GMFB在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ARPE19細(xì)胞中的表達(dá)及意義

買合木提·阿吾提， 練春頻， 歐慶健， 姜曉曼， 徐國彤， 呂立夏

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，上海 200092； 2. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞研究中心，上海 200092)

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·基礎(chǔ)研究·

GMFB在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ARPE19細(xì)胞中的表達(dá)及意義

買合木提·阿吾提1，2， 練春頻1，2， 歐慶健1，2， 姜曉曼1，2， 徐國彤1，2， 呂立夏1，2

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，上海 200092； 2. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞研究中心，上海 200092)

目的 探討膠質(zhì)細(xì)胞成熟因子beta(GMFB)在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ARPE19細(xì)胞中的表達(dá)及意義。方法 用0、0.25、0.5、1、2mmol乙二醛處理ARPE19細(xì)胞24h，其中對(duì)照組用0mmol/L乙二醛處理，實(shí)驗(yàn)組以0.25～2mmol/L 乙二醛處理，用Western印跡法檢測(cè)GMFB的表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組用1μg/ml GMFB處理ARPE19細(xì)胞24h，對(duì)照組不做處理，進(jìn)行RNAseq，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組基因表達(dá)的差異，選取其中表達(dá)差異大于1.5倍且P<0.05的基因作為差異表達(dá)的基因，對(duì)其進(jìn)行GO及KEGG富集分析。結(jié)果 經(jīng)乙二醛處理的各組ARPE19細(xì)胞GMFB表達(dá)上調(diào)，以0.5mmol/L處理組的GMFB上調(diào)最為顯著。對(duì)GMFB處理的ARPE19細(xì)胞進(jìn)行全基因表達(dá)譜檢測(cè)，結(jié)果顯示，在被檢測(cè)的19966個(gè)基因中，實(shí)驗(yàn)組和正常組間有顯著差異表達(dá)(改變1.5倍)的基因有583個(gè)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)顯著上調(diào)的有265個(gè)，下調(diào)的有318個(gè)。GO分析表明，GMFB與細(xì)胞代謝、細(xì)胞催化等生物過程相關(guān)。KEGG分析顯示，GMFB與細(xì)胞代謝通路、癌癥通路、Wnt信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等多條信號(hào)通路密切相關(guān)。炎癥基因CCL26、CXCL8和NF-κB1表達(dá)升高，提示GMFB與炎癥相關(guān)。結(jié)論 GMFB在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ARPE19細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，GMFB可能影響細(xì)胞間連接，參與Wnt信號(hào)通路、腫瘤相關(guān)信號(hào)通路和趨化因子信號(hào)通路等。

氧化應(yīng)激； 膠質(zhì)細(xì)胞成熟因子beta； 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration， AMD)是一種嚴(yán)重?fù)p害老年人視力的進(jìn)行性疾病，病理原發(fā)部位是視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium， RPE)細(xì)胞[1]。AMD的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，但其發(fā)展與氧化應(yīng)激及其和誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老有關(guān)[2]。神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子-beta(glia maturation factor beta， GMFB)是從腦組織提取得到的一種酸性蛋白質(zhì)，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星型膠質(zhì)細(xì)胞和一些神經(jīng)元表達(dá)[3-4]。在星型膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)GMFB能引起SOD活性增高，引發(fā)氧化應(yīng)激[5]，而GMFB敲除小鼠的星型膠質(zhì)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力增高、炎癥因子釋放減少[6]。哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜是特化的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，目前尚未見GMFB對(duì)視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞影響的相關(guān)報(bào)道。乙二醛促進(jìn)末端糖基化產(chǎn)物的產(chǎn)生引起活性氧增多、蛋白質(zhì)羰基化、線粒體膜電位改變因而產(chǎn)生氧化應(yīng)激[7-8]。本研究采用乙二醛處理的ARPE19細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)其在氧化應(yīng)激條件下GMFB的表達(dá)，并采用GMFB處理ARPE19細(xì)胞后進(jìn)行RNAseq檢測(cè)，對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO、KEGG分析，旨在了解GMFB在RPE氧化應(yīng)激下RPE細(xì)胞中的功能，為RPE細(xì)胞病變引起AMD提供線索。

1 材料與方法

1.1 試劑及材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；抗GMFB抗體購自Proteintech公司；羊抗兔-HRP、RIPA、PMSF購自Beyotime公司；TEMED、SDS、低溫離心機(jī)購自Sigma公司；基因芯片由華大基因測(cè)序；激光共聚焦顯微鏡購自Nikon公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自Bio-Red公司；人GMFB蛋白購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)： 13244-HNAE-100)。Lipo-FiterTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自漢恒生物科技(上海)有限公司。GMFB siRNA(scramble)由百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成。上游引物： 5′-GCCGAAGAUUUAGUGGAAAdTdT-3′，下游引物： 5′-UUUCCACUAAAUCUUCGGCd-TdT-3′。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

ARPE19細(xì)胞在含10%牛胎血清及1%青霉素- 鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。2～3d傳代1次。0、0.25、0.5、1、2mmol/L 的乙二醛處理細(xì)胞24h后收樣，其中對(duì)照組為0mmol/L乙二醛處理，實(shí)驗(yàn)組以0.25～ 2mmol/L 乙二醛處理，用Western印跡法及免疫熒光檢測(cè)GMFB表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組用1μg/ml GMFB處理細(xì)胞24h，對(duì)照組未作處理，TRIzol收樣，用基因芯片進(jìn)行分析。

1.3 Western印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

收集的細(xì)胞用RIPA裂解液裂解后，提取蛋白樣品，以20μg/孔上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)印至PVEF膜上。用兔源抗GMFB抗體及抗兔HRP標(biāo)記的二抗檢測(cè)GMFB的表達(dá)。以Actin作為對(duì)照內(nèi)參。

1.4 免疫熒光染色檢測(cè)乙二醛處理細(xì)胞中的GMFB的表達(dá)

細(xì)胞接種于預(yù)置在24孔板培養(yǎng)皿中的玻片上，待細(xì)胞貼壁達(dá)到70%～80%融合后，取出玻片。經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.1% TritonX-100透膜后，用抗人GMFB以及相應(yīng)種屬來源的CY3標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育，用DAPI染細(xì)胞核，DAKO封片于載玻片上，共聚焦顯微鏡下觀察。

1.5 GMFB siRNA轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1d，將細(xì)胞置于6cm細(xì)胞培養(yǎng)板上，第2天待細(xì)胞融合達(dá)到50%～70%備用。GMFB siRNA根據(jù)說明書稀釋并根據(jù)Lipo-FiterTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。scramble siRNA作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染6h后換細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，再0.5mmol/L乙二醛處理24h。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，濃度調(diào)整為5×104～10×104/ml，接種于96孔板中，每孔100μl。GMFB對(duì)ARPE19細(xì)胞活性影響實(shí)驗(yàn)： 加含有1μg/ml GMFB的培養(yǎng)液100μl，置培養(yǎng)箱孵育24h。GMFB siRNA沉默后MTT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。設(shè)4個(gè)組： NC組(正常對(duì)照組)、0.5mmol/L乙二醛(glyoxal)處理組、GMFB siRNA轉(zhuǎn)染后0.5mmol/L乙二醛處理組和scramble siRNA轉(zhuǎn)染后0.5mmol/L乙二醛處理組。細(xì)胞處理完在避光下每孔加入10μl(5mg/ml)的MTT溶液，培養(yǎng)箱孵育4h。吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入100μl DMSO，搖床輕搖10min至結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處吸光度(D490)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置調(diào)零孔、對(duì)照孔、實(shí)驗(yàn)孔，每孔設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.7 RNAseq檢測(cè)差異表達(dá)的基因

RNAseq檢測(cè)的方法： 樣品提取總RNA后經(jīng)過利用Oligo(dT)富集mRNA，mRNA片段化，cDNA合成，末端修復(fù)、加A、加接頭后PCR擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)文庫的制備。文庫進(jìn)行質(zhì)量和產(chǎn)量檢測(cè)，文庫質(zhì)控合格后用Illumina HiSeqTM 2000進(jìn)行測(cè)序，原始數(shù)據(jù)經(jīng)去除雜質(zhì)數(shù)據(jù)等處理后得到的數(shù)據(jù)為有效數(shù)據(jù)。對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 差異表達(dá)基因的基因本體及通路分析

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體(gene ontology， GO)分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG)信號(hào)通路分析。將RNAseq得到的有效數(shù)據(jù)中處理組與對(duì)照組進(jìn)行比較，差異倍數(shù)≥1.5且P<0.05視為差異表達(dá)基因。對(duì)于篩選的基因用GO數(shù)據(jù)庫和注釋、可視化和整合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(DAVID)進(jìn)行GO和KEGG分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 乙二醛處理后ARPE19細(xì)胞中GMFB的表達(dá)

0～2mmol/L乙二醛處理ARPE19細(xì)胞24h，Western印跡法檢測(cè)顯示，0.5mmol/L濃度處理時(shí)，GMFB表達(dá)明顯升高(圖1A)。以0.5mmol/L乙二醛處理ARPE19細(xì)胞24h，用免疫熒光觀察細(xì)胞中GMFB的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)乙二醛處理組GMFB表達(dá)升高(圖1B)，提示GMFB在氧化應(yīng)激刺激的ARPE19細(xì)胞中表達(dá)升高。

2.2 GMFB對(duì)ARPE19細(xì)胞活力的影響

用重組蛋白GMFB(1μg/ml)處理細(xì)胞24h，MTT結(jié)果顯示： GMFB處理后ARPE19細(xì)胞活性明顯降低，為對(duì)照組的70%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。以siRNA沉默GMFB后，0.5mmol/L 乙二醛處理細(xì)胞24h，Western印跡法檢測(cè)GMFB的表達(dá)，結(jié)果顯示siRNA沉默后乙二醛處理組中GMFB表達(dá)比單獨(dú)乙二醛處理組顯著降低，說明siRNA沉默GMFB的效果明顯(圖2A)。以同樣的方法處理ARPE19細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞活性，0.5mmol/L乙二醛處理時(shí)細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。而GMFB沉默后細(xì)胞活性升高(P<0.05)，提示GMFB沉默改善乙二醛引起細(xì)胞活性降低(圖2B)。

2.3 基因芯片檢測(cè)中兩組間差異表達(dá)的基因

為探究GMFB對(duì)ARPE19細(xì)胞的影響，以1μg/ml GMFB處理ARPE19細(xì)胞24h并以未處理組作為對(duì)照組，提取總RNA進(jìn)行RNAseq分析。共檢測(cè)到19966個(gè)基因。與對(duì)照組相比，GMFB處理導(dǎo)致1.5倍差異表達(dá)的基因有583個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的有265個(gè)，下調(diào)的有318個(gè)。對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG分析。Western印跡法和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

圖1 GMFB在乙二醛處理的ARPE19中的表達(dá)Fig.1 Expression of GMFB in glyoxal treated ARPE19 cellsA： Western印跡法檢測(cè)不同濃度乙二醛處理ARPE19細(xì)胞24h的結(jié)果；B： 免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果，GMFB表達(dá)在細(xì)胞漿中；標(biāo)尺： 50μm；Western印跡法和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 GMFB沉默改善乙二醛引起ARPE19細(xì)胞活性的降低Fig.2 GMFB knockdown rescue glyoxal induced decreased cell viability in ARPE19 cellsA： Western印跡法檢測(cè)GMFB沉默效果，Western印跡法實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；B： ARPE19細(xì)胞同(圖A)方法處理后，以MTT檢測(cè)細(xì)胞活性；與NC組比較，*P<0.05；與GMFB處理干擾組比較，#P<0.05

2.4 差異基因的GO功能分析

為詳細(xì)研究基因的功能分類，通過GO對(duì)差異表達(dá)基因的分析，可將差異表達(dá)的基因按功能分為： 生物過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大類，見圖3。GO富集分析顯示，表達(dá)上調(diào)的基因分為以下幾類： 代謝過程(6-磷酸果糖-2-激酶/果糖- 2，6-二磷酸酶，1-磷酸甘露糖鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶)，刺激反應(yīng)(白細(xì)胞介素-8、趨化因子-26、血管內(nèi)皮生長因子)，蛋白結(jié)合(連環(huán)蛋白beta1)。表達(dá)下調(diào)的基因分為以下幾類： 細(xì)胞過程(包括細(xì)胞通訊、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞成分的運(yùn)動(dòng)、染色體分離、胞質(zhì)分裂等過程以及轉(zhuǎn)化生長因子beta3)和生物調(diào)節(jié)(包括穩(wěn)態(tài)過程、生物過程調(diào)控、分子功能調(diào)節(jié)、纖溶酶原激活物抑制劑)等。

圖3 表達(dá)差異基因的GO富集分析Fig.3 GO annotation of the differentially expressed genesA： 表達(dá)上調(diào)基因的GO富集分析；B： 表達(dá)下調(diào)基因的GO富集分析

2.5 差異基因的KEGG信號(hào)通路分析

KEGG分析表明，共有93條信號(hào)通路與差異表達(dá)的基因相關(guān)。根據(jù)上、下調(diào)基因及P值，最有相關(guān)性(P值最小)的10條上調(diào)和下調(diào)基因的KEGG通路見表1～2。結(jié)果顯示： 多條參與代謝的通路發(fā)生上調(diào)，如： 果糖和甘露糖代謝通路(fructose and mannose metabolism)、Wnt信號(hào)通路(Wnt signaling pathway)、神經(jīng)營養(yǎng)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(neurotrophin signaling pathway)。而MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)Focal adhesion、 ECM-receptor interaction等信號(hào)通路的基因下調(diào)。

表1 上調(diào)基因的KEGG相關(guān)信號(hào)通路分析

表2 下調(diào)基因的KEGG相關(guān)信號(hào)通路分析

3 討 論

氧化應(yīng)激是AMD發(fā)生的重要病理機(jī)制之一，通過誘導(dǎo)RPE細(xì)胞釋放炎癥因子加重RPE細(xì)胞的損傷，促進(jìn)AMD的進(jìn)展[9]。

目前，關(guān)于GMFB的研究多在神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)疾病領(lǐng)域。GMFB是一種細(xì)胞內(nèi)源性蛋白，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)。GMFB在初級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)P38而引起神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌[10]，說明GMFB蛋白在應(yīng)激激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用[11]。

哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜是典型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其包含的主要細(xì)胞有： 節(jié)細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長突細(xì)胞、水平細(xì)胞、視桿細(xì)胞、視錐細(xì)胞和Müller細(xì)胞。對(duì)視網(wǎng)膜中GMFB的研究較少。Nishiwaki等[12]發(fā)現(xiàn)大鼠視網(wǎng)膜能表達(dá)GMFB，用原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜GMFB的mRNA信號(hào)從胚胎14d到成年表現(xiàn)為陽性，而免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，GMFB蛋白表達(dá)在胚胎14d到出生后1d齡大鼠的視網(wǎng)膜內(nèi)核層中，到成年期則表達(dá)在Müller細(xì)胞中，認(rèn)為GMFB在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的生長和發(fā)育中起非常重要的作用。

目前，GMFB在視網(wǎng)膜疾病中的作用尚未見到相關(guān)報(bào)道。RPE細(xì)胞是一層單層的色素細(xì)胞，它頂膜面是光感受器的光感外段，基底膜面是脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜血管。RPE與其連接復(fù)合體構(gòu)成緊密的功能界面[13]。RPE細(xì)胞的功能包括： 屏障功能、吞噬功能、參與視循環(huán)代謝、抗氧化功能和分泌生長因子。RPE細(xì)胞中發(fā)生氧化應(yīng)激引起AMD[14]。乙二醛作為一種引起氧化應(yīng)激的介質(zhì)，在細(xì)胞中引起活性氧水平升高引起氧化應(yīng)激[7-8]。本研究以乙二醛處理人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE19細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的APRE19細(xì)胞中GMFB的表達(dá)明顯增加，提示GMFB在ARPE19細(xì)胞中與氧化應(yīng)激有關(guān)的作用。GMFB重組蛋白處理ARPE19細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)GMFB處理組細(xì)胞活性顯著降低，而siRNA沉默GMFB時(shí)可以改善乙二醛引起ARPE19細(xì)胞的活性降低。提示GMFB與細(xì)胞的生存相關(guān)，GMFB在ARPE19細(xì)胞中起不良的作用。在深入探究GMFB在RPE細(xì)胞中作用的研究中，對(duì)GMFB處理組與未處理組的RNAseq篩選發(fā)現(xiàn)有520個(gè)基因有顯著的差異表達(dá)。對(duì)篩選的基因進(jìn)行KEGG分析發(fā)現(xiàn)，GMFB處理組中Wnt信號(hào)通路激活。Wnt信號(hào)通路控制多種發(fā)育過程和穩(wěn)態(tài)[15]。研究[16]顯示，在AMD動(dòng)物模型的視網(wǎng)膜RPE中WNT信號(hào)通路被激活，β-catinen持續(xù)表達(dá)誘導(dǎo)血管生成和炎性因子，如VEGF、TNF-α、NF-κB，其表達(dá)均增多。本研究表明，在GMFB處理組中，β-catinen 和smad2表達(dá)增高，同時(shí)伴有VEGFA和NF-κB1表達(dá)增多，提示GMFB激活Wnt信號(hào)通路。在氧化應(yīng)激的RPE中，很有可能通過Wnt信號(hào)通路來影響RPE細(xì)胞。

KEGG分析表明，GMFB處理組中趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(chemokine signaling pathway)上調(diào)。而該通路在炎癥中起重要作用。研究[17-18]表明，在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞中炎癥因子明顯升高，在神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞中的GMFB也引起炎癥因子表達(dá)增加。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，GMFB處理組中趨化因子CCL26和CXCL8表達(dá)增高，提示GMFB作用于RPE細(xì)胞引起炎癥因子表達(dá)增加，在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞中與炎癥因子的釋放相關(guān)。

通過KEGG分析還發(fā)現(xiàn)，GMFB處理組中細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的通路粘著斑(focal adhesion)形成，細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix， ECM)受體相互作用(ECM-receptor interaction)下調(diào)。ECM在RPE細(xì)胞的存活中有重要作用，為RPE細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、物質(zhì)代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提供穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境[19]。ECM也參與調(diào)節(jié)RPE細(xì)胞的分化、增殖、遷移和細(xì)胞黏附等生理過程[20-21]。研究[19]表明，AMD時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)會(huì)發(fā)生紊亂。本研究通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，參與ECM相關(guān)通路的基因collagen XI、heparan sulfate proteoglycan 2、integrin beta 3、filamin C 和thrombospondin 1等表達(dá)量均下降，提示GMFB影響RPE細(xì)胞的ECM，在氧化應(yīng)激的RPE細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。

綜上所述，氧化應(yīng)激能誘導(dǎo)ARPE19細(xì)胞中GMFB表達(dá)上調(diào)，并且GMFB主要影響ARPE19細(xì)胞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞間連接和黏附功能，其機(jī)制可能是通過NF-κB和Wnt信號(hào)通路發(fā)揮作用。GMFB作用的分子機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

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Expression of Glia maturation factor beta in ARPE19
cells and its relation to oxidative stress

MaihemutiAwuti1,2，LIANChun-pin1,2，OUQing-jian1,2，JIANGXiao-man1,2，XUGuo-tong1,2，LYULi-xia1,2

(1. Dept. of Regenerative Medicine， Medical College， Tongji University， Shanghai 200092， China；2. Stem Cell Research Center， Medical College， Tongji University， Shanghai 200092， China)

Objective To investigate the expression of glia maturation factor beta(GMFB) in human retinal pigment epithelium(RPE) ARPE19 cells and its relation to oxidative stress. Methods ARPE19 cells were treated with glyoxal(0， 0.25， 0.5， 1.0 and 2.0mmol/L) for 24h. GMFB expression levels were examined by Western blot. APPE19 was treated with 1μg/ml GMFB for 24h. Total RNA was extracted and used for RNAseq assay. By comparing the differentially expressed profile of two groups， the genes with expression difference fold >1.5 times andP<0.05 were selected as candidate genes for GO enrichment analysis and KEGG analysis. Results In the ARPE19 cells under the treatments of different concentrations of glyoxal， GMFB expression levels were significantly up-regulated. RNAseq analysis showed that the expression patterns of 583 genes significantly altered in experimental group， of which 265 were up-regulated and 318 were down-regulated. GO analysis indicated that GMFB was involved in the process of cellular metabolism. KEGG analysis further indicated that GMFB was involved in metabolic pathway， cancer pathway， Wnt signaling pathway and chemokine signaling pathway. Furthermore， inflammation related genes CCL26， CXCL8 and NFKB1 were also up-regulated. Conclusion Oxidative stress induces the up-regulation of GMFB in ARPE19 cells. The effects of GMFB on ARPE19 were related with cell-cell binding， Wnt signaling pathway， pathway in cancer as well as chemokine signaling pathway. The results indicate that GMFB is involved in important cellular process in RPE cells under oxidative stress and might be an important factor in the pathology of retinal degeneration.

oxidative stresss； glia maturation factor beta； retinal pigment epithelium； nuclear factor of kappa B

10.16118/j.1008-0392.2016.05.002

2016-04-22

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)項(xiàng)目(201640229)

買合木提·阿吾提(1988—)，男，碩士.E-mail： bandit40@126.com

呂立夏.E-mail： lulixia@#edu.cn

R 329.2+6

A

1008-0392(2016)05-0006-08