基于UPLC及多成分分析的西洋參質(zhì)量評價(jià)

唐艷 閆述模 汪靜靜 袁媛 楊濱

[摘要]建立超高效液相色譜法，以001%甲酸乙腈001%甲酸水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，同時測定西洋參樣品中6種皂苷人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rc，Ro，Rd的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；應(yīng)用SPSS 210及SIMCAP軟件，對西洋參藥材與飲片、不同生長年限西洋參樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、主成分分析和偏最小二乘判別分析。在所建立的色譜條件下，6種人參皂苷能夠達(dá)到良好分離，線性關(guān)系、穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性、加樣回收試驗(yàn)均符合中藥質(zhì)量分析要求；所測57份西洋參樣品中人參皂苷Rg1，Re，Rb1的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)都符合2015年版《中國藥典》的規(guī)定；方差分析結(jié)果顯示，西洋參藥材和飲片中6種人參皂苷總質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著性差異，主成分分析可以實(shí)現(xiàn)藥材與飲片的區(qū)分；二至四年產(chǎn)樣品中人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨生長年限的增長而增長，偏最小二乘判別分析可用于區(qū)分二至四年生西洋參樣品。研究結(jié)果表明，該實(shí)驗(yàn)建立的超高效液相色譜法快速、準(zhǔn)確，可用于西洋參樣品中人參皂苷類成分的含量測定；多元數(shù)據(jù)分析適合于西洋參的質(zhì)量分析。

[關(guān)鍵詞]西洋參；人參皂苷；含量測定；超高效液相色譜法；多元數(shù)據(jù)分析

[Abstract]An ultra performance liquid chromatography （UPLC）method combined with multivariate data analysis was developed to evaluate the quality of American ginseng by simultaneously determining the concentrations of six ginsenosides （Rg1， Re， Rb1， Rc， Ro and Rd）in the samples For UPLC， acetonitrile with 001% formic acid and water with 001% formic acid were used as the mobile phase with gradient elution Under the established chromatographic conditions， the six ginsenosides could be well separated and the results of linearity， stability， precision， repeatability， and recovery rate all reached the requirement of quantification analysis， respectively The total contents of Rg1， Re， and Rb1 in 57 samples all reached the requirement of the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia At the same time， the experimental data were analyzed by principle component analysis （PCA） and partial least squares discriminant analysis （PLSDA） The crude drugs and the decoction pieces can be discriminated by a PCA method and the samples with different age can be distinguished by a PLSDA method

[Key words]American ginseng； ginsenosides； content determination； UPLC； multivariate analysis

doi：10.4268/cjcmm20160918

中藥西洋參為五加科植物西洋參Panax quinquefolium L的干燥根，性寒，味苦，微甘，有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津之效，可用于氣虛陰虧，口干舌燥，咳喘痰血，消渴，內(nèi)熱等癥[1]。西洋參為名貴中藥材，具有增強(qiáng)中樞神經(jīng)功能、保護(hù)心血管、提高免疫力、治療糖尿病等作用[23]。我國自1975年開始大規(guī)模引種西洋參，經(jīng)過40多年的發(fā)展，現(xiàn)已成為世界上西洋參三大主產(chǎn)國之一[4]。西洋參藥材的質(zhì)量與產(chǎn)地、栽培、采收年限、加工方法等[510]關(guān)系密切，皂苷類成分是西洋參的有效成分之一，《中國藥典》（2015年版）以人參皂苷Rg1，Re，Rb1的總量作為西洋參質(zhì)量評價(jià)的指標(biāo)之一。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了西洋參中人參皂苷的含量測定方法，如比色法、薄層色譜、高效液相色譜、超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）、液質(zhì)聯(lián)用等方法[11]；在質(zhì)量評價(jià)上，多側(cè)重在對北美產(chǎn)和國產(chǎn)西洋參的質(zhì)量評價(jià)、國內(nèi)不同產(chǎn)地西洋參的質(zhì)量評價(jià)及西洋參不同部位人參皂苷成分的分析上[5，910，1216]；僅少數(shù)文獻(xiàn)從多元數(shù)據(jù)分析的角度評價(jià)西洋參藥材的質(zhì)量[10，12]。

本文從吉林產(chǎn)區(qū)及藥市采/收集了近60份西洋參樣品，包括原藥材/飲片和不同生長年限樣品，建立了同時測定6種人參皂苷成分含量的UPLC方法，借助統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用多元數(shù)據(jù)分析方法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)了西洋參藥材和飲片、不同生長年限藥材的區(qū)分，為西洋參藥材/飲片質(zhì)量評價(jià)提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1材料

11實(shí)驗(yàn)樣品

西洋參藥材和飲片主要來自2014年8月吉林種植基地的采集品和2015年8月購買的市售品，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所楊濱研究員鑒定為五加科植物西洋參P quinquefolium的干燥根及其飲片。樣品粉碎，過3號篩。

12藥品及試劑

對照品人參皂苷Rg1（純度98%，批號140423）和Re（純度98%，批號140510）購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，對照品人參皂苷Rb1（純度937%，批號110704201424）和Rd（純度942%，批號111818201302）購自中國食品藥品檢定研究院，對照品人參皂苷Ro（純度9900%，批號MUST15020511）及Rc（純度9911%，批號MUST15011912）購自北京世紀(jì)奧科生物科技有限公司。

甲酸（分析純，批號20130709）和正丁醇（分析純，批號20140312）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，甲醇（分析純，批號20140311）購自北京化工廠，乙腈（色譜純，A9984）購自美國Fisher公司，高純水自制（182 μΩ，法國MilliQ超純水系統(tǒng)儀）。

13儀器

Waters Acquity HClass UPLC TM超高效液相色譜儀（包括四元溶劑管理器，真空脫氣機(jī)，自動進(jìn)樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器，Empowe Ⅱ色譜工作站，美國Waters公司），Waters Xevo G2XSQTOF MS質(zhì)譜系統(tǒng)（Waters公司，Milford，UK），電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械七廠），Ohams Scout Pro型普通電子天平（常州稱重設(shè)備有限公司），2004MBP6型半微量電子天平（德國Sartorius公司），DL720D數(shù)控超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司），200 W紅外燈（海寧市奇異照明電器有限公司）。

2方法和結(jié)果

21色譜條件

色譜柱Acquity BEH C18 （21 mm×50 mm，17 μm）；流動相001%甲酸乙腈（A）001%甲酸水（B），梯度洗脫：0～3 min， 20%～22% A； 3～5 min， 22%～23% A； 5～6 min， 23%～31% A； 6～9 min， 31%～315% A； 9～10 min， 315%～32% A； 10～13 min， 32%～36% A； 13～145 min， 36%～38% A； 145～16 min， 38%～20% A；流速04 mL·min-1；檢測波長為203 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

22質(zhì)譜條件

液質(zhì)采用負(fù)離子模式，掃描范圍為50～1 500，霧化氣N2，源溫度100 ℃，去溶劑溫度450 ℃，錐孔電壓2 kV，掃描間隔01 s，碰撞能量70～75 eV。

23色譜峰的歸屬

通過與人參皂苷對照品色譜峰保留時間的比較，西洋參色譜圖見圖1，峰1～6分別歸屬為人參皂苷Rg1， Re， Rb1， Rc， Ro， Rd。根據(jù)液質(zhì)數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[1718]，鑒定峰7， 8分別為人參皂苷丙二?；鵕b1 （MalRb1）和人參皂苷丙二酰基Rd （MalRd）見表1。

1. 人參皂苷Rg1；2. 人參皂苷Re； 3. 人參皂苷Rb1； 4. 人參皂苷Rc； 5. 人參皂苷Ro； 6. 人參皂苷Rd； 7. 人參皂苷丙二?；鵕b1； 8. 人參皂苷丙二?；鵕d。

24供試品溶液的制備

取西洋參藥材干燥粉末約05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，40 ℃超聲提取，功率100 kHz，提取30 min后，取出冷卻至室溫，用70%甲醇補(bǔ)重，濾過，取續(xù)濾液，過022 μm微孔濾膜，即得。

25對照品溶液的制備

分別精密稱取適量人參皂苷Rg1， Re， Rb1， Rc， Ro， Rd對照品，以70%甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為038，077，196，032，045，046 g·L-1的混合對照品溶液。

26正交試驗(yàn)優(yōu)選超聲提取因素

261試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果試驗(yàn)設(shè)計(jì)了提取時間、不同濃度甲醇、溶劑用量（料液比）的3因素3水平表1負(fù)離子模式下峰7， 8主要質(zhì)譜數(shù)據(jù)

正交試驗(yàn)見表2，以6種人參皂苷的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取條件。試驗(yàn)結(jié)果見表3，4。表4中極差大小顯示，各因素對提取含量的影響為：甲醇濃度（B）>提取時間（A）>料液比（C）。從方差分析結(jié)果來看，僅甲醇濃度（B因素）對提取有顯著性影響（P<005），綜合考慮，確定最佳提取方法為A2B2C2，即70%的甲醇溶液超聲提取30 min，料液比為1∶20。表2因素水平表

Table 2Factors and levels of orthogonal test

水平A

t/minB

甲醇濃度/%C

料液比/g·mL-1120501∶10230701∶203401001∶30

262最佳提取方法的驗(yàn)證取3份西洋參藥材粉末，約05 g，精密稱定，分別準(zhǔn)確加入70%甲醇溶液10 mL，超聲提取30 min，在21項(xiàng)色譜條件下分析，測得6種人參皂苷的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為379%，376%，379%，表明該提取方法穩(wěn)定可行。

27含量測定的方法學(xué)考察

271線性關(guān)系取混合對照品溶液，在上述21項(xiàng)色譜條件下，分別進(jìn)樣01，02，04，08，10，12，16 μL，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以各人參皂苷對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信噪比S/N=3為基準(zhǔn)，測得最低檢測限，以信噪比S/N=10為基準(zhǔn)，測得最小定量限。人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rc，Ro，Rd的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、最小檢測限和定量限見表5。結(jié)果表明6種人參皂苷有良好的線性范圍。

272精密度考察取混合對照品溶液，在21項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6針，人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rc，Ro，Rd色譜峰峰面積的RSD（n=6）分別為092 %，091 %，083%，096%，11%，11%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

273日內(nèi)精密度試驗(yàn)取供試品溶液分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h進(jìn)樣測定，供試品溶液6種人參皂苷峰面積的RSD（n=8）分別為15%，086%，13%，16%，13%，071%，結(jié)果表明供試品溶液日內(nèi)精密度良好。

274日間精密度試驗(yàn)取供試品溶液分別于第1天，第2天，第3天進(jìn)樣測定，供試品溶液6種人參皂苷峰面積的RSD（n=3）分別為11%，088%，16%，25%，073%，30%，結(jié)果表明供試品溶液在3 d內(nèi)精密度良好。

275重復(fù)性試驗(yàn)取西洋參藥材粉末約05 g，平行6份，精密稱定，同23項(xiàng)供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在21項(xiàng)色譜條件下分析，計(jì)算樣品中人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rc，Ro，Rd質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為11%，084%，057%，17%，093%，12%。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

276加樣回收率試驗(yàn)取西洋參藥材粉末約025 g × 9，精密稱定，按照相當(dāng)于藥材中人參皂苷150%，100%和50%的比例，分別精密加入混合對照品溶液10 mL，同23項(xiàng)供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在21項(xiàng)色譜條件下分析，計(jì)算人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rc，Ro，Rd的回收率，回收率=（C-A）/B×100%，A為樣品所含被測成分的量，B為加入對照品量，C為實(shí)測值，試驗(yàn)結(jié)果見表6。

28皂苷類成分含量分析

對來自不同產(chǎn)地的38批西洋參藥材/飲片和來自同一產(chǎn)地不同生長年限的19批西洋參藥材進(jìn)行

281西洋參藥材與飲片中成分分析西洋參藥材/飲片中人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rc，Ro，Rd的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在明顯差異見表7，其中，Rb1和Re的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較其他4種皂苷高。采用SPSS 210軟件，以6種人參皂苷總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，對西洋參藥材及飲片數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，兩者的人參皂苷總質(zhì)量分?jǐn)?shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<005），即飲片中6種人參皂苷總質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于藥材的量。以6種人參皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為變量，對38份西洋參樣品進(jìn)行主成分分析 （principle component analysis， PCA），3個主成分因子PC1，PC2，PC3的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到8130%，因子得分系數(shù) PC1=0886×人參皂苷Re+0861×人參皂苷Rc +0749×人參皂苷Rg1 +0703×人參皂苷Rb1，PC2=0912×人參皂苷Ro，PC3=0827×人參皂苷Rd質(zhì)量分?jǐn)?shù)。PCA結(jié)果表明，原藥材和飲片可以很好的區(qū)分開見圖2，其中，西洋參飲片的數(shù)據(jù)分布比較集中，表明其人參皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有良好的一致性，相對而言，藥材的數(shù)據(jù)點(diǎn)比較分散，表示樣品中人參皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大。

282不同生長年限西洋參藥材的成分分析表8為采集吉林種植基地二至四年生西洋參藥材中各人參皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，可以看出，6種人參皂苷總質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨生長年限的上升而增加，四年生藥材人參皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，這和劉志洋等[18]的研究結(jié)果“吉林產(chǎn)西洋參的最佳采收年限為4年”相吻合。采用SIMCAP軟件，基于6種人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對不同生長年限的西洋參樣品進(jìn)行PLSDA數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明，2～4年不同生長年限的西洋參藥材可以明顯區(qū)分開來見圖3；loading圖顯示，人參皂苷Rb1質(zhì)量分?jǐn)?shù)在不同生長年限西洋參樣品中存在較大差異，可作為區(qū)分不同年限西洋參樣品的主要成分。

3討論

31色譜條件的優(yōu)化

以分離度、峰數(shù)、峰形、基線穩(wěn)定性為指標(biāo)，對流速（04，045，050 mL·min-1），柱溫（25，30，35 ℃），流動相的組成（001%甲酸乙腈001%甲酸水，001%甲酸乙腈005%甲酸水，005%甲酸乙腈005%甲酸水）進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，流速過快會導(dǎo)致峰數(shù)較少，基線不穩(wěn)；人參皂苷Ro易受溫度影響，柱溫30 ℃時，與人參皂苷Rc可基線分離；流動相乙腈和水中加相同比例的甲酸時，可防止基線下降，得到的色譜圖基線更加平穩(wěn)。綜上，以流速04 mL·min-1，流動相組成為001%甲酸乙腈001%甲酸水，柱溫30 ℃作為測定條件。

32樣品提取條件的選擇

西洋參中皂苷的提取方法主要有加熱回流提取，超聲提取，超臨界流體萃取，微波輔助萃取等[1922]，常用的提取溶劑有甲醇、乙醇和水飽和正丁醇等。本實(shí)驗(yàn)采用單因素考察和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，比較了提取方法 （藥典回流提取法，超聲提取，紅外燈輻射提?。⑻崛∪軇?（70%甲醇、70%乙醇和水飽和正丁醇）、超聲提取不同時間、溫度和頻率、液料比等因素對提取含量的影響，確定了適宜的樣品提取方法。

33藥材和飲片的西洋參樣品成分分析

采用SPSS軟件分析6種人參皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)藥材和飲片可被分為兩組。從主成分因子的組成可以看出，所檢測的6種皂苷成分對分組都有貢獻(xiàn)。另外，發(fā)現(xiàn)藥材中Rb1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較飲片低，而MalRb1的峰面積高于飲片。推測飲片中的MalRb1更易轉(zhuǎn)化為Rb1，使得飲片中中性皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較藥材增加。這與文獻(xiàn)報(bào)道，MalRb1的?；鶚O不穩(wěn)定，易水解轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rb1是一致的[23]。

34人參皂苷Rc與Ro的分離易受溫度的影響

本文中人參皂苷Rc的回收率較低，可能與測定過程中溫度的細(xì)微變化影響了人參皂苷Rc的基線分離有關(guān)。

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[責(zé)任編輯丁廣治]