甘草內(nèi)生菌20株有效菌株發(fā)酵物與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷體外抑菌活性對比研究*

趙　妮,鄧　毅, 劉　靚,董金香,曼　瓊,楊志軍

(1.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

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甘草內(nèi)生菌20株有效菌株發(fā)酵物與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷體外抑菌活性對比研究*

趙妮1,鄧毅2, 劉靚1,董金香1,曼瓊1,楊志軍1

(1.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

摘要目的：研究甘肅野生和栽培甘草內(nèi)生菌有效菌株發(fā)酵物與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷體外抑菌活性的差異。方法：采用體外定量抑菌方法觀察20株甘草內(nèi)生菌有效菌株發(fā)酵物、水煎液、總黃酮、總皂苷對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌的抑菌活性。結果：各組對金黃色葡萄球菌均有抑菌活性(P<0.01)，各有效菌株組均弱于宿主組；有效菌株中JTZB059、JTYB029抑菌活性相對較強，最小抑菌濃度分別為0.125 0 ，0.062 5 g/mL；宿主中野生、栽培甘草總黃酮抑菌活性相對較強。各組對肺炎鏈球菌均有抑菌活性(P<0.01)；與栽培甘草水煎液、總皂苷對比，JTZB005抑菌活性較強(P<0.01)，最小抑菌濃度0.062 5 g/mL；有效菌株中JTZB005抑菌活性相對較強，宿主中栽培甘草總黃酮抑菌活性相對較強。各組對大腸桿菌均有抑菌活性(P<0.01)；與栽培甘草水煎液、總黃酮對比，JTZB018抑菌活性較強(P<0.01)，最小抑菌濃度0.125 0 g/mL；有效菌株中JTZB018抑菌活性相對較強，宿主中野生、栽培甘草總黃酮抑菌活性相對較強。結論：20株甘草內(nèi)生菌發(fā)酵物對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌均有不同程度抑菌活性，JTZB005對肺炎鏈球菌的抑菌活性強于栽培甘草水煎液、總皂苷，JTZB018對大腸桿菌的抑菌活性強于栽培甘草水煎液、總黃酮。

關鍵詞甘草；內(nèi)生菌；水煎液；總黃酮；總皂苷；抑菌活性；對比

甘草具有補中益氣、清熱解毒、止咳化痰、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效。研究表明：甘草、甘草黃酮和甘草皂苷均有抑菌作用[1-2]。植物內(nèi)生菌在與宿主共生過程中發(fā)生基因重組獲得宿主植物基因，能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的藥用活性，并具有多種生理活性。本實驗將甘肅野生與栽培烏拉爾甘草分離純化，經(jīng)菌餅法篩選20株有效菌株，比較觀察20株有效菌株與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷體外抑菌活性差異。

1材料與方法

1.1藥品、試劑與儀器

野生、栽培烏拉爾甘草GlycyrrhizauralensisFisch.于2014年9月購于甘肅省酒泉市金塔縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學生藥實驗中心林麗高級實驗師鑒定為正品。將新鮮的野生與栽培甘草的根部泥沙清理掉，用保鮮膜分開包裝，4 ℃保存。無水乙醇(批號20140718)、氨水(批號20141011)、乙酸乙酯(批號20141124)購自天津市百世化工有限公司；生理鹽水，西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司，批號1503217B。9082-B型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海福瑪實驗設備有限公司產(chǎn)品；LDZX-30FB立體壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；SW-1F-CJ無菌操作臺，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；BS-110S 型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；CT14RD臺式高速冷凍離心機，海天美生化儀器設備工程有限公司產(chǎn)品；KQ-500DE 型數(shù)控超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；臺式低速離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.2菌種

金黃色葡萄球菌(CMCC 26003)、肺炎鏈球菌(ATCC 6303)、大腸桿菌(CMCC 44102)，均購自蘭州百源基因有限公司。

1.3培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂(NA，批號20130106)、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA，批號20140812)、營養(yǎng)肉湯(批號20140923)、馬鈴薯葡萄糖水(批號20140821)，均購自青島高科園海博生物技術有限公司。

1.4甘草水煎液的制備

野生及栽培甘草破碎至1～3 mm長度，各取50 g 加5 00 mL水，浸泡30 min，武火加熱，文火煎煮60 min，紗布濾過，濾液水浴濃縮至25 mL含生藥量2 g/mL，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5甘草總黃酮和總皂苷的制備

前期通過正交試驗優(yōu)選野生和栽培甘草總黃酮、總皂苷超聲提取工藝結果。野生甘草總黃酮、總皂苷超聲提取條件：提取溫度50 ℃，提取時間45 min，乙醇體積分數(shù)600 mL /L，料液比1∶10。栽培甘草總黃酮和總皂苷提取條件：提取溫度40 ℃，提取時間40 min，乙醇體積分數(shù)800 mL/L，料液比1∶10。將提取液濃縮，加氨水至溶液為堿性，用乙酸乙酯萃取4次，濃縮至固體，即得甘草總黃酮，質(zhì)量分數(shù)為750 g/L。收集下層萃取液，加鹽酸至pH值為1～2，冰箱靜置，使甘草總皂苷充分沉淀，離心，取沉淀，干燥至恒重，即得甘草總皂苷，質(zhì)量分數(shù)為450 g/L[3]。

1.6甘草內(nèi)生菌有效菌株的篩選

參照參考文獻[4]進行。 將野生和栽培甘草分別分離培養(yǎng)純化[5]。野生甘草分離出63株內(nèi)生菌，其中內(nèi)生細菌31株，內(nèi)生真菌32株；栽培甘草分離出77株內(nèi)生菌，其中內(nèi)生細菌63株，內(nèi)生真菌14株。以菌餅法對分離的內(nèi)生菌中的金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌分別進行體外抑菌篩選，對金黃色葡萄球菌抑制作用的有18株(JTYB006，029；JTYF023；JTZB002，005，006，014，016，018，020，043，054，058，059，060，062，063；JTZF011)，對肺炎鏈球菌抑制作用的3株(JTZB005，043；JTZF014)，對大腸桿菌抑制作用的3株(JTYB012；JTZB018，020)。

1.7甘草內(nèi)生細菌發(fā)酵液的制備

參照參考文獻[6]進行。將甘草內(nèi)生細菌于營養(yǎng)瓊脂中，25 ℃恒溫培養(yǎng)2 d；將營養(yǎng)肉湯按每瓶100 mL分裝至250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min；將活化的菌株用接種環(huán)各挑去3環(huán)菌種接種于相應液體培養(yǎng)基中，25 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)4 d；發(fā)酵完成后，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；上清液采用0.22 μm過濾器過濾，60 ℃條件下烘干，備用。

1.8甘草內(nèi)生真菌發(fā)酵液的制備

參照參考文獻[6]進行。將甘草內(nèi)生真菌于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，25 ℃暗箱培養(yǎng)7 d；將馬鈴薯水按每瓶100 mL分裝于250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min；將活化后的菌株用打孔器打3個菌餅接種于馬鈴薯水中，25 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)7 d；發(fā)酵完成后，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；上清液采用0.22 μm過濾器過濾，60 ℃條件下烘干，備用。

1.9檢測指標

1.9.1對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌抑菌作用的測定

參照參考文獻[7]進行。分別將金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌置恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h，于試管壁上研磨并溶于2 mL生理鹽水中，配置成相當于0.5麥氏比濁管濃度的菌液。用微量移液器吸取100 μL于直徑為90 mm的無菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，三角玻璃棒涂布均勻，用直徑為6 mm的無菌打孔器在涂菌的固體培養(yǎng)基上均勻且垂直打3個孔，呈正三角形。吸取相應藥液于孔中，無菌蒸餾水做對照，各做3個平皿。37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h。用游標卡尺測量每個抑菌圈兩個垂直方向的直徑，取其平均值進行統(tǒng)計分析，計算3個平皿9個孔的抑菌圈的平均值。

1.9.2各組最小抑菌濃度(MIC)的測定

參照參考文獻[8]進行。在96孔板中每孔加入80 μL滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，按二倍稀釋法加入1 g/mL的藥液100 μL至第10孔，之后在第1～11孔中加入20 μL相當于0.5麥氏比濁管濃度的菌液，第12孔中加入20 μL無菌蒸餾水。37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后觀察培養(yǎng)液，澄清者表明有抑菌作用。

1.10統(tǒng)計學方法

2結果

2.1各有效菌株與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌的抑制作用

野生與栽培甘草內(nèi)生菌有效菌株發(fā)酵物、水煎液、總黃酮、總皂苷對金黃色葡萄球菌均有抑菌活性(P<0.01)。各有效菌株組抑菌活性均弱于宿主組；有效菌株中JTZB059、JTYB029抑菌活性相對較強，宿主中野生、栽培甘草總黃酮抑菌活性相對較強。見表1。

表1　對金黃色葡萄球菌抑菌圈值表　　±s

注：JTYB為野生甘草內(nèi)生細菌，JTYF為野生甘草內(nèi)生真菌，JTZB為栽培甘草內(nèi)生細菌，JTZF為栽培甘草內(nèi)生真菌。與無菌水對比，*P<0.05，**P<0.01；與野生甘草水煎液對比，##P<0.01；與栽培甘草水煎液對比，△P<0.05，△△P<0.01；與野生甘草總黃酮對比，＊＊P<0.01；與栽培甘草總黃酮對比，▲▲P<0.01；與野生甘草總皂苷對比，□□P<0.01；與栽培甘草總皂苷對比，■■P<0.01。

栽培甘草內(nèi)生菌有效菌株、水煎液、總黃酮、總皂苷對肺炎鏈球菌均有抑菌活性(P<0.01)。與栽培甘草水煎液、栽培甘草總皂苷比較，JTZB005抑菌活性較強(P<0.01)。有效菌株中JTZB005抑菌活性相對較強，宿主中野生甘草總黃酮抑菌活性相對較強。見表2。

表2　對肺炎鏈球菌抑菌圈值表　　±s

注：JTYB為野生甘草內(nèi)生細菌，JTYF為野生甘草內(nèi)生真菌，JTZB為栽培甘草內(nèi)生細菌，JTZF為栽培甘草內(nèi)生真菌。與無菌水對比，**P<0.01；與野生甘草水煎液對比，##P<0.01；與栽培甘草水煎液對比，△△P<0.01；與野生甘草總黃酮對比，＊＊P<0.01；與栽培甘草總黃酮對比，▲▲P<0.01；與野生甘草總皂苷對比，□P<0.05；與栽培甘草總皂苷對比，■■P<0.01。

各有效菌株、水煎液、總黃酮、總皂苷對大腸桿菌均有抑菌活性(P<0.01)。與栽培甘草水煎液、栽培甘草總黃酮對比，JTZB018抑菌活性較強(P<0.01)。有效菌株中JTZB018抑菌活性相對較強，宿主中野生、栽培甘草總黃酮抑菌活性相對較強。見表3。

表3　對大腸桿菌抑菌圈值表　　±s

注：JTYB為野生甘草內(nèi)生細菌，JTYF為野生甘草內(nèi)生真菌，JTZB為栽培甘草內(nèi)生細菌，JTZF為栽培甘草內(nèi)生真菌。與無菌水對比，**P<0.01；與野生甘草水煎液對比，##P<0.01；與栽培甘草水煎液對比，△△P<0.01；與野生甘草總黃酮對比，＊＊P<0.01；與栽培甘草總黃酮對比，▲▲P<0.01；與野生甘草總皂苷對比，□P<0.05，□□P<0.01；與栽培甘草總皂苷對比，■■P<0.01。

2.2各有效菌株與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌的MIC

見表4。

表4　對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌的MIC(48h)測定表　　g·mL-1

續(xù)表4

注：“—”為無抑菌作用。

3討論

實驗中，從野生與栽培甘草中共分離出140株內(nèi)生菌，由于菌株較多，無法全部發(fā)酵與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷進行體外抑菌活性對比研究；因此，先將140株內(nèi)生菌經(jīng)體外抑菌篩選有效菌種，體外抑菌實驗可簡單、快捷篩選出有效抑菌受試藥物，能夠準確、定量地得出供試品的抑菌強度，且不受內(nèi)環(huán)境等多種因素的干擾，重現(xiàn)性好。篩選出20株有效菌種與甘草水煎液、總黃酮、總皂苷分別進行二次體外抑菌實驗。結果表明：18株內(nèi)生菌對金黃色葡萄球菌均有抑菌活性(P<0.01)，有效菌株中JTZB059、JTYB029抑菌活性相對較強，最小抑菌濃度分別為0.125 0，0.062 5 g/mL。3株(JTZB005，043；JTZF014)對肺炎鏈球菌有抑菌活性(P<0.01)；與栽培甘草水煎液、總皂苷對比，JTZB005抑菌活性較強(P<0.01)，最小抑菌濃度0.062 5 g/mL。3株(JTYB012；JTZB018，020)對大腸桿菌均有抑菌活性(P<0.01)，與栽培甘草水煎液、總黃酮對比，JTZB018抑菌活性較強(P<0.01)，最小抑菌濃0.125 0 g/mL。結果提示：20株甘草內(nèi)生菌對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌均有不同程度抑菌活性，在一定抑菌范圍內(nèi)甘草內(nèi)生菌可替代甘草水煎液或甘草總黃酮、甘草總皂苷。

4參考文獻

[1]曾超珍,劉志祥,吳耀輝,等.超聲波提取甘草黃酮及其抑菌活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(10):2402-2403.

[2]崔永明,余龍江,敖明章,等.甘草酸的提取及其抑菌活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2006,3(18):428-431.

[3]趙鐳,師清芝,唐星.甘草中甘草酸和甘草苷的提取純化工藝研究[J].中藥工藝與制劑,2009,20(6):426-428.

[4]吳桐,白長勝,譚佳音,等.烏拉爾甘草內(nèi)生真菌的分離及其抑菌活性研究[J].中國食品學報,2014,2(14)：155-160.

[5]劉霞,黨峰峰,賀曉龍,等.陜北野生甘草內(nèi)生菌的分離及抑菌活性篩選[J].西北植物學報,2010,30(10):2110-2115.

[6]鄧毅,王艷,丁仁偉,等.甘肅甘草內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物抑菌活性初步研究[J].中藥材,2013,36(2):181-184.

[7]李儀奎,金若敏,王欽茂,等.中藥藥理實驗方法學[M].2版.上海:上?？萍汲霭嫔?2006:755.

[8]余瓊,白志川,孟德勝,等.23種中草藥提取物對肺炎鏈球菌的抗菌作用研究[J].中國藥房,2011,22(23):2135-2136.

(編輯陶珠)

文章編號:1001-6910(2016)05-0066-05·藥學研究·

中圖分類號:R284

文獻標志碼:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.05.33

通信作者：鄧毅，教授，dengyi@gszy.edu.cn

* 基金項目：國家自然基金(81360633)

收稿日期：2016-01-03；修回日期：2016-03-14