Lv—shRNA—Hsa—microRNA—691慢病毒表達載體的構(gòu)建與鑒定

何燕浙 唐德軍

【摘要】目的：構(gòu)建 Lv-shRNA-hsa-microRNA-691慢病毒表達載體。

方法： 雙酶切及測序鑒定正確后進行慢病毒包裝與滴度檢測。構(gòu)建成功后感染人胰腺癌細胞Panc-1， 48h后Real-time Q-PCR檢測miR-691的表達。

結(jié)果：病毒感染后的Panc-1胰腺癌細胞在倒置熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光，Real-time Q-PCR顯示被感染細胞的miR-691表達量較未感染細胞顯著增高。

結(jié)論：建立了高效穩(wěn)定表達Lv-shRNA-hsa-miR-691 的慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。

【關(guān)鍵詞】microRNA； Lv-shRNA-hsa- miR-691； 慢病毒表達載體

microRNA是近年來在人體中發(fā)現(xiàn)一類長度約為22個核苷酸左右的非編碼RNA，它不直接參與蛋白質(zhì)的合成，通過對人體1/3左右的mRNA進行調(diào)節(jié)，控制著細胞分化、增殖和凋亡等生命活動，并能夠特異性靶向mRNA實現(xiàn)對其轉(zhuǎn)錄后抑制[1]。已有的研究表明：波形蛋白作為胰腺癌上皮-間質(zhì)化標志蛋白之一，與胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2， 3]。通過生物性息學(xué)預(yù)測Lv-shRNA-hsa-miR-691可靶向調(diào)控波形蛋白的表達。本研究旨在構(gòu)建針對Lv-shRNA-hsa-miR-691高效的慢病毒表達系統(tǒng)，為深入研究其靶向調(diào)控波形蛋白的表達對胰腺腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移提供一種研究工具。

1.材料和方法

1.1 材料

1. 質(zhì)粒、菌株和細胞及主要酶和試劑

慢病毒質(zhì)粒pLenti-CMV-GFP Puro （658-5）、包裝質(zhì)粒pCMVDR8.74 和 pMD2.G購自Addgene公司；大腸桿菌菌株P(guān)ANC-1細胞妥善保存。限制性內(nèi)切酶AgeI、EcoR I、T4 連接酶購自Takara公司；； 總RNA提取試劑盒購自Qiagen公司；Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司；Lv-shRNA-hsa-miR-691定量PCR引物及miRNA qRT-PCR 檢測試劑盒購自GeneCopoeia公司。

1.2 方法

慢病毒制備 滴度測定及在胰腺癌細胞中的表達

將DNA混合物加至100μl Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑中，加入培養(yǎng)瓶，轉(zhuǎn)染24h后，加入 20ml Virus Production培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染44-48h，收集上清液到離心管內(nèi)。將收集的上清液4℃，1000 rpm/min，離心5min，取上清超速離心，風(fēng)干；后每管加入30ml 病毒上清，然后將2ml的20%蔗糖溶液（PBS配制）加入上清液的底部，平衡后4℃，25000 rpm/min，離心2h。離心完畢后棄去上清液，管底白色沉淀晾干后加入100u l冷PBS重懸，輕輕吹打溶解后收集病毒，分裝5μl/管，-80℃凍存。

胰腺癌細胞PANC-1接種。待細胞覆蓋至70%左右時，取其中3孔，以感染復(fù)數(shù)（MOI=4：1）比例加入LV-plenti-GFP-miR-691感染胰腺癌細胞PANC-1，觀察綠色熒光蛋白表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理：

采用t檢測，由SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析結(jié)果。檢測水準為P（雙側(cè)）<0.05。

2 結(jié)果：

LV-plenti-GFP-miR-691感染PANC-1細胞，GFP表達綠色熒光呈高峰。Real-time Q-PCR檢測Lv-shRNA-hsa-miR-691在PANC-1細胞中表達結(jié)果，其表達量結(jié)果顯示LV-plenti-GFP-miR-691病毒感染較對照組的miR-691表達顯著升高200多倍。

3 討論

miR-691主要存在于胎肝、中樞神經(jīng)、空腸、甲狀腺在大多數(shù)成熟的器官和組織包括胰腺不表達[5]。研究表明miR-691在多種腫瘤中表達失調(diào)，其可能參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。最近研究表明：miR-691能抑制頭頸部鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移，促進癌細胞凋亡[6]；miR-691在胰腺癌中的表達情況及其作用亦未見研究報道。

本研究成功構(gòu)建Lv-shRNA-hsa-miR-691 慢病毒表達系統(tǒng)，經(jīng)雙酶切測序分析，與Sanger miRBase中的序列一致，沒有堿基缺失或替換；包裝成慢病毒感染胰腺癌細胞PANC-1后能穩(wěn)定高效地表達成熟Lv-shRNA-hsa-miR-691，為深入研究Lv-shRNA-hsa-miR-691的生物學(xué)功能和作用機制提供強有力的工具。

【References】

[1]Bartel DP. MicroRNAs： genomics， biogenesis， mechanism， and function. Cell. 2004. 116（2）： 281-97.

[2]Vasko V， Espinosa AV， Scouten W， et al. Gene expression and functional evidence of epithelial-to-mesenchymal transition in papillary thyroid carcinoma invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007. 104（8）： 2803-8.

[3]慢病毒載體介導(dǎo)RNA干擾體外抑制人胰腺癌細胞VIM基因的表達（英文）. Chinese-German Journal of Clinical Oncology. 2009. （03）： 145-149.

[4]Liang Y， Ridzon D， Wong L， Chen C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 2007. 8： 166.

[5]Liu X， Chen Z， Yu J， Xia J， Zhou X. MicroRNA profiling and head and neck cancer. Comp Funct Genomics. 2009 ： 837514.

[6]Cockrell AS， Kafri T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 2007. 36（3）： 184-204.