關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)膠原纖維各向異性的紅外光譜學(xué)顯微成像研究

吳曰超，張學(xué)喜，毛之華，尹建華

南京航空航天大學(xué)自動(dòng)化學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，江蘇 南京 210016

關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)膠原纖維各向異性的紅外光譜學(xué)顯微成像研究

吳曰超，張學(xué)喜，毛之華，尹建華*

南京航空航天大學(xué)自動(dòng)化學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，江蘇 南京 210016

福爾馬林溶液對(duì)于固化關(guān)節(jié)軟骨組織、防止在長(zhǎng)時(shí)間測(cè)量過程中組織的分解退化起到很好的作用，但對(duì)福爾馬林溶液浸泡后軟骨組織的結(jié)構(gòu)變化(固化)過程及其膠原纖維各向異性的改變卻鮮有研究。采用傅里葉變換紅外光譜顯微成像技術(shù)與偏振技術(shù)相結(jié)合的方法，通過關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)膠原纖維(蛋白)的紅外光譜特征吸收峰(Amide Ⅰ，Amide Ⅱ帶)的吸光度隨福爾馬林溶液浸泡時(shí)間及偏光角度的變化來研究福爾馬林溶液對(duì)軟骨組織結(jié)構(gòu)即膠原纖維各向異性的影響，并利用與各向異性方程擬合得到的決定系數(shù)(R2)對(duì)膠原蛋白纖維各向異性程度進(jìn)行表征。研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)軟骨Amide Ⅰ和Amide Ⅱ帶的各向異性隨著福爾馬林浸泡時(shí)間的增長(zhǎng)而愈加明顯(Amide Ⅰ帶變化尤為明顯)，說明福爾馬林溶液中甲醛分子誘發(fā)了膠原蛋白分子新的交聯(lián)，最終獲得較好的固化效果，有利于關(guān)節(jié)軟骨的各向異性分析。本研究將為今后關(guān)節(jié)軟骨樣本的制備、儲(chǔ)存及各向異性研究提供參考。

傅里葉變換紅外光譜成像； 關(guān)節(jié)軟骨； 膠原纖維； 偏振光； 各向異性

引 言

關(guān)節(jié)軟骨是覆蓋在骨關(guān)節(jié)表面的一種透明的結(jié)締組織，其作用是減少運(yùn)動(dòng)帶來的骨關(guān)節(jié)之間的摩擦和振動(dòng)。它主要由Ⅱ類膠原蛋白(collagen Ⅱ)、蛋白多糖(proteoglycan, PG)、水和少量的無機(jī)離子組成[1-2]。膠原蛋白構(gòu)成三維纖維網(wǎng)絡(luò)的基本結(jié)構(gòu)，在組織中提供拉伸強(qiáng)度和剛度的作用，使軟骨保持一定的形狀和硬度并能有效地固定住PG[3-4]。PG則能較好地保證軟骨的彈性、耐壓性和持久性。正是由于二者的有機(jī)組合，保持了關(guān)節(jié)軟骨中水的含量以及與滑液的離子交換，有效的承載人體運(yùn)動(dòng)和負(fù)重。關(guān)節(jié)軟骨從軟骨表面到底層的鈣化區(qū)之間可分成三個(gè)區(qū)，即表層區(qū)(superficial zone, SZ)、過渡區(qū)(transitionalzone, TZ)和放射區(qū)(radial zone, RZ)[5]，且在三個(gè)分區(qū)內(nèi)膠原纖維的結(jié)構(gòu)排列各不相同[6]。一旦出現(xiàn)膠原結(jié)構(gòu)的破壞或蛋白多糖的流失，則可能導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎(即關(guān)節(jié)軟骨退化病變, OA)的發(fā)生。因此軟骨組織中膠原纖維結(jié)構(gòu)的研究，對(duì)于監(jiān)測(cè)軟骨的退化及骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和修復(fù)有著重要的意義。

目前在關(guān)節(jié)軟骨的研究中使用的軟骨材料一般是新鮮關(guān)節(jié)軟骨的冷凍切片或是福爾馬林溶液浸泡后用石蠟固定的軟骨切片[7-10]。福爾馬林溶液對(duì)于組織固化、防止在長(zhǎng)時(shí)間測(cè)量過程中組織的分解退化起到很好的作用。通常認(rèn)為，經(jīng)福爾馬林溶液浸泡后的樣品切片易于在成像或光照射等測(cè)量后的組織學(xué)分析，有利于組織的形態(tài)學(xué)和病理學(xué)研究[11]。在此之前的研究中，都是對(duì)經(jīng)福爾馬林溶液浸泡過的軟骨組織樣本利用生物化學(xué)[12]和微磁共振成像[13-14]的方法對(duì)其交聯(lián)情況進(jìn)行分析，但福爾馬林溶液被用于組織固化時(shí)對(duì)軟骨組織中膠原蛋白纖維結(jié)構(gòu)的影響及作用過程卻一直無人研究，特別是對(duì)于光譜學(xué)中的各向異性研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品制備

實(shí)驗(yàn)用關(guān)節(jié)軟骨切片來自健康成年狗的肩關(guān)節(jié)軟骨，首先將新鮮的軟骨組織切成2 mm×2 mm×2 mm大小的切塊，將切割的軟骨樣品分成四組，浸在生理鹽水中清洗1 min，之后將其中的三組樣品分別放入福爾馬林溶液浸泡2，10和95 h。浸泡結(jié)束后將四組軟骨樣品用冰凍切片機(jī)(Leica CM 1950, Germany)切成10 μm厚度的顯微切片，將切割后的軟骨樣品放在室溫下風(fēng)干2 h，以減少顯微成像過程中水分的影響。

1.2 紅外光譜成像及分析

實(shí)驗(yàn)采用的FTIRI系統(tǒng)是Perkin Elmer公司的Spotlight 300，主要由一個(gè)傅里葉變換紅外光譜儀(Spectrum One)耦合一個(gè)Spotlight300顯微鏡裝置組成[15]。實(shí)驗(yàn)采用反射模式對(duì)組織切片中感興趣的矩形區(qū)域(ROI)進(jìn)行成像，光譜范圍為4 000～800 cm-1，像素大小為6.25 μm×6.25 μm，8 cm-1光譜間隔。此外，為了獲得樣品的各向異性，實(shí)驗(yàn)中將一個(gè)紅外光譜線柵偏振器嵌入樣品和檢測(cè)器之間，將偏振器檢偏角度分別設(shè)置在0°，30°，60°，90°，120°，150°和180°，并獲得對(duì)應(yīng)角度下的紅外光譜圖像。分別繪制Amide Ⅰ帶和Amide Ⅱ帶在不同深度下平均吸收度隨檢偏角度變化曲線進(jìn)行各向異性分析[16, 21]。作圖及擬合過程在專業(yè)的數(shù)據(jù)處理軟件Origin中進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 軟骨的紅外光譜與成像

圖1是被福爾馬林溶液浸泡95 h后關(guān)節(jié)軟骨的FTIR成像，關(guān)節(jié)軟骨的深度起始位置及大致分區(qū)已在圖中標(biāo)出，其中TM處為關(guān)節(jié)軟骨的潮線位置，可視圖像[圖1(a)]和紅外光譜圖像[圖1(b)—(d)]相互對(duì)應(yīng)。從圖1(b)中可提取軟骨樣本的任意像素的紅外光譜，如圖2所示。圖中Amide Ⅰ (1 700～1 600 cm-1)帶和Amide Ⅱ (1 600～1 500 cm-1)帶在結(jié)構(gòu)分析中可作為表征膠原蛋白的特征帶[16]。圖1中(c)和(d)即為Amide Ⅰ和Amide Ⅱ帶對(duì)應(yīng)的成分圖像(Chemimap)，它們定性表征了膠原蛋白含量隨軟骨深度的變化情況。

2.2 各向異性分析

將圖1中Chemimap轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)特征帶的紅外吸光度隨軟骨深度變化的二維曲線，可更直觀的表現(xiàn)這些特征基團(tuán)及相應(yīng)主成分含量隨軟骨深度的變化信息，如圖3中的各曲線所示。圖3(a)為Amide Ⅰ 帶平均吸光度隨軟骨深度變化曲線，圖中顯示，在50 μm之前，起偏角度為90°時(shí)Amide Ⅰ帶的吸光度高于起偏角度為0°時(shí)Amide Ⅰ帶的吸光度，兩者關(guān)系在50 μm處發(fā)生反轉(zhuǎn)； 圖3(b)為Amide Ⅱ 帶平均吸光度隨軟骨深度變化曲線，圖中顯示，在116 μm之前，起偏角度為0°時(shí)Amide Ⅱ 帶的吸光度高于起偏角度為90°時(shí)Amide Ⅱ帶的吸光度，兩者關(guān)系在116 μm處發(fā)生反轉(zhuǎn)。上述50 μm(116 μm)即為Amide Ⅰ(Amide Ⅱ)的各向異性反轉(zhuǎn)點(diǎn)，該結(jié)果與文獻(xiàn)[16]中兩個(gè)特征帶的反轉(zhuǎn)點(diǎn)相一致的結(jié)論有所不同，這可能是福爾馬林溶液的浸泡導(dǎo)致膠原蛋白分子間交聯(lián)引起的。

圖1 經(jīng)福爾馬林溶液浸泡95 h后的關(guān)節(jié)軟骨切片的可視圖像(a)，F(xiàn)TIR全吸收?qǐng)D像(b)，酰胺Ⅰ帶(c)和酰胺Ⅱ帶(d)特征吸收?qǐng)D像

Fig.1 The visible image (a), total absorption FTIR image (b) and chemimaps of Amide Ⅰ (c) and Amide Ⅱ (d) of articular cartilage immersed in Formalin for 95 h

TM: Tidemark

圖2 從關(guān)節(jié)軟骨切片的FTIR成像中提取的一個(gè)紅外光譜

圖4(a)—(c)表示經(jīng)福爾馬林溶液浸泡不同時(shí)間軟骨樣本的在各向異性翻轉(zhuǎn)點(diǎn)兩側(cè)31.25和300 μm深度位置的紅外光譜Amide Ⅰ帶和Amide Ⅱ帶吸光度隨角度變化關(guān)系圖。對(duì)于不同樣品，由于同區(qū)域內(nèi)相近深度的各向異性差別不大[22]，圖4的軟骨深度統(tǒng)一使用31.25和300 μm作為SZ區(qū)和RZ區(qū)位置的代表。與馬呂斯定律類似，該深度下關(guān)節(jié)軟骨紅外光譜特征帶吸光度隨角度變化關(guān)系滿足方程[23]

(1)

圖3 被福爾馬林溶液浸泡95 h關(guān)節(jié)軟骨在無起偏器，偏振角度為0°和90°下的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ帶平均吸光度隨軟骨深度變化的二維曲線

圖4 分別被福爾馬林溶液浸泡2 h (a)，10 h (b)和95 h (c)的關(guān)節(jié)軟骨切片酰胺Ⅰ帶(左列)和酰胺Ⅱ帶(右列)在31.25 μm(▲, SZ)和30 μm(■, RZ)深度下的各向異性情況，圖中曲線擬合采自式(11)(擬合圖中左側(cè)縱坐標(biāo)為31.25 μm深度下的吸光度，右側(cè)為300 μm深度下的吸光度)

Fig.4 The infrared absorbance anisotropy of Amide Ⅰ (the left column) and Amide Ⅱ (the right column) at 31.25 μm (▲, SZ-left absorbance in each graph) and 300 μm (■, RZ-right absorbance in each graph) depth of AC immersed in Formalin for 2 h (a), 10 h (b) and 95 h (c). The fitted lines are from equation (1)

圖5所示為Amide Ⅰ帶和Amide Ⅱ帶各向異性擬合的決定系數(shù)(R2)隨福爾馬林溶液浸泡時(shí)間變化的關(guān)系。可以看出： (1)在SZ，隨浸泡時(shí)間的增長(zhǎng)，R2增加，即SZ中纖維各向異性隨浸泡時(shí)間的增加而增強(qiáng)； Amide Ⅰ帶只有在浸泡95 h的樣本中各向異性比較明顯； (2)RZ的兩個(gè)特征帶的各向異性的正弦特性在各個(gè)樣本都比SZ明顯，隨浸泡時(shí)間的增加而增強(qiáng)，纖維排列最終趨于穩(wěn)定； 相同位置的相同特征帶，浸泡時(shí)間長(zhǎng)的樣本的擬合程度高于浸泡時(shí)間短的樣本。

圖5 在SZ，RZ區(qū)域，關(guān)節(jié)軟骨切片的酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的各向異性決定系數(shù)隨福爾馬林溶液浸泡時(shí)間的變化情況

Fig.5 The Formalin-immersing time dependences of the fitting coefficient of determination of anisotropy of Amide Ⅰ and Amide Ⅱ of cartilage section in SZ and RZ

3 結(jié) 論

軟骨的FTIRI研究實(shí)現(xiàn)了軟骨各向異性的無損探測(cè)，說明福爾馬林溶液使關(guān)節(jié)軟骨中的膠原蛋白纖維發(fā)生交聯(lián)，固化了關(guān)節(jié)軟骨樣本且不破壞樣本的固有結(jié)構(gòu)，更利于樣本的長(zhǎng)時(shí)間保存和光譜成像，適合用于對(duì)膠原纖維各向異性的研究。本研究有助于軟骨組織樣本的制備和結(jié)構(gòu)功能的深入研究。

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(Received Jun. 1, 2015; accepted Sep. 14, 2015)

*Corresponding author

Study on the Anisotropy of Collagenours Fibers in Articular with Infrared Imaging

WU Yue-chao, ZHANG Xue-xi, MAO Zhi-hua, YIN Jian-hua*

Department of Biomedical Engineering, Nanjing University of Aeronautics and Astronautics, Nanjing 210016, China

Formalin solution has been widely used to solidify the organization of articular cartilage and prevent tissue decomposition in long-time measurement. However, it was rarely investigated that the structural anisotropy changes of collagen fiber (fixation) of articular cartilage when it was immersed in formalin. In this paper, Fourier transform infrared spectroscopic imaging with polarization technique was used to investigate the anisotropic structure change of collagen fiber of articular cartilage fixed in formalin through the absorbance change of Amide I and Amide II with immersing time and polarization direction. The degree of anisotropy of collagen fiber in cartilage was characterized with fitting related coefficient of absorbance. The anisotropy of Amide I and Amide II became stronger with immersing extension of articular cartilage in formalin, and the amide I showed more remarkable anisotropy. It was concluded that the formalin solution induced new crosslinks of collagen, which gradually strengthened the collagen fiber anisotropy and was helpful for the structural analysis of the articular cartilage. The study will be significant for the preparation, preservation and anisotropy research of cartilage specimen.

Fourier transform infrared spectroscopic imaging； Articular cartilage； Collagen fiber； Polarized light； Anisotropy

2015-06-01，

2015-09-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (61378087), 江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(SBK2015021989)和高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(20133218120017) 資助

吳曰超, 1992年生，南京航空航天大學(xué)自動(dòng)化學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系碩士研究生 e-mail: shanghai234@126.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: yin@nuaa.edu.cn

O433

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)07-2071-05