑N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺與賴丙氨酸進行衍生，形成N-tert-butyldimethylsilyl衍生化合物，之后采用GC-氫火焰離子檢測器進行定量，定性又需氣相色譜-質譜儀器，前處理復雜。

本研究經過鹽酸水解后直接定量，同時采用的高分辨質譜具有高分辨能力和高靈敏度，能夠準確定性定量等優(yōu)勢，無需衍生也能準確測定賴丙氨酸，且測定時間短，對于提高行業(yè)檢測水平和科學制定牛奶中賴丙氨酸的限量有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牧場牛奶來自牧場當天牛奶采集樣本，其他牛奶樣品均為市購。牛奶中主要營養(yǎng)成分分別為脂肪3.5%、蛋白質3.3%、碳水化合物4.8%、鈉50 mg/100 g。

賴丙氨酸標準品（純度＞95%） 加拿大多倫多研究化學品公司；甲酸（質譜級） J&K科學有限公司；鹽酸（分析純） 安徽八一化工股份有限公司；硼酸（分析純） 富凱化工責任有限公司；硼氫化鈉（HPLC級） 百靈威科技有限公司；氫氧化鈉（分析純） 天津科密歐化學試劑有限公司；乙腈、甲醇（色譜純） 美國Thermo Fisher Scientific公司；實驗室超純水由Millipore 純水儀制備。

1.2 儀器與設備

Q-Exactive超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；Milli-R04純水儀 德國Millipore公司；XP105DR分析天平 梅特勒-托利多上海有限公司；HSC-12B針式氮吹儀天津恒奧科技有限公司；VM-6渦旋振蕩器 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；一次性注射器（2 mL）及濾膜美國Welch公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取賴丙氨酸標準品10 mg（精確至0.1 mg），用水定容至10 mL，配制成1 mg/mL的標準儲備液，置于-20 ℃貯存，再用水稀釋成質量濃度為1.00 μg/mL標準溶液。測定前用水稀釋成1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00 ng/mL和200.00 ng/mL系列標準溶液。

1.3.2 超高效液相色譜條件

色譜柱為Ascentis-C8（100 mmh4.6 mm，3 μm）；流動相A為水相，含0.1%（V/V）甲酸，流動相B為乙腈；流速0.4 mL/min；進樣體積5 μL，柱溫40 ℃；梯度洗脫程序：0 min，95% A；8 min，60% A；10～13 min，0% A；13.1～15 min，95% A。

1.3.3 質譜條件

離子源：加熱電噴霧離子源；離子源參數：離子傳輸管溫度350 ℃；鞘氣壓力206.85 kPa；輔助氣壓力1 000 kPa；噴霧電壓3.5 kV；監(jiān)測模式：正離子監(jiān)測模式；全掃描-數據依賴二級掃描模式；實驗中所用的氣體均為高純氮氣，質量掃描范圍m/z100～500，待測化合物信息如表1所示。

表1 監(jiān)測化合物質譜信息Table 1 Mass spectrometric parameters of lysinoalanine

1.3.4 樣品前處理

首先準確稱取空白鮮奶樣品1 g（精確至0.001 g）于酸解管中，加入1.33 mL硼酸緩沖液（0.5 mol/L，pH 9.5）和173 μL硼氫化鈉（NaBH4，1 mol/L在0.2 mol/L NaOH中）混合。在室溫下孵育6 h后，加入4 mL鹽酸（6 mol/L），在110 ℃氮氣中水解24 h，加水至10 mL，用0.45 μm濾膜過濾，取200 μL濾液至氮吹管中，吹干后用500 μL純水復溶，過0.22 μm濾膜，上機待測。

1.4 數據處理

超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜原始數據利用Thermo Scientific Xcaliber軟件采集及定性定量處理。表格制作利用Microsoft Office 2007軟件，繪制圖形利用Origin Pro軟件。

2 結果與分析

2.1 測定條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的優(yōu)化

如圖1所示，采用C18柱有拖尾現象且無保留，這可能是由于柱長較短，未洗脫干凈；使用HILIC及aQ色譜柱分離目標物時，色譜峰響應比Ascentis-C8柱低，影響定量的準確性。Ascentis-C8為中等極性分析柱，Ascentis-C8分析柱可以對較弱極性化合物有較好的保留。根據色譜峰響應、峰性和保留時間，本方法采用Ascentis-C8色譜柱對目標物進行分離。

圖1 4 種色譜柱效果對比圖Fig. 1 Comparison of separation efficiencies with four columns

2.1.2 流動相的優(yōu)化

考察甲醇和乙腈2 種有機相對色譜峰形的影響，如圖2所示。乙腈作為流動相時目標化合物響應更高。乙腈作為有機相對分析物產生更高的響應，這可能是由于乙腈表面張力小，可以更好地溶液去溶劑化，離子化效率更高。選擇水相時對比加不同體積分數的甲酸（0%、0.05%、0.1%、0.2%）對色譜峰形的影響。如圖3所示，在使用0.1%甲酸溶液作為流動相時對賴丙氨酸有良好的色譜分離效果，可兼顧質譜響應，色譜峰峰形較優(yōu)，流動相中甲酸含量會影響賴丙氨酸的離子化效果，甲酸含量過高會引起競爭性的電離抑制，使得賴丙氨酸在質譜中的響應降低，含量過低會導致離子化效果較差，因此選擇0.1%甲酸溶液作為流動相。

圖2 2 種有機相效果對比圖Fig. 2 Comparison of separation efficiencies with two organic phases

圖3 4 種不同比例甲酸效果對比圖Fig. 3 Comparison of separation efficiencies with different concentrations of formic acid

2.1.3 質譜參數的優(yōu)化

對比全掃描、全掃描-數據依賴二級掃描2 種掃描模式。全掃描模式下雖然可以達到對目標物的定量檢測，但其僅以母離子精確質量數和保留時間對目標物進行定性，易造成假陽性檢測結果。因此選擇全掃描-數據依賴二級掃描模式進行目標物的篩查監(jiān)測，以母離子和碎片離子精確質量數定性，精確母離子定量，可達到對目標物的篩查及定量目的。在全掃描-數據依賴二級掃描模式下，質譜方法設置一級分辨率70 000，二級分辨率35 000，歸一化碰撞能量在25%可得到最佳監(jiān)測結果，質荷比偏差均小于1.0h10-6。

2.1.4 優(yōu)化后的賴丙氨酸色譜峰

圖4 賴丙氨酸標準色譜圖Fig. 4 Chromatogram of lysinoalanine standard

如圖4所示，經過色譜和質譜條件的優(yōu)化，選用Ascentis-C8色譜柱（100 mmh4.6 mm，3 μm）對待測物進行分離，以0.1%甲酸溶液和乙腈作為流動相進行梯度洗脫，在全掃描-數據依賴二級掃描模式下進行檢測，色譜峰峰形較好。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

由于牛奶中的賴丙氨酸多與蛋白質結合，所以分析牛奶中的賴丙氨酸時都要先經過水解，使賴丙氨酸得到釋放[29-30]。本實驗測定2 種QuECHERS方法乙酸鋅凈化除脂、乙酸鋅+亞鐵氰化鉀凈化除脂和鹽酸水解3 種提取方式下賴丙氨酸的含量，發(fā)現未經鹽酸水解的2 種方法均未檢出賴丙氨酸，所以本實驗采用鹽酸水解的方法。鹽酸水解后，凈化方式對比了PSA和C18單獨凈化、兩者結合凈化以及直接氮吹復溶，發(fā)現響應值并無較大區(qū)別，因此為節(jié)省前處理步驟采用直接氮吹復溶。

2.3 方法驗證

2.3.1 標準曲線、檢出限和定量限結果

配制賴丙氨酸標準溶液（1～200 μg/L），以峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X，μg/L）為橫坐標，繪制標準曲線，在1～200 μg/L質量濃度范圍內賴丙氨酸色譜峰面積與質量濃度呈良好線性相關，回歸方程為y＝111 362x+17 995.4；相關系數R2為0.999 0。同時樣品中賴丙氨酸的檢出限和定量限分別為0.01 mg/kg和0.025 mg/kg，表明該方法具有較好的靈敏度，可以對含量較低的分析物進行定量。

2.3.2 回收率測定結果

選取鮮奶進行回收率實驗，在處理樣品前加入不同含量標準品，按照前處理方法分別進行樣品處理后，在相同條件下進行分析，分2 批次共測定6 次，結果見表2，回收率在78.7%～117.1%范圍內。

表2 回收率實驗結果Table 2 Recoveries of lysinoalanine from spiked samples

2.3.3 精密度測定結果

表3 精密度實驗結果Table 3 Precision of the method

選取某滅菌乳進行重復性實驗，按照前處理方法分別進行前處理后，在相同條件下進行分析，分3 批次共測定6 次，結果見表3。相對標準偏差為3.64%，此方法的精密度良好。

2.4 樣品分析及評價

2.4.1 樣本中賴丙氨酸定性分析

運用全掃描-數據依賴二級掃描模式收集化合物信息，選取2 個響應值高且有特征性的碎裂片段C5H10N+（m/z84.081 5）與C6H12NO2+（m/z130.086 3）以及豐度比進行定性。由圖5可得，二級碎片質荷比、分子離子質荷比、母離子的保留時間基本可對復雜牛奶樣本中的賴丙氨酸準確定性。

圖5 賴丙氨酸標準品和樣品中賴丙氨酸色譜圖和子離子質譜圖Fig. 5 Chromatograms and daughter ion mass spectra of 50 μg/L lysinoalanine standard and sample

2.4.2 溫度樣品含量變化規(guī)律的影響

從牧場采集的新鮮牛奶，在6 h內混勻并置于小型模擬牛奶加工設備上，分別加熱至50～150 ℃（每隔10 ℃測定1 個樣品），加熱時間5～10 s，加熱處理后置于50 mL樣品管中（每個溫度點取2 個樣），按照賴丙氨酸前處理方式鹽酸酸解處理并上機。如圖6所示，當加熱溫度升高時，賴丙氨酸含量會隨著溫度不斷變化，從50～110 ℃賴丙氨酸含量隨著溫度的升高而增加，當加熱到120 ℃時含量下降，從120～140 ℃含量波動較小。

圖6 賴丙氨酸含量隨溫度變化圖Fig. 6 Variation in lysinoalanine content of fresh milk with heating temperature

2.4.3 市場樣品檢測結果

表4 市售乳制品中的賴丙氨酸含量Table 4 Lysinoalanine contents in commercial liquid milk products

對來自市場不同品牌的12 種液態(tài)乳進行測定，根據賴丙氨酸的保留時間及選擇的兩對子離子峰高的比值進行定性分析，結果如表4所示。超高溫瞬時滅菌牛奶的8 個樣品的平均含量為5.554 mg/kg，巴氏殺菌牛奶的4 個樣品的平均含量為3.745 mg/kg，其含量值在上述賴丙氨酸的變化規(guī)律范圍內。目前，對于賴丙氨酸在乳制品中的限量，各國均無限量標準。因此，本方法的建立，對于準確獲取市場上牛奶中賴丙氨酸的含量情況，制定出符合我國國情的限量標準具有重要參考意義。

3 結 論

本研究采用高分辨質譜對液態(tài)奶中賴丙氨酸進行分析，并進行方法學驗證。由于高分辨質譜具有高分辨能力、準確定性、超高靈敏度等優(yōu)勢，又采用了簡化前處理的方法，處理時間短，不需要衍生，相對于其他文獻中賴丙氨酸的測定方法，具有明顯的優(yōu)勢。同時采用小型模擬加工設備對牧場采集的新鮮液態(tài)奶進行不同加工條件的處理，并研究賴丙氨酸含量隨加熱溫度的變化規(guī)律，在50～110 ℃賴丙氨酸含量隨著溫度的升高增加，當加熱到120 ℃時含量下降，從120～140 ℃含量波動不大。其后對來自市場不同品牌的12 種液態(tài)奶進行測定，其含量符合賴丙氨酸的變化規(guī)律范圍。通過采用超高效液相色譜-串聯質譜可對乳品中的賴丙氨酸實現快速、準確、靈敏檢測，對于準確獲取市場上乳制品中賴丙氨酸含量情況，制定出符合我國國情的限量標準具有重要參考意義，本方法將在保障乳制品安全中發(fā)揮積極作用。