繼代次數(shù)對吉粳88愈傷組織生理生化指標及細胞形態(tài)的影響

都曉龍　孫春玉　張美萍　王義

摘要[目的]研究繼代次數(shù)對吉粳88愈傷組織生理生化指標及細胞形態(tài)的影響。[方法]以繼代次數(shù)為單因素變量，測定吉粳88愈傷組織中可溶性蛋白含量、過氧化物酶活性、可溶性糖含量以及丙二醛含量，并通過臨時裝片觀察細胞形態(tài)。[結(jié)果]隨著繼代次數(shù)的增加，愈傷組織的分化率和再生率呈下降趨勢；可溶性蛋白含量基本保持在2.92 mg/gFW左右，無明顯變化。MDA含量呈先增加后減少的趨勢。POD活性和可溶性糖含量與愈傷分化率極顯著相關(guān)。細胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，隨著繼代次數(shù)增加愈傷組織逐漸由胚性愈傷轉(zhuǎn)化為非胚性愈傷。[結(jié)論]在懸浮培養(yǎng)體系建立時，以D4、D5、D6 3代為宜，為吉粳88再生體系的建立和優(yōu)化指明了方向。

關(guān)鍵詞 吉粳88；繼代次數(shù)；生理生化指標；細胞形態(tài)；再生

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）05-155-04

Abstract[Objective]The aim was to study effects of transgenerational times on Jijing88 callus physiobiochemistry indexes and the cell morphology.[Method]With transgenerational times as single factor variables， the callus of Jijing88 was researched through observing cell morphology with four physiobiochemistry indexes including peroxidase （POD） activity， soluble protein content， soluble sugar content and malondialdehyde （MDA） content.[Result]With the increase of transgenerational times， the results showed a sharp decline in callus differentiation rate and regenerative rate； soluble protein level maintained at about 2.92 mg/gFW. The malondialdehyde （MDA） content showed a trend of rise first then fall. Peroxidase （pod） activity and soluble sugar content was significantly correlated with callus differentiation rate. Cell morphology was observed that cells change from embryonic callus into non embryonic callus with transgenerational times increase gradually.[Conclusion]When the suspension culture system is established， three generations of D4， D5， D6 are appropriate， which will provide the direction for establishment and optimization of Jijing88 regeneration system.

Key words Jijing88； Transgenerational times； Physiobiochemistry indexes； Cell morphology； Regeneration

吉粳88為吉林省廣泛栽培品種[1]，其米質(zhì)優(yōu)良，外觀品質(zhì)好且食味佳，具有莖稈粗壯、抗倒伏、根系發(fā)達和耐冷性強等優(yōu)良農(nóng)藝性狀。優(yōu)化該品種的再生體系，明確其再生機制，對于優(yōu)化種質(zhì)資源、開發(fā)新型高產(chǎn)超級稻具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，隨著繼代次數(shù)的增加大多數(shù)植物愈傷組織的分化率呈下降趨勢[2]，在水稻繼代過程中該現(xiàn)象尤其明顯。很多植物材料隨著繼代次數(shù)的增加繁殖能力逐漸衰退，增殖系數(shù)和生根率下降，如梨 S系矮化砧[3]、 葉毛棗[4]、 杉木[5]、 棉花[6]和球根海棠[7]等。崔德才等[8]研究表明，繼代20次的培養(yǎng)材料（含愈傷組織），其再生能力下降70%～80%。不同植株之間保持分化潛力的時間不同，且差異很大。王慧中等[9]研究表明，秈稻愈傷組織的分化率在5次繼代后由初始的63.4%下降至18.6%。

在某些特定條件下，愈傷組織需要保持長期繼代且保證愈傷組織胚性不喪失。迄今為止雖然已有大量研究表明繼代與再生之間存在某些關(guān)聯(lián)，但并未完全明確其影響機制。這對長期繼代保持愈傷組織胚性研究以及優(yōu)化再生體系的方向形成了阻礙。筆者以繼代次數(shù)為單因素變量，分析了繼代次數(shù)對吉粳88愈傷組織生理生化指標及細胞形態(tài)的影響，并弄清各個生理生化指標與水稻再生之間的關(guān)系，探尋改善水稻再生體系的方向和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為吉粳88水稻種子在N6培養(yǎng)基、2，4D 2 mg/L、26 ℃暗培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)的愈傷組織，以14 d為一個周期進行繼代，誘導(dǎo)代標記為D1，繼代一次標記為D2，依次類推。

1.2 方法

1.2.1 生理生化指標測定。

①可溶性蛋白。用牛血清蛋白配成含蛋白質(zhì)0.1 mg/mL的標準蛋白溶液，用以測定標準曲線。取各代愈傷組織樣品0.5 g，采用考馬斯亮藍G250染色法，在595 nm下比色。重復(fù)3次，取平均值[10]。

②過氧化物酶（POD）活性。稱取5 g各代愈傷組織樣品，采用愈創(chuàng)木酚法在470 nm處比色測定POD活性。重復(fù)3次，取平均值[11-12]。

③可溶性糖含量。配制含葡萄糖0.1 mg/mL的標準葡萄糖溶液，用以測定標準曲線。取0.3 g各代愈傷組織樣品，采用蒽酮法，在620 nm下測定吸光度。重復(fù)3次，取平均值[9-10]。

④丙二醛（MDA）含量。稱取各代愈傷組織樣品1 g，采用硫代巴比妥酸（TBA）法，測定532、600、450 nm處的吸光度。重復(fù)3次，取平均值[13-14]。

1.2.2 細胞形態(tài)觀察。

取各代愈傷組織一小塊，在載玻片上搗碎，固綠染色制成臨時裝片觀察細胞結(jié)構(gòu)[15]。

1.2.3 各代愈傷組織再生統(tǒng)計。

以MS為基本培養(yǎng)基，激素濃度為1 mg/L 6BA、1 mg/L KT和0.2 mg/L NAA。采用濾紙干燥法對愈傷組織進行干燥處理48 h，在22 ℃連續(xù)光照條件下培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計分化率和再生率，重復(fù)3次，取平均值[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 繼代次數(shù)對愈傷組織再生能力的影響 由圖1和2可知，隨著水稻愈傷組織繼代次數(shù)的增加，愈傷組織的分化率和再生率均呈明顯下降趨勢。分化率由D1代的85.3%下降到D10代的2.6%；再生率D1代最大（為22.30%），隨著繼代次數(shù)的增加，D9代再生率最低（為1.25%）。由此可知，未繼代前（D1代）的水稻愈傷組織為最適再生水稻植株材料。

2.2 繼代次數(shù)對愈傷組織可溶性蛋白含量的影響

由圖3可知，繼代次數(shù)對水稻愈傷組織可溶性蛋白含量幾乎無影響，其含量保持在2.92 mg/gFW左右。但未繼代前愈傷組織（D1）可溶性蛋白含量高于其他代，結(jié)合隨著繼代次數(shù)增加胚性下降的現(xiàn)象，推測可能有分化再生相關(guān)關(guān)鍵基因表達下調(diào)的現(xiàn)象發(fā)生。

2.3 繼代次數(shù)對愈傷組織POD活性的影響

由圖4可知，POD活性隨著繼代次數(shù)增加呈先增加后減少的趨勢，D1代POD活性最低為166.96 U/（g·min），D5代POD活性最高為173.94 U/（g·min）。由此可知，愈傷組織隨著繼代次數(shù)增加有逐漸老化的趨勢。

2.4 繼代次數(shù)對愈傷組織可溶性糖含量的影響

由圖5可知，隨著水稻愈傷組織繼代次數(shù)的增加，愈傷組織中可溶性糖含量呈減少趨勢，由D1代10.24 mg/gFW減少到D10代5.97 mg/gFW，愈傷組織中可溶性糖含量減少41.7%。與隨著繼代次數(shù)增加水稻愈傷組織胚性降低的現(xiàn)象呈正相關(guān)。說明愈傷組織中可溶性糖含量是影響愈傷組織分化再生的關(guān)鍵因素。

2.5 繼代次數(shù)對愈傷組織MDA含量的影響

由圖6可知，隨著水稻愈傷組織繼代次數(shù)的增加，MDA含量呈先增加后減少的趨勢，D1代最低為2.42 nmol/gFW，表示此時組織細胞老化程度最低。D4代愈傷組織MDA含量最高為4.24 nmol/gFW，表明此時膜損傷最為嚴重、老化程度最高。

2.6 繼代次數(shù)對愈傷組織細胞形態(tài)的影響

由圖7可知，隨著繼代次數(shù)的增加，愈傷組織細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。D1代愈傷組織細胞結(jié)構(gòu)緊密，細胞較小，大多為圓形，內(nèi)容物豐富，液泡較小，排列較整齊。D3代細胞結(jié)構(gòu)開始變得疏松，較易形成小的細胞團。D5代細胞組織變得極為疏松，較易形成大量單細胞懸浮液和小細胞團，細胞開始發(fā)生變形，出現(xiàn)畸形細胞。D7代愈傷組織出現(xiàn)大量畸形細胞，胚性幾乎喪失。D10代細胞幾乎為畸形細胞和巨大細胞。由此可知，隨著繼代次數(shù)的增加，愈傷組織逐漸變得結(jié)構(gòu)疏松，細胞相對巨大，內(nèi)含一大液泡，幾乎無細胞器，畸形細胞明顯增加。這表明愈傷組織中的細胞逐漸由胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化為非胚性愈傷組織。

2.7 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析表明，POD活性與愈傷組織分化率呈負相關(guān)關(guān)系，達0.005極顯著水平。可溶性糖含量與分化率呈正相關(guān)，達0.001極顯著水平。說明這2個因素在水稻愈傷分化過程中起著至關(guān)重要的作用，在再生體系建立過程中優(yōu)化這2個條件對于建立高效的愈傷組織再生體系可以得到較好的預(yù)期效果。

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，愈傷組織中可溶性蛋白含量對植物體胚發(fā)生

途徑具有重要影響[17-20]，胚性愈傷組織的分化和發(fā)育是一個極其復(fù)雜的過程，它受到基因的調(diào)控，是基因順序表達的結(jié)果[21]。但在該試驗中，繼代次數(shù)對愈傷組織中可溶性蛋白含量幾乎無影響，基本保持在2.92 mg/gFW左右，但未繼代前愈傷組織可溶性蛋白含量明顯高于其他代，表明隨著繼代次數(shù)增加，愈傷組織中一些基因表達下調(diào)。而其蛋白含量相似可能是由于同處于未分化狀態(tài)細胞內(nèi)基因表達差異不明顯。

該研究表明水稻愈傷組織中POD活性隨著繼代次數(shù)增加呈先增加后減少的趨勢，表明在該過程中，組織內(nèi)部過氧化物積累增加，細胞老化程度相應(yīng)上升。

該試驗中，可溶性糖含量隨著繼代次數(shù)增加持續(xù)下降，與隨著繼代次數(shù)增加胚性逐漸喪失現(xiàn)象呈正相關(guān)且達極顯著水平?？梢耘袛嗫扇苄蕴鞘撬痉只偕年P(guān)鍵因素之一。已有研究證實，以麥芽糖和乳糖為碳源，培養(yǎng)35個月的粳稻愈傷組織綠苗率僅達2%～4%，而蔗糖對照則無再生能力[22]。水稻胚乳中的淀粉在萌發(fā)過程中主要水解產(chǎn)物為麥芽糖，在生長過程中主要利用的是蔗糖，由于麥芽糖的消耗和蔗糖的大量加入，導(dǎo)致愈傷組織內(nèi)部可溶性糖組成發(fā)生改變，這也可能是水稻愈傷組織形成初期分化再生率較高，而后期逐漸失去胚性的原因。

該研究表明，隨著繼代次數(shù)的增加，愈傷組織細胞中MDA含量呈先增加后減少的趨勢，表明愈傷組織細胞在繼代過程中發(fā)生了一定程度的老化和膜脂結(jié)構(gòu)的損壞。在其他試驗過程中應(yīng)盡量挑選MDA含量較低的愈傷組織，提高細胞活性和抗逆性。

臨時裝片是組織學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究中觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的試驗方法之一，該試驗中使用水裝片法觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，利用固綠染液對吉粳88水裝片進行染色后，在顯微鏡下觀察。結(jié)果表明，隨著繼代次數(shù)的增加，愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。其表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)愈發(fā)松散，內(nèi)容物變少，畸形細胞大量增加，液泡化逐漸加劇。這證明隨著培養(yǎng)時間的增加，愈傷組織變異加劇，逐漸由胚性愈傷向非胚性愈傷轉(zhuǎn)化。這也是愈傷組織胚性喪失的表現(xiàn)。

該研究從生理生化及細胞形態(tài)兩方面研究了繼代次數(shù)對吉粳88愈傷組織的影響，探究影響水稻愈傷組織分化再生的因素以及篩選適合繼代次數(shù)的愈傷組織。表明可溶性糖和POD活性是影響水稻體胚發(fā)生途徑的關(guān)鍵因素，但無法確定影響該途徑的可溶性糖類型，以及控制調(diào)節(jié)該過程的基因，這些問題有待進一步研究。

參考文獻

[1]張三元，張俊國，趙勁松，等.水稻吉粳88號品種簡介[J].吉林農(nóng)業(yè)，2005（5）：26-28.

[2]LAI K L，LIU L F.International congress of plant tissue and cell culture[C].Univ Minnesota Minneapolis，Minn USA Abstrcts，1986：186.

[3]及華，張海新，趙玉芬，等.梨S系矮化砧組培苗增殖系數(shù)和質(zhì)量的影響因子[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，8（2）：40-44.

[4]續(xù)九如，李春立，孫建設(shè).毛葉棗組培快繁技術(shù)研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，25（3）：28-32.

[5]蘇秀城.杉木無性系不同繼代代數(shù)組培苗差異研究[J].福建林學(xué)院學(xué)報，2000，20（4）：353-356.

[6]薛美鳳，郭余龍，李名揚，等.長期繼代對棉花胚性愈傷組織體胚發(fā)生能力及再生植株變異的影響[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，15（4）：19-21.

[7]劉福平，林清洪，章寧.球根海棠繼代愈傷組織分化潛力喪失研究（簡報）[J].亞熱帶植物科學(xué)，2003，32（4）：64.

[8]崔德才，徐培文.植物組織培養(yǎng)與工廠化育苗[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：71.

[9]王慧中，周曉云，趙培潔，等.影響秈稻愈傷組織分化頻率的幾個因素[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000（3）：240-242.

[10]張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，1997.

[11]MALIK V B T，AHLUWALIA P.Studies on effect of monosodium glutamate（MSG）on various fractions of lipids and certain carbohydrate met abolic enzymes in liver and blood of adult male mice[J].Toxicology letters，1994，74（1）：69-77.

[12]岳鵬程.過用抗菌藥物與中醫(yī)傷津傷陽現(xiàn)象[J].中國民族民間醫(yī)藥，2009，18（9）：26.

[13]李合生.現(xiàn)代植物生理學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2000.

[14]李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2000：232.

[15]趙熒，唐軍民.形態(tài)學(xué)實驗技術(shù)[M].北京：大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2008：9-114.

[16]李楠，柳青，蔣世翠，等.超級稻吉粳88再生體系的建立[J].作物雜志，2010（2）：71-75.

[17]李茜，張存旭，秦萍.白皮松胚性和非胚性愈傷組織生理生化特性研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，36（8）：151-160.

[18]崔凱榮，王曉哲，陳雄，等.小麥體細胞胚發(fā)生中DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成動態(tài)[J].核農(nóng)學(xué)報，1997，11（4）：209-214.

[19]楊和平，程井辰，周吉源，等.石刁柏體細胞胚胎發(fā)生過程中蛋白質(zhì)及同工酶變化的研究[J].實驗生物學(xué)報，1992，25（1）：16-22.

[20]FUJIMIRA T，KOMMIE A，MATSIOMO H.Aspects of DNA，RNA and protein synthesis during somatic embryogenesis in the carrot cell suspension culture[J].Plant Physiol，1980，49：255-260.

[21]楊和平，程井辰，周吉源，等.石刁柏體細胞胚胎發(fā)生過程中蛋白質(zhì)及同工酶變化的研究[J].實驗生物學(xué)報，1992，25（1）：16-22.

[22]ASANO Y，ITO Y，OHARA M，et al.Improved regeneration response of creeping bentgrass and japonica rice by maltose and lactose[J].Plant cell，tissue and organ culture，1994，39（1）：101-103.