馬蘭根黃酮類化合物的提取工藝及其對(duì)毛尖茶葉脂肪氧合酶的抑制作用

吳桂玲，羅德尉

（1.貴州省黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州 都勻 558000；2.貴州高速黔通建設(shè)工程有限公司，貴州 都勻 558000）

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馬蘭根黃酮類化合物的提取工藝及其對(duì)毛尖茶葉脂肪氧合酶的抑制作用

吳桂玲1，羅德尉2

（1.貴州省黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州 都勻 558000；2.貴州高速黔通建設(shè)工程有限公司，貴州 都勻 558000）

摘 要：采用正交試驗(yàn)，對(duì)馬蘭根中總黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)選，并研究了提取的馬蘭根黃酮化合物對(duì)毛尖茶葉脂肪氧合酶LOX的抑制作用。結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間為2.5 h、固液比為1∶20 g/mL，提取效率較好，最佳工藝條件下黃酮提取率為16.422%；馬蘭根中黃酮化合物和BHA、BHT及Vc均對(duì)LOX有抑制作用，IC50分別為34.282、10.938、9.049、9.04 μg/mL。

關(guān)鍵詞：馬蘭根；總黃酮；正交試驗(yàn)；毛尖茶葉；脂肪氧合酶；抑制作用

馬蘭（Kalimeris indica）屬菊科馬蘭屬多年生草本植物，別名泥鰍串、田邊菊、路邊菊、蓑衣草、紫菊、紅梗菜、散血草等，在我國(guó)中東部和西南部都有廣泛種植［1］。馬蘭性涼、味辛、有清熱涼血、利濕解毒等功效［2］，在視力保護(hù)、防止動(dòng)脈硬化和防癌等方面都有重要作用，還可以治療扁桃體炎、瘧疾等癥［3］。研究表明，馬蘭含有黃酮、多糖、揮發(fā)油、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，其中黃酮類化合物可以抗氧化、延緩衰老、抗癌防癌和抗病毒［4-6］。本文研究了馬蘭根中總黃酮的提取工藝，為馬蘭根中黃酮類化合物的提取利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

脂肪氧合酶（Lipoxygenase，EC1. 13. 11. 12）屬氧化還原酶，通稱脂氧酶（LOX），是一種單核非血紅素鐵酶，它能夠選擇性催化具有順，順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng)，生成具有共軛雙鍵的多不飽和脂肪酸氫過(guò)氧化物（Hydroperoxides，HPOD）。LOX位于茶樹(shù)葉片葉綠體的片層結(jié)構(gòu)中，可以將茶葉中的不飽和脂肪酸氧化為HPOD。在茶葉加工過(guò)程中，茶鮮葉中的多種酶類物質(zhì)會(huì)作用于鮮葉中內(nèi)含物，對(duì)綠茶的香氣、滋味、湯色、外形等品質(zhì)均可產(chǎn)生重要影響［9］，茶葉中的脂肪氧合酶是茶葉產(chǎn)生陳味的主要原因［10］。因此，了解茶葉中LOX的特性可以在茶葉的加工儲(chǔ)藏中過(guò)程盡可能的抑制其活性而延長(zhǎng)茶葉的保藏期。已有報(bào)道槲皮素、紫杉葉素等4種黃酮化合物對(duì)大豆脂肪氧合酶具有抑制作用［11］，而黃酮類化合物對(duì)茶葉中的脂肪氧合酶的抑制作用還未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)馬蘭根中黃酮類化合物的提取工藝以及馬蘭根中黃酮類化合物對(duì)都勻毛尖茶葉中的脂肪氧合酶的抑制作用進(jìn)行研究，并與人工合成油脂抗氧化劑BHA和BHT以及抗壞血酸對(duì)毛尖茶葉脂肪氧合酶活性的抑制作用進(jìn)行比較，初步探討天然黃酮類化合物對(duì)毛尖茶葉脂氧合酶活性的抑制作用。有助于為進(jìn)一步進(jìn)行其失活機(jī)理的研究提供依據(jù)和方向，為茶葉保鮮的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馬蘭于2014年5月采于都勻市黔南民族師范學(xué)院。將新鮮馬蘭根用水洗凈，烘干，粉碎，過(guò)篩得馬蘭根干粉，密封于干燥器皿中貯存。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試樣：蕓香葉苷，含量≥95.0%，毛尖茶鮮葉，采自于都勻牛場(chǎng)，亞油酸（Sigma生產(chǎn)，純度為99. 9%），Tween 20，叔丁基茴香醚（BHA） 、2，6 -二叔丁基- 4 -甲基苯酚（BHT），抗壞血酸（VC），所用試劑均為分析純，水為自制去離子水。

儀器：TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-2000Z 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州英三谷華儀器有限公司；CL-2型恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；PHS-2C精密pH計(jì)，上海理達(dá)儀器廠；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；GTR21-1高速冷凍離心機(jī)，上海趙迪生物科技有限公司；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京科偉永興儀器有限公司；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品置于105℃下干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取0.0200 g樣品，用少量無(wú)水甲醇溶解，再用無(wú)水乙醇定容至100 mL，得0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00、9.00 mL，分別置于7支25 mL的容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1.00 mL，搖勻，放置6 min；加入5%的硝酸鋁溶液1.00 mL，搖勻后，放置5 min；加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻，用無(wú)水乙醇溶液定容，放置15～20 min，于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)下進(jìn)行光譜掃描，找出500 nm處蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度A，試劑空白參比，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

1.2.2 馬蘭根中總黃酮化合物的提取及含量測(cè)定 分別稱取馬蘭根干粉3.000 g，先用石油醚回流1 h，抽濾，棄濾液，留濾渣。按L9 （34） 正交試驗(yàn)（表1），在80℃下回流提取2次，合并提取液，用相應(yīng)提取劑定容至250 mL，備用。

表1 乙醇提取正交試驗(yàn)因素水平

總黃酮含量測(cè)定：利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 顯色法［12］，在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度。通過(guò)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量。

取1.5 mL馬蘭根黃酮溶液于25 mL容量瓶中，然后加入5%亞硝酸鈉溶液1.00 mL，搖勻后，放置6 min；再加入5%硝酸鋁溶液1.00 mL，搖勻后放置5 min；最后加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻，用一定濃度的乙醇溶液定容，放置15～20 min，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)500 nm處的吸光度A。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算馬蘭根黃酮樣品溶液中總黃酮的濃度，進(jìn)而得總黃酮含量和提取率。

1.2.3 毛尖茶葉脂肪氧合酶（LOX）的提取 將茶鮮葉洗凈晾干，粉碎，稱取10.0000 g，加入200 mL pH6.3的麥?zhǔn)暇彌_溶液，勻漿2 min，過(guò)濾，濾液在4℃時(shí)離心高速離心5 min，取上清液，加入固體硫酸銨至30%飽和度，放置冰箱4 h后高速離心5 min，再取上清液，加入固體硫酸銨至70%飽和度，置于冰箱過(guò)夜，取出高速離心10 min，取沉淀加入15 mL麥?zhǔn)暇彌_溶液溶解，得到粗酶液［13］。

1.2.4 茶葉脂肪氧合酶（LOX）活性測(cè)定 茶葉脂氧合酶（LOX）的活性采用分光光度法測(cè)定。以50℃、pH6.3下，亞油酸為底物的15 mL反應(yīng)體系在234 nm處每分鐘增加 0.001吸光度值定義為一個(gè)酶活單位［14-15］。

底物制備：將0. 25 mL Tween 20分散于10 mL pH值9.0的0.2 mol/L 的硼酸鹽緩沖液中，邊搖動(dòng)邊逐滴加入亞油酸0.27 mL，充分混合，再加入1 mol/L氫氧化鈉溶液使體系變澄清，調(diào)pH值至9.0，然后用上述緩沖液稀釋到500 mL 作為底物。

參照Axelrod等［16］方法，略作修改，具體操作如下：3 mL反應(yīng)體系中含亞油酸鈉母液50 μL，緩沖液2 750 μL，粗酶液0.2 mL。在50℃下反應(yīng)，測(cè)定234 nm處的消光值。2 min時(shí)記錄一次，4 min時(shí)再記錄一次，觀察OD值變化。酶活性以△OD234/ g.FWμmin來(lái)表示。3次重復(fù)。

式中，A為酶活性單位，OD4min為反應(yīng)4 min的OD值，OD2min為反應(yīng)2 min的OD值。

1.2.5 茶葉脂肪氧合酶（LOX）的活性抑制性測(cè)定 分別取0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mL一定濃度的馬蘭根黃酮化合物加入到含0.2 mL酶液 （已稀釋一定倍數(shù) ）、50 μL底物的3 mL反應(yīng)體系中，混勻后用pH6.3的緩沖溶液補(bǔ)足至3 mL，于50℃恒溫水浴中恒溫2 min，進(jìn)行光譜掃描，并記錄234 nm處的吸光度，再于50℃恒溫水浴中恒溫2 min，進(jìn)行光譜掃描，記錄234 nm處的吸光度。黃酮化合物對(duì)茶葉脂肪氧合酶的抑制率按下式計(jì)算：

式中，A0為無(wú)抑制劑時(shí)的酶活力，A1為加抑制劑時(shí)的酶活力。

1.2.6 人工合成抗氧化劑BHA和BHT以及Vc對(duì)茶葉LOX活性抑制性測(cè)定 分別取一定濃度和一定體積的BHA和BHT以及Vc化合物加入到含0.2 mL酶液 （已稀釋一定倍數(shù) ），50 μL底物的3 mL反應(yīng)體系中，混勻后用pH6.3的麥?zhǔn)暇彌_溶液補(bǔ)足至3 mL，于50℃恒溫水浴中恒溫2 min，進(jìn)行光譜掃描，并記錄234 nm處的吸光度，再于50℃恒溫水浴中恒溫2 min，進(jìn)行光譜掃描，記錄234 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和樣品總黃酮含量

以500 nm下測(cè)定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值與濃度的關(guān)系，作線性回歸，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度C與吸光度A間的回歸方程為Y = 10.87412X + 0.0086，相關(guān)系數(shù)R2= 0. 9995（圖1）。將500 nm處馬蘭根黃酮樣品溶液的吸光度值代入上面的回歸方程得到樣品中馬蘭根總黃酮含量。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 乙醇提取黃酮工藝參數(shù)確定

利用乙醇提取馬蘭根總黃酮，對(duì)影響提取率的提取時(shí)間、乙醇濃度和固液比等因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，當(dāng)提取溫度為80℃，提取時(shí)間、乙醇濃度和液料比對(duì)馬蘭黃酮類化合物的提取得率均有不同程度的影響，影響因素主次為乙醇濃度＞料液比＞提取時(shí)間（即B＞C＞A）。提取的最佳條件為A3B1C2，即提取時(shí)間2.5 h、乙醇濃度70%、料液比1∶20 g/mL。但表2中的設(shè)計(jì)方案并不包含最佳提取條件A3B1C2，因此需要進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。按最佳提取工藝條件和2.2.2提取工藝流程再次重復(fù)提取3次，在A3B1C2條件下總黃酮的提取率為16.422%，高于表2條件下的提取率，表明由L9 （34） 正交試驗(yàn)得到的優(yōu)化條件A3B1C2提取馬蘭根中的總黃酮，不僅提取率高，且重復(fù)性好。

2.3 茶葉脂肪氧合酶（LOX）活性

根據(jù)酶活力計(jì)算公式，在50℃，pH 值6.3條件下，測(cè)得茶葉脂氧合酶的酶活力 A = 33.9。

表2 乙醇提取馬蘭根黃酮正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 馬蘭根黃酮對(duì)茶葉脂肪氧合酶（LOX） 的活性抑制作用

在溫度為50℃、pH為6.3條件下，隨著馬蘭根黃酮化合物濃度的增大，黃酮化合物對(duì)茶葉脂肪氧合酶催化亞油酸底物的抑制性也隨之增強(qiáng)，結(jié)果見(jiàn)圖2。馬蘭根黃酮：IC50= 34.282 mg/mL。

圖2 馬蘭根黃酮對(duì)LOX的抑制率

2.5 BHA、BHT以及Vc化合物對(duì)LOX的抑制作用

在溫度為50℃、pH為6.3，濃度相同條件下，BHA、BHT和Vc均對(duì)茶葉脂肪氧合酶催化亞油酸底物有抑制性，且抑制率隨著濃度的增加而增強(qiáng)。由圖3可知，Vc對(duì)LOX的抑制性最強(qiáng)，其次是BHT，BHA要比前兩種對(duì)LOX的抑制性弱，這3種人工合成抗氧劑對(duì)LOX的半數(shù)抑制濃度分別為：BHA：IC50= 10.938 mg/mL，BHT：IC50= 9.049mg/mL，Vc：IC50= 9.04 mg/mL。

圖3 BHA和BHT以及Vc對(duì)LOX的抑制率

3 結(jié)論

本研究采用正交試驗(yàn)優(yōu)化了馬蘭根總黃酮乙醇提取工藝，在溫度為80℃，得到影響因素主次順序?yàn)橐掖紳舛龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間。在最佳提取工藝條件即提取時(shí)間2.5 h、乙醇濃度為70%、料液比1∶20 g/mL下，提取率高達(dá)16.422%。馬蘭根中黃酮化合物對(duì)毛尖茶葉脂氧合酶有一定的抑制作用，在溫度為50℃，pH為6.3條件下，隨著黃酮化合物和人工合成抗氧化劑濃度的增大，天然黃酮化合物和人工合成抗氧化劑均對(duì)茶葉脂肪氧合酶催化亞油酸底物的抑制性也逐漸增強(qiáng)，相比較而言，人工合成抗氧化劑的抑制效果比馬蘭根中黃酮化合物的抑制性強(qiáng)，通過(guò)此研究，有助于為進(jìn)一步研究如何控制在干茶中保留的LOX在貯藏中作用于脂肪酸產(chǎn)生低碳醛而使茶葉產(chǎn)生異味，為茶葉保鮮的研究奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 白雪娜）

Extraction technology of flavonoids in Kalimeris indica root and its inhibitory Effects on activity of Lipoxygenase of Maojian tea leaves

WU Gui-ling1，LUO De-wei2
（1.School of Chemistry and Chemical Engineering，Qiannan Normal University for Nationalities，Duyun 558000，China；2. Qiantong Construction Engineering Co. of Guizhou Speed，Duyun 558000，China）

Abstract：The optimal extraction conditions of flavonoids in Kalimeris indica root were determined by orthogonal design. The results showed that the optimal conditions were as follows： 70% （ volume fraction） ethanol，extraction time of 2.5 h， 1∶20（g/mL） solid-liquid ratio，the yield of total flavonoids could reach 16.422%. The inhibitory effects of flavonoids from root of K. indica on the activity of lipoxygenase of Maojian tea leaves were also studied，and were compared with the same concentration of BHA， BHT and Vc. The results showed that flavonoids from root of K. indica，BHA， BHT and Vc all had inhibitory effects on the activity of lipoxygenase，IC50 were 34.282μg/mL， 10.938 mg/mL，9.049 μg/mL and 9.04 μg/mL.

Key words：Kalimeris indica root；flavonoids； orthogonal design；Maojian tea leaves；lipoxygenase；inhibitory effects

中圖分類號(hào)：O629.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-874X（2016）02-0123-05

收稿日期：2015-05-29

基金項(xiàng)目：2013年度貴州省科學(xué)技術(shù)廳、黔南州科學(xué)技術(shù)和知識(shí)產(chǎn)權(quán)局、黔南民族師范學(xué)院聯(lián)合基金（黔科合J字LKQS〔2013〕17號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：吳桂玲（1985-），女，碩士，講師，E-mail：wuguiling1985@163.com