軟骨損傷修復(fù)中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞載體的選擇

田林 羅榮宇 藍(lán)崇 魏紀(jì)湖 戴子一

【摘 要】 查閱近年來公開發(fā)表的關(guān)于利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其載體治療軟骨損傷的相關(guān)文獻(xiàn)資料，對常用載體的特征進(jìn)行歸納?？偨Y(jié)近階段利用骨髓干細(xì)胞在治療軟骨損傷中各種載體的特點(diǎn)及其選擇。綜述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合載體治療軟骨損傷的研究現(xiàn)狀，重點(diǎn)對臨床常用載體進(jìn)行說明及展望。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種多能干細(xì)胞為軟骨損傷治療提供了新的思路，而單純干細(xì)胞移植難以達(dá)到應(yīng)有的理想效果，臨床中多采取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合載體移植的方法?，F(xiàn)有載體材料眾多，各種材料特性不一、效果不同，如何整合利用各種材料的特點(diǎn)、避免其弊端，亟待解決和深入研究。

【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；載體；軟骨損傷修復(fù)

隨著老齡化的加劇和疾病譜的變化，關(guān)節(jié)軟骨損傷成為臨床骨科常見疾病之一。軟骨組織因無神經(jīng)、無血管的解剖結(jié)構(gòu)特征，缺乏自我修復(fù)和再生能力，損傷愈合困難；再加上缺損軟骨處長期磨損，臨床多演變?yōu)楣顷P(guān)節(jié)炎[1]。目前，臨床治療骨關(guān)節(jié)炎主要采用藥物對癥治療，現(xiàn)有治療手段中無論是關(guān)節(jié)鏡下關(guān)節(jié)腔沖洗、骨髓刺激或自體軟骨塊移植均具有臨床缺陷[2]。

近年來，隨著組織工程的迅速發(fā)展，軟骨損傷的修復(fù)與再生成為可能，并被認(rèn)為是最具潛力的治療方法[3]。在利用組織工程進(jìn)行軟骨修復(fù)時(shí)，種子細(xì)胞、支架材料、生長因子被認(rèn)為是組織工程修復(fù)再生的三大主導(dǎo)因素。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是一種具有多向分化潛能的均質(zhì)性細(xì)胞，經(jīng)特定條件誘導(dǎo)，可分化為多種間充質(zhì)組織細(xì)胞[4]。在體外培養(yǎng)中，BMSCs可以保持穩(wěn)定的多向分化潛能，且體內(nèi)植入反應(yīng)較弱，是一種理想的組織工程種子細(xì)胞[5]。單純運(yùn)用BMSCs療軟骨損傷難以體現(xiàn)其良好的生物學(xué)特性，達(dá)不到預(yù)期療效。究其原因，單純的細(xì)胞難以形成組織，而依賴聯(lián)合支架材料或其復(fù)合物的骨髓干細(xì)胞聯(lián)合體，不僅為細(xì)胞增殖分化提供了場所，還在組織再生中起到重要的引導(dǎo)作用，以達(dá)到控制組織或器官性狀的目的[6-8]。

1 軟骨損傷

關(guān)節(jié)軟骨是一種無血管、少細(xì)胞的透明結(jié)締組織，具有提供結(jié)構(gòu)支撐和緩沖承重的作用，分為表層、中層、深層和鈣化層。軟骨組織的表層細(xì)胞呈扁平狀，具有分泌表層蛋白多糖的作用；而呈垂直柱狀排列的中層軟骨細(xì)胞則具有表達(dá)二型膠原（Type n Collagen）、蛋白聚糖（Aggrecan）和其他蛋白的功能；在軟骨細(xì)胞中數(shù)目最多的深層及鈣化層細(xì)胞表達(dá)十型膠原（Type X collagen ）和堿性磷酸酶（ALP）[8]。

關(guān)節(jié)軟骨受損的原因：①外傷性軟骨受損，如在運(yùn)動(dòng)中膝關(guān)節(jié)軟骨損傷；②創(chuàng)傷后的慢性損傷，如受傷后持續(xù)活動(dòng)造成的勞損；③退行性的關(guān)節(jié)病變，軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一能夠產(chǎn)生豐富細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的細(xì)胞，軟骨組織一旦受損，軟骨細(xì)胞就會(huì)表達(dá)炎癥介質(zhì)、基質(zhì)降解酶和其他非正常蛋白質(zhì)，形成成團(tuán)聚集現(xiàn)象等病理組織學(xué)標(biāo)志[9]。因?yàn)檐浌墙M織的生理特征，所以關(guān)節(jié)軟骨損傷后幾乎無任何修復(fù)能力，組織破壞往往從關(guān)節(jié)表面持續(xù)延展到軟骨深層，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)性病變或骨關(guān)節(jié)炎。

2 BMSCs

BMSCs是一種具有多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞群，主要具有兩大特性：①自我更新潛能。經(jīng)多次傳代仍可保持其原有的生物學(xué)特性，研究顯示，BMSCs傳代38次仍可保持其原有的生物學(xué)特性，其染色體核型和端粒酶活性并不隨著多代培養(yǎng)而有所改變。②定向或多向分化潛能。BMSCs具有分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等潛能[10]。

BMSCs能從胚胎干細(xì)胞中獲得，也能夠從成體組織中獲得，如骨髓、脂肪組織、滑膜、胎盤和軟骨膜等。較軟骨細(xì)胞（hACs）、胚胎干細(xì)胞（ESCs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）等其他軟骨損傷修復(fù)的種子材料[6-10]而言，BMSCs被認(rèn)為是軟骨修復(fù)中一種潛在的、運(yùn)用最多的理想種子細(xì)胞。BMSCs修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的途徑受到軟骨損傷程度、載體等多方面因素的綜合影響，其中載體類型是主要因素，并按這一因素將利用BMSCs修復(fù)軟骨損傷的途徑分為：①細(xì)胞—載體聯(lián)合植入。將篩選的BMSCs在體外培養(yǎng)后與載體復(fù)合后植入軟骨缺損平面。②關(guān)節(jié)軟骨周圍注射。將體外培養(yǎng)的BMSCs重懸于培養(yǎng)基或血清后直接注射入關(guān)節(jié)腔[11]。

BMSCs在軟骨修復(fù)應(yīng)用中的研究仍處于初期階段。造成BMSCs在臨床推進(jìn)速度緩慢的原因有：①年長患者的種子細(xì)胞質(zhì)量差，為保證移植成功率、避免排異反應(yīng)，多采用自體種子細(xì)胞移植；但骨關(guān)節(jié)炎患者多為老年人，隨著患者年齡增長，細(xì)胞增殖潛能受限，而如果選擇異體干細(xì)胞移植，則要承擔(dān)免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。②在種子細(xì)胞獲取過程中，為了獲得一定數(shù)量的細(xì)胞，需要延長細(xì)胞培養(yǎng)周期，而長時(shí)間的體外培養(yǎng)，可能改變BMSCs表型。

③新生軟骨的力學(xué)強(qiáng)度較正常軟骨弱[12]。

3 載體材料

軟骨損傷修復(fù)再生的載體材料應(yīng)具有促進(jìn)BMSCs誘導(dǎo)成軟骨和為細(xì)胞生長提供培養(yǎng)基的能力，具體篩選要求為：①為保證種子細(xì)胞獲取營養(yǎng)以進(jìn)行代謝，載體需具備通暢的孔隙通道；而影響通暢度的主要因素為孔隙大小及孔隙率。②與缺損區(qū)周圍組織匹配和相容，并有良好的生物學(xué)強(qiáng)度以提供穩(wěn)定的機(jī)械支撐，同時(shí)有利于細(xì)胞與缺損組織的黏附。③載體降解產(chǎn)物對機(jī)體無害，并盡量不產(chǎn)生排異反應(yīng)。④便于消毒和消毒后保存。⑤為保持組織穩(wěn)定度，載體降解率與缺損區(qū)組織再生率應(yīng)保持動(dòng)態(tài)平衡[13]。根據(jù)以上篩選條件，現(xiàn)有的可利用BMSCs載體包括自體骨、異體骨、有機(jī)材料、生物陶瓷、納米材料、生物材料等。

3.1 軟骨基質(zhì) 來源于軟骨基質(zhì)的非細(xì)胞軟骨片（ACSs）作為BMSCs的接種載體，構(gòu)成BMSC-ACS復(fù)合體。Xue等[14]通過相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)體外軟骨基質(zhì)培養(yǎng)后的BMSCs，在動(dòng)物體內(nèi)4周后，誘導(dǎo)性的BMSC-ACS復(fù)合體內(nèi)有軟骨形成，且比對照試驗(yàn)下的聚乙醇酸/聚乳酸（PGA/PLA）-BMSC復(fù)合體形成的軟骨量更多。Yang等[15]證明軟骨來源的細(xì)胞與BMSC構(gòu)成載體具有良好的生物相容性，而良好的相容性是軟骨再生的先決條件。軟骨基質(zhì)不可再生，材料緊缺是其運(yùn)用中的主要限制因素。

3.2 自體骨 因自體骨不存在免疫反應(yīng)且手術(shù)費(fèi)用低，所以在臨床中被廣泛運(yùn)用。自體骨不僅可以發(fā)揮良好的局部支撐作用，還因較佳的相容性使軟骨再生時(shí)間極大縮短。在自體骨-BMSCs復(fù)合體移植手術(shù)中再加入相關(guān)的生長因子，干細(xì)胞可以黏附在松質(zhì)骨內(nèi)，以減少移植過程中干細(xì)胞的損失，具有愈合快、無排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，取得了較好的療效。雖然髂骨、腓骨中上段都是自體骨的取材范圍；但軟骨缺損患者多為老年人，患者多并發(fā)骨質(zhì)疏松，自體骨支撐力差[16]。

3.3 異體骨 異體骨包括同種異體骨及異種異體骨，常用的異體骨以脫鈣骨基質(zhì)為代表，并結(jié)合三維多孔結(jié)構(gòu)使BMSCs容易增殖和分化，同時(shí)有利于營養(yǎng)成分滲透，取得了較好的臨床效果。雖然臨床一般經(jīng)過脫鈣、脫細(xì)胞、脫蛋白等不同方法降低抗原性，以改善組織相容性；但抗原性仍是其臨床運(yùn)用的主要弊端，亟待進(jìn)一步解決。

3.4 天然纖維凝膠 天然生物材料作為支架材料在骨與軟骨組織工程中被廣泛運(yùn)用，其種類繁多，應(yīng)用廣泛，天然材料具有無毒、組織相容性好、降解產(chǎn)物易完全吸收等優(yōu)勢。利用纖維凝膠的可塑性，可模擬機(jī)體的狀態(tài)，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的空間環(huán)境，供細(xì)胞在其中附著、分化、增殖、并進(jìn)行物質(zhì)交換和生長代謝，誘導(dǎo)軟骨組織形成，進(jìn)行軟骨缺損的修復(fù)。Jung等[17]發(fā)現(xiàn)天然纖維凝膠可促進(jìn)BMSCs成軟骨分化并能維持軟骨細(xì)胞的表型，為軟骨組織的穩(wěn)定和再生提供可能，為BMSCs在軟骨組織工程上的運(yùn)用奠定基礎(chǔ)。

3.5 人工合成材料

3.5.1 聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）支架 隨著組織工程的發(fā)展，以聚乳酸、聚乙醇酸等為代表的新型人工材料被大量研制出來。以聚乳酸為例，作為聚乳酸3種異構(gòu)體之一的聚左旋乳酸具有良好的組織相容性和可吸收性，大量研究證實(shí)BMSCs復(fù)合聚乳酸、聚乙醇酸聚合物是較理想的移植替代物。目前，在軟骨修復(fù)中最常用的人工合成材料為聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）支架。PLGA具有良好的組織相容性、無毒性、易塑性強(qiáng)和降解速度可控性等優(yōu)點(diǎn)，合適的強(qiáng)度足以支撐再生的軟骨，良好的可塑性使其表面能做成大小合適的孔徑，這些孔徑是細(xì)胞增殖培養(yǎng)的良好三維空間[14]。

BMSCs聯(lián)合PLGA支架修復(fù)軟骨缺損中發(fā)現(xiàn)BMSCs會(huì)表達(dá)肥大軟骨的相關(guān)基因，且因PLGA降解而產(chǎn)生的酸性環(huán)境可能對BMSCs產(chǎn)生副作用，從而影響軟骨再生修復(fù)。

3.5.2 殼聚糖-β-甘油磷酸鈉凝膠（Chitosan-disodium β glycerol phosphate，C/GP）支架 近來也有把C/GP作為載體的研究報(bào)告，Li等[18]通過相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)：①在C/GP-BMSC聯(lián)合體外培養(yǎng)的BMSCs呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，在成骨和成軟骨誘導(dǎo)條件下可分別向成骨樣細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化；②BMSCs在C/GP凝膠內(nèi)成活率達(dá)到90%以上；③體外培養(yǎng)21 d后，成軟骨誘導(dǎo)的BMSCs在C/GP凝膠內(nèi)產(chǎn)生大量軟骨基質(zhì)，故認(rèn)為C/GP凝膠與BMSCs顯示了良好的細(xì)胞相容性，有利于BMSCs在其內(nèi)生長、增殖和成軟骨分化，有望作為軟骨組織工程的細(xì)胞載體得以推廣。

3.5.3 生物陶瓷類 生物陶瓷類人工材料以碳酸鈣、磷酸鈣、硫酸鈣及其各自的衍生物為代表，因生物陶瓷類材料具有較好的骨傳導(dǎo)能力及骨誘導(dǎo)活性，被廣泛運(yùn)用為骨替代材料，其中磷酸鈣及其衍生物是BMSCs領(lǐng)域運(yùn)用最多的載體。磷酸鈣的成分與骨基質(zhì)的無機(jī)成分相似，與骨結(jié)合好。新型磷酸鈣骨水泥，因其可降解性、成骨性及細(xì)胞相容性更佳，且可注射并具有緩釋功能，近年被組織工程領(lǐng)域較多采用。章樂成等[13]研究證明，磷酸鈣骨水泥的三維多孔結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出良好的細(xì)胞黏附與增殖性能，具有促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的作用，是優(yōu)良的骨組織工程學(xué)的支架材料[19]。但Ng等[20]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雖然新型磷酸鈣骨水泥作為一種可注射支架材料，其最大缺陷為生物力學(xué)強(qiáng)度的不足，這是今后組織工程學(xué)需要解決的新方向。

3.5.4 納米級材料 納米技術(shù)的應(yīng)用為醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展提供了新的動(dòng)力，用納米技術(shù)將相關(guān)醫(yī)學(xué)材料制備成納米級材料，其改變的理化性質(zhì)也將帶來新的醫(yī)學(xué)效果。

由于骨組織本身是一種納米復(fù)合結(jié)構(gòu)，其原理是在微米結(jié)構(gòu)上模仿骨組織的結(jié)構(gòu)及活性，在提高BMSCs及其載體相容性的基礎(chǔ)上，更好地誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞的成骨作用[21]。納米材料因其獨(dú)特的組織結(jié)構(gòu)、大小及形狀，可以更好地與骨細(xì)胞及組織產(chǎn)生作用。Zandi等[22]研究表明，納米羥基磷灰石具有較好的生物相容性、較高的生物活性及足夠的機(jī)械支撐力量，適合BMSCs黏附、生長、增殖和分化。然而，納米材料作為BMSCs載體，依然需要更多臨床及實(shí)驗(yàn)研究深入探索其細(xì)胞毒性、生物相容性及生物降解能力。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，BMSCs作為一種具有巨大潛力的軟骨修復(fù)再生的理想種子細(xì)胞，在臨床應(yīng)用中必須依托合適的載體，才能保證良好的軟骨修復(fù)效果。在利用BMSCs治療軟骨損傷中，目前，可利用的BMSCs載體種類繁多，但無論固體材料、可注射材料還是經(jīng)納米技術(shù)改造后的載體材料均有各自缺陷。固體材料擁有足夠的支撐力，卻不能有效解決干細(xì)胞丟失的問題；可注射材料的可塑性強(qiáng)、吸附力好，但支撐力不足、力學(xué)性能偏低。目前比較前沿的是利用磁力引導(dǎo)對納米級載體材料進(jìn)行定向部署的靶向技術(shù)，該技術(shù)能很好地解決傳統(tǒng)材料的缺陷，一旦有突破性進(jìn)展，不失為軟骨損傷修復(fù)的新途徑。

BMSCs及其載體在軟骨損傷修復(fù)中的研究與臨床應(yīng)用，還應(yīng)結(jié)合其載體選擇，在BMSCs的來源、分離、培養(yǎng)和移植方法等方面進(jìn)一步研究。同時(shí)還應(yīng)充分考慮患者臨床條件及軟骨損傷的類型、位置、面積大??；明確BMSCs及其載體在軟骨損傷修復(fù)中的臨床應(yīng)用和療效評估標(biāo)準(zhǔn)，使BMSCs及其載體修復(fù)軟骨損傷更加系統(tǒng)化、科學(xué)化，最終獲得理想的治療效果和應(yīng)用前景。

5 參考文獻(xiàn)

[1] Lubis AMLubis VK.Adult bone marrow stem cells in cartilage therapy[J].Acta Med Indones，2012，44（1）：62-68.

[2] Wang W，Li B，Yang J，et al.The restoration of full-thickness cartilage defects with BMSCs and TGF-beta1loaded PLGA/fibrin gel constructs[J].Biomaterials，2010，31（34）：8964-8973.

[3] 陳琦，廖文波.滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的應(yīng)用與進(jìn)展[J].中國組織工程研究，2015，19（36）：5886-5890.

[4] 方楚玲，田京.間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化相關(guān)研究進(jìn)展[J].國際骨科學(xué)雜志，2014，35（1）：47-49.

[5] Igarashi T，Iwasaki N，Kawamura D，et al.Repair of articular cartilage defects with a novel injectable in situ forming material in a canine model[J].J Biomed Mater Res A，2012，100（1）：180-187.

[6] 袁小龍，畢聲榮，余方圓.滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療關(guān)節(jié)軟骨損傷[J].中國組織工程研究，2015，19（36）：5893-5896.

[7] 陳松，符培亮，吳海山.滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞在軟骨修復(fù)組織工程中的研究進(jìn)展[J].中華關(guān)節(jié)外科雜志（電子版），2013，7（5）：707-709.

[8] 姜洋子.軟骨干/祖細(xì)胞的特征及其促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)再生的研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2014.

[9] Lotz MK，Otsuki S，Grogan SP，et al.Cartilage cell clusters[J].Arthritis Rheum，2010，62（8）：2206-2218.

[10] 毛建水，張慎啟，何穎韜，等.關(guān)節(jié)軟骨損傷干細(xì)胞治療研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2013，21（9）：70-72.

[11] Jiang YZ，Zhang SF，Qi YY，et al.Cell transplantation for articular cartilage defects：principles of past，present，and ftiture practice[J].Cell Transplant，2011，20（5）：593-607.

[12] 劉志強(qiáng)，程紅斌，劉建國，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨損傷中的應(yīng)用[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2012，16（2）：373-375.

[13] 章樂成，尹宗生.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其載體在股骨頭壞死治療中的研究與進(jìn)展[J].中國組織工程研究，2014，18（3）：440-445.

[14] Xue JX，Gong YY，Zhou GD，et al.Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived stem cells induced by acellular cartilage sheets[J].Biomaterials，2012，33（24）：5832-5840.

[15] Yang Q，Peng J，Lu SB，et al.In vitro cartilage tissue engineering with cartilage extracellar matrix-derived porous scaffolds and bone marrow mesenchymal stem cells[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2011，91（17）：1161-1166.

[16] Li L，Clevers H.Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals[J].Science，2010，327（5965）：542-545.

[17] Jung Y，Kim SH，Kim YH，et al.The effects of dynamic and threedimensional environments on chondrogenic differentiation of bone marrow stromal cells[J].Biomed，2009，4（5）：55009.

[18] Li Z，Yang L，Dai G，et al.Chitosan-based gels as bioactive carriers for bone marrow mesenchymal stem cells：A cytocompatibility study[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2008，12（45）：8953-8957.

[19] Lee GS，Park JH，Shin US，et al.Direct deposited porous scaffolds of calcium phosphate cement with alginate for drug delivery and bone tissue engineering[J].Acta Biomater，2011，7（8）：3178-3186.

[20] Ng VY，Granger JF，Ellis TJ.Calcium phosphate cement to prevent collapse in avascular necrosis of the femoral head[J].Med Hypotheses，2009，74（4）：725-726.

[21] Justesen J，Stenderup K，Eriksen EF，et al.Maintenance of osteoblastic and adipocytic differentiation potential with age and osteoporosis in human marrow stromal cell cultures[J].Calcif Tissue Int，2002，71（1）：36-44.

[22] Zandi M，Mirzadeh H，Mayer C，et al.Biocompatibility evaluation of nano-rod hydroxyapatite/gelatin coated with nano-HAp as a novel scaffold using mesenchymal stem cells[J].J Biomed Mater Res A，2010，92（4）：1244-1255.

收稿日期：2015-11-07；修回日期：2016-02-25