高效液相色譜法分離分析藥食同源紅花中羥基紅花黃色素A

艾散江·艾海提，王 瑾，關(guān) 明*（新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊　830054）

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高效液相色譜法分離分析藥食同源紅花中羥基紅花黃色素A

艾散江·艾海提，王 瑾，關(guān) 明*
（新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊830054）

摘 要：目的：建立高效液相色譜法測(cè)定藥食同源紅花中羥基紅花黃色素A含量的方法。方法：采用微波輔助萃取法提取藥食同源紅花中的有效成分，高效液相色譜梯度洗脫法分離分析其中羥基紅花黃色素A；色譜柱為Sino Chrom ODS-BP（4.6 mm×200 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.5%的乙酸溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為403 nm，流速為1.0 mL/min。結(jié)果：羥基紅花黃色素A在5.25～80.32 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（r=0.999 9），加標(biāo)回收率為101.0%～103.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.27%。結(jié)論：建立的方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于食品、保健品及其復(fù)方制劑中羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：紅花；羥基紅花黃色素A；高效液相色譜法；梯度洗脫

引文格式：

艾散江·艾海提, 王瑾, 關(guān)明. 高效液相色譜法分離分析藥食同源紅花中羥基紅花黃色素A[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(12): 152-155. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612027. http://www.spkx.net.cn

AISANJIANG·Aihaiti, WANG Jin, GUAN Ming. Separation and analysis of hydroxysafflor yellow a in edible and medical petals of safflower flowers by high performance liquid chromatography[J]. Food Science, 2016, 37(12): 152-155. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612027. http://www.spkx.net.cn

紅花（Carthamus tinctorius L.）屬菊科植物[1]，是一種藥食同源作物，原產(chǎn)于埃及，文字記載已有4 000多年歷史[2]。我國(guó)始載于《開(kāi)寶本草》[3]，已有2 100多年的栽培、食用及藥用歷史，主產(chǎn)于新疆，并于我國(guó)多地廣泛栽培[4]。紅花所含成分主要為色素、黃酮類、揮發(fā)油、脂肪酸等[5]，被廣泛應(yīng)用于食品、保健品領(lǐng)域[6-7]。紅花黃色素是從紅花的花瓣中提取的天然食用色素，具有良好的保健功能[8]，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[9]。其中，羥基紅花黃色素A是紅花的主要有效成分[10-11]，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗氧化、保護(hù)心肌、降血壓、免疫抑制和腦保護(hù)等功效[12-14]，其含量與抗氧化能力有相關(guān)性，因此被廣泛應(yīng)用于食品與保健品行業(yè)[15]。

1993年，Meselhy等[16]首次分離得到羥基紅花黃色素A，國(guó)內(nèi)外對(duì)其提取、分離及測(cè)定開(kāi)展了廣泛研究。目前，提取紅花中的羥基紅花黃色素A主要采用熱浸法、超聲法、滲濾法、回流提取、微波輔助萃取等方法，其中，微波輔助萃取技術(shù)因具有穿透力強(qiáng)、選擇性高、反應(yīng)速度快、溶劑消耗低、污染小，以及設(shè)備簡(jiǎn)單、提取收率高等多種優(yōu)點(diǎn)[17]，成為樣品前處理技術(shù)的熱點(diǎn)[18]。關(guān)于紅花中羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定，主要采用紫外分光光度法[19]、高效液相色譜法[20-22]等，其中，高效液相色譜法因其分離效率高、選擇性好、分析速度快、靈敏度高等特點(diǎn)，應(yīng)用日益廣泛，但大多涉及食品或保健品中羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定，此外，文獻(xiàn)[22]報(bào)道，采用高效液相色譜法測(cè)定紅花有效成分存在色譜峰拖尾、峰形不對(duì)稱、保留時(shí)間長(zhǎng)、分離度不理想等缺陷。

本研究采用微波輔助萃取法對(duì)藥食同源的紅花植物原料進(jìn)行了有效成分提取，并借鑒相關(guān)報(bào)道[10]，采用梯度洗脫高效液相色譜法對(duì)紅花植物原料中的羥基紅花黃色素A進(jìn)行了有效地分離分析，希望為藥食同源紅花的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

紅花花瓣，采自新疆喀什岳普湖縣。

羥基紅花黃色素A標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）天津馬克生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；高純水；乙酸（分析純）。

1.2儀器與設(shè)備

1200LC高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；E1817525 Sino chrom ODS-BP色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；XH300B型超聲波微波組合合成/萃取儀北京祥鵠科技發(fā)展有限公司。

1.3方法

1.3.1色譜條件

流動(dòng)相：甲醇（A）-0.5%乙酸溶液（B），梯度洗脫（表1），每次運(yùn)行后平衡柱子5 min；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：403 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積20 μL。

表1　梯度洗脫條件Table 1　Gradient elution conditions

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

1.3.2.1儲(chǔ)備液的制備

準(zhǔn)確稱取羥基紅花黃色素A標(biāo)準(zhǔn)品2.6 mg，置于25 mL的容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，配制0.104 mg/mL的儲(chǔ)備液，混勻。

1.3.2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

從0.104 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液中，分別精密吸取0.5、1、2、8 mL到10 mL的容量瓶中，混勻，配制成質(zhì)量濃度分別為0.005 2、0.010 4、0.020 8、0.041 6、0.083 2、0.104 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取1.3.2.2節(jié)系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液各20 μL，進(jìn)樣，按照1.3.1節(jié)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以羥基紅花黃色素A對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，羥基紅花黃色素A峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4供試品溶液的制備

取紅花粉末（過(guò)40目篩）1 g，在功率300 W、溫度70 ℃條件下，微波提取5 min，過(guò)濾，稀釋，得到1 mg/mL的供試品溶液，再用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

1.3.5樣品測(cè)定

吸取供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，按1.3.1節(jié)條件進(jìn)行色譜分析，測(cè)定羥基紅花黃色素A的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算其含量。

2　結(jié)果與分析

2.1提取條件的確定

對(duì)提取時(shí)間、微波功率、提取溫度、提取次數(shù)等影響微波輔助萃取效果的主要因素進(jìn)行了考察，確定微波功率 300 W、提取溫度 70 ℃、提取時(shí)間5 min、提取1 次時(shí)，紅花植物原料中羥基紅花黃色素A的提取率最高。

2.2色譜條件的優(yōu)化

2.2.1流動(dòng)相的選擇

考察了乙腈-水[21]、甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液、乙腈-甲醇、甲醇-水及甲醇-0.05%乙酸溶液[10]等幾種流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用前幾種流動(dòng)相系統(tǒng)，羥基紅花黃色素A與其他成分分離度不高，峰形不對(duì)稱；最終，選擇甲醇-0.05%乙酸溶液為流動(dòng)相，并進(jìn)行梯度洗脫，羥基紅花黃色素A的分離效果得到明顯改善，羥基紅花黃色素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1　羥基紅花黃色素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液（A）與供試品溶液（B）色譜圖Fig. 1　HPLC chromatograms of HSYA standard solution and sample solution

2.2.2流速的選擇

考察0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min條件下流速對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明，流速越大，樣品的分離時(shí)間越短，但是分離效果不佳，當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí)，分離效果最佳，分離時(shí)間較短，故確定1.0 mL/min為最佳流速。

2.2.3檢測(cè)波長(zhǎng)與柱溫的選擇

配制羥基紅花黃色素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以超純水為空白，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～800 nm掃描范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在403 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故確定403 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。改變柱溫，考察分離度改善情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱溫為30 ℃時(shí)，分離情況最佳，故確定柱溫為30 ℃。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系考察結(jié)果

在5.25～80.32 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，羥基紅花黃色素A的質(zhì)量濃度與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=49.745X－2.487 5，r=0.999 9。

2.4精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按1.3.4節(jié)方法制備供試品溶液6 份，按1.3.1節(jié)條件進(jìn)行羥基紅花黃色素A峰面積的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.00%，表明該方法精密度滿足分析要求。

表2　精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of precision test

2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按1.3.4節(jié)方法制備供試品溶液6 份，按1.3.1節(jié)條件，分別在0、12、18、24 h進(jìn)行羥基紅花黃色素A峰面積的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3，其RSD為1.95%，表明供試品溶液，在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3　穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3　Results of stability test

2.6加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

準(zhǔn)確稱取紅花植物原料樣品，分別加入不同質(zhì)量的羥基紅花黃色素A標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3.4節(jié)方法制備供試品溶液，測(cè)定羥基紅花黃色素A含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4，加標(biāo)回收率為101.0%～103.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.27%，表明該方法準(zhǔn)確度高，滿足分析要求。

表4　回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4　Results of recovery test

2.7樣品的含量測(cè)定結(jié)果

準(zhǔn)確稱取紅花植物原料樣品1 g，按1.3.4節(jié)方法制備供試品溶液，按1.3.1節(jié)條件進(jìn)行羥基紅花黃色素A含量的測(cè)定，計(jì)算得到紅花植物原料樣品中羥基黃色素A的含量為16.2 mg/g（1.62%）。文獻(xiàn)[23]對(duì)新疆不同產(chǎn)地的紅花植物原料質(zhì)量進(jìn)行了比較，得出了32 批新疆不同產(chǎn)地紅花中羥基紅花黃色素A含量為0.93%～2.25%，與文獻(xiàn)比較結(jié)果表明，本研究所采集的紅花植物原料樣品質(zhì)量屬于中等水平。

3　結(jié) 論

本研究采用微波輔助萃取法提取紅花植物原料樣品中有效成分，提取溶劑為純水，具有易得、綠色、環(huán)保、提取效果優(yōu)異等優(yōu)點(diǎn)，大大降低了提取溶劑的成本，并減少了環(huán)境污染。

本研究采用甲醇-0.05%乙酸溶液為流動(dòng)相，對(duì)藥食同源紅花植物原料樣品中的羥基紅花黃色素A進(jìn)行了梯度洗脫，具有峰形對(duì)稱、分離時(shí)間短、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，方法學(xué)考察結(jié)果表明，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)達(dá)到分析要求，方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于食品、保健品及其復(fù)方制劑中羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定。

參考文獻(xiàn)：

[1] FAN Lijiao, GUO Meili. Progress of safflower (Carthamus tinctorius L.) regeneration through tissue culture[J]. Journal of Medical Colleges of PLA, 2013, 28: 289-301. DOI:10.1016/S1000-1948(13)60045-3.

[2] 黎大爵. 紅花研究的歷史、現(xiàn)狀與展望[C]//全國(guó)紅花藥用學(xué)術(shù)會(huì)議論文集. 1996: 1-10.

[3] 洪菁. 市售中藥材紅花的質(zhì)量探討[J]. 海峽藥學(xué), 2006, 18(5): 106-107. DOI:10.3969/j.issn.1006-3765.2006.05.057.

[4] 曾春萍, 宮曉平, 韓慧琴, 等. 紅花藥材質(zhì)量現(xiàn)狀分析[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐, 2014, 28(4): 67-69.

[5] 郭宇飛, 申丹, 楊洪軍. 含紅花中藥組方規(guī)律分析[J]. 中國(guó)中醫(yī)雜志, 2014, 39(11): 2144-2148. DOI:10.4268/cjcmm20141140.

[6] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典: 一部[M]. 2010版. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010: 141-142.

[7] 趙明波, 鄧秀蘭, 王亞玲, 等. 高效液相色譜法測(cè)定紅花中的羥基紅花黃色素A[J]. 色譜, 2013, 21(6): 593-595. DOI:10.3321/ j.issn:1000-8713.2003.06.015.

[8] XIE Mingyong, WANG Huiqin, NIE Shaoping. Study on antioxidant activities of extract of safflower florets (Carthamus tinctorius L.)[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(9): 36-40. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2006.09.003.

[9] 張娟, 卿德剛, 倪慧, 等. 紅花黃色素HPLC指紋圖譜研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(1): 257-259. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2008.01.054.

[10] 劉紅, 郁曉藝, 李炳奇, 等. RP-HPLC法測(cè)定保健飲料中羥基紅花黃色素A的含量[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(2): 232-234. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2006.02.053.

[11] ZHOU Mingxue, FU Jianhua, ZHANG Qiong, et al. The effect of hydroxy safflower yellow A on inflammatory reaction in myocardium of the rats after acute myocardial infarction[J]. African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2013, 7(12): 643-649.

[12] KONG Dezhao, XIA Wei, ZHANG Zhe, et al. Safflower yellow injection combined with conventional therapy in Ireating unstable angina pectoris: a meta-analysis[J]. Traditional Chinese Medicine, 2013, 33(5): 553-561.

[13] 王若菁, 楊濱. 紅花的化學(xué)成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2007, 13(5): 65-69. DOI:10.3969/ j.issn.1005-9903.2007.05.023.

[14] HARRELKAS F, AZIZI A, YAAEOUBI A, et a1. Treatment of textile dye effluents using coagulation- floceulation coupled with membrane processes or adsorption on powdered activated carbon[J]. Desalination, 2009, 235(1/2/3): 330-339. DOI:10.1016/j.desal.2008.02.012.

[15] 侯世斌, 呂芳, 蘇幼紅, 等. 抗羥基紅花黃色素A抗血清的制備[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(3): 150-154. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2009.03.033.

[16] ZHANG Liang, LIN Pengcheng, LI Huye. Study on purification of hydroxy safflower yellow A from Carthamus tinctorius L. by macroporus resins[J]. Medicinal Plant, 2010, 1(6): 57-58; 63.

[17] LIAZID A, GUERRERO R F, CANTOS E, et al. Microwave assisted extraction of anthocyanins from grape skins[J]. Food Chemistry, 2011, 124(3): 1238-1243. DOI:10.1016/j.foodchem.2010.07.053.

[18] UPADHYAY R, RAMALAKSHMI K, JAGAN M R L. Microwaveassisted extraction of chlorogenic acids from green coffee beans[J]. Food Chemistry, 2012, 130(1): 184-188. DOI:10.1016/ j.foodchem.2011.06.057.

[19] 李書靜, 李可, 姚新建, 等. 微波輔助提取紅花黃色素工藝優(yōu)化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 52(12): 2891-2893. DOI:10.3969/ j.issn.0439-8114.2013.12.043.

[20] 王秀梅, 韓曉靜, 白梅榮, 等. HPLC法測(cè)定紅花地上部分羥基紅花黃色素A和木犀草素的含量[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥, 2014(8): 29-30.

[21] 蘭藝?guó)P, 周璐, 張立偉. HPLC法同時(shí)測(cè)定紅花中5種黃酮成分[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(12): 283-286.

[22] 劉建枝, 王棟, 周雪梅. HPLC法測(cè)定蒙成藥咽炎靈中羥基紅花黃色素A的含量[J]. 中國(guó)民族醫(yī)藥雜志, 2015, 1(1): 48-49. DOI:10.3969/ j.issn.1006-6810.2015.01.033.

[23] 劉雅新, 劉珊珊, 譚勇, 等. 新疆不同產(chǎn)地紅花質(zhì)量評(píng)價(jià)[J]. 中成藥, 2014, 36(1): 141-144. DOI:10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.034.

Separation and Analysis of Hydroxysafflor Yellow A in Edible and Medical Petals of Safflower Flowers by High Performance Liquid Chromatography

AISANJIANG·Aihaiti, WANG Jin, GUAN Ming*
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang Normal University, ürümqi830054, China)

Abstract:Objective: To e stablish a method for the determination of hydroxysafflor yellow A (HSYA) in medical and edible petals of safflower flowers by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods: The HSYA in the safflower flowers was extracted by microwave-assisted extraction, chromatographically separated using gradient elution and analyzed by HPLC. The separation was performed on Sino Chrom ODS-BP column (4.6 mm × 200 mm, 5 μm) using methanol-0.5% acetic acid as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min. The analyte was detected at 403 nm. Results: The calibration curve had good linear relationship in the range of 5.25–80.32 μg/mL for safflower yellow A (r = 0.999 9). The spiked recoveries were 101.0%–103.6%, with relative standard deviation (RSD) not exceeding 2.27%. Conclusions: The method was simple and accurate with good repeatability and could be used for the determination of hydroxysafflor yellow A in foods, health products, and compound medicinal preparations.

Key words:safflower (Carthamus tinctorius); hydroxysafflor yellow A; high performance liquid chromatography (HPLC); gradient elution

收稿日期：2015-09-14

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015211A033）；新疆維吾爾自治區(qū)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（XJGRI2014119）

作者簡(jiǎn)介：艾散江·艾海提（1989—），男，碩士研究生，主要從事儀器分析新方法研究。E-mail：326821579@qq.com

*通信作者：關(guān)明（1974—），男，教授，博士，主要從事儀器分析新方法研究。E-mail：guanm@xjnu.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612027

中圖分類號(hào)：TS201.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）12-0152-04