鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ抑制劑KN-93加重大鼠離體心臟鈣超載損傷

孔令恒，顧曉明，南　瑛，張建英，孫　娜，朱娟霞，周京軍

(1.西安醫(yī)學院基礎部生理學教研室，陜西 西安　710021；2.第四軍醫(yī)大學基礎部生理學教研室,陜西 西安　710032)

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鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ抑制劑KN-93加重大鼠離體心臟鈣超載損傷

孔令恒1, 2，顧曉明2，南瑛1，張建英2，孫娜1，朱娟霞1，周京軍2

(1.西安醫(yī)學院基礎部生理學教研室，陜西 西安710021；2.第四軍醫(yī)大學基礎部生理學教研室,陜西 西安710032)

摘要：目的觀察鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)抑制劑KN-93對大鼠離體心臟鈣超載損傷的影響。方法采用Langendorff裝置進行離體心臟灌流，利用鈣反?，F(xiàn)象誘發(fā)胞內鈣超載。32只SD ♂大鼠隨機分為正常對照組、藥物KN-93對照組、鈣反常組和KN-93處理組。實驗全程記錄左心室內壓的變化，以左心室舒張末壓(LVEDP)和發(fā)展壓(LVDP)評價心功能，于不同時間點收集冠脈流出液，并測定乳酸脫氫酶(LDH)的含量。實驗結束后，采用2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑染色檢測心肌梗死面積的變化。結果與正常對照組相比，KN-93(2.5 μmol·L-1)對正常心臟的左室功能、冠脈流量和心肌梗死面積沒有明顯影響(P>0.05)；與正常對照組相比，鈣反常組在復鈣灌注結束時LVEDP抬升、LVDP降低，梗死面積達(18±7.2)%，冠脈流量減少，LDH含量增加(P<0.01)；KN-93(2.5 μmol·L-1)處理組與鈣反常組相比，心肌梗死面積為(90±4.8)%，LVEDP進一步升高，LVDP消失，冠脈流量明顯減少，LDH含量明顯增多(P<0.01)。結論CaMKⅡ抑制劑KN-93加重急性鈣超載引起的心肌損傷，這一作用可能與影響CaMKⅡ活性有關。

關鍵詞：鈣超載；鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ；KN-93；鈣離子；心臟；心肌損傷

心肌缺血/再灌注損傷是急性心肌梗死溶栓治療、冠狀動脈成形術、心臟停跳手術過程中不可避免的伴隨事件，可導致心肌頓抑、心肌梗死、心律失常，甚至因心衰致死。眾所周知，鈣超載是導致心臟缺血/再灌注過程產生不可逆損傷的一個重要原因，可引起心肌細胞結構損傷和功能障礙，但其具體機制仍不清楚[1]。

鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/CaM dependent kinase Ⅱ, CaMKⅡ)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要表達于心臟，是心血管生理及病理變化過程中信號轉導的重要組成部分，通過調節(jié)肌質網上的鈣釋放通道和鈣泵，維持心肌細胞內鈣穩(wěn)態(tài)，并在心肌肥厚、心力衰竭、心律失常和擴張性心肌病的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用[2-3]。本實驗利用大鼠離體心臟鈣反?，F(xiàn)象(Ca2+paradox)，即短時間無鈣液灌注，之后恢復有鈣液灌注，可造成急性鈣超載心肌損傷[4-6]，觀察了CaMKⅡ抑制劑KN-93對心肌損傷的影響，旨在初步明確CaMKⅡ在鈣超載心肌損傷中的作用。

1材料與方法

1.1實驗動物與試劑

健康成年♂ SD大鼠32只，體質量250～300 g，購買于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心。CaMKⅡ抑制劑KN-93購于Calbiochem公司。2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購于Sigma公司。乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自Abnova公司。正常Krebs-Henseleit液(KH solution)成分及含量(mmol·L-1)：NaCl 120，KCl 4.7，MgSO41.2，KH2PO41.2，CaCl21.25，NaHCO325，Glucose 11；無鈣KH液:去除正常KH液中的CaCl2，其它成分保持不變，同時添加0.2 mmol·L-1Na2EDTA。灌流前40 min用95% O2和5% CO2混合氣體(V/V)向KH液中持續(xù)通氣至實驗結束，實驗中KH液溫度保持在37 ℃，pH維持在7.35～7.45。

1.2方法

1.2.1大鼠離體心臟灌流按實驗室常規(guī)方法進行大鼠離體心臟灌流，基本過程為：大鼠腹腔內分別注射肝素500 U·kg-1及戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)，待麻醉后立即開胸摘取心臟置于4 ℃的正常KH液中，將主動脈根部固定于Langendorff灌流系統(tǒng)(Radnoti Glass Technology, USA)的管口，37 ℃正常KH液由主動脈口逆行灌注，灌注壓維持在10.64 kPa(80 mmHg)。待心臟復跳后，于左心耳處剪一小口，將前端帶有乳膠球囊的測壓管經二尖瓣插入左心室，測壓管的另一端經壓力換能器(Model 100BP, Biopac System, USA)與計算機相連。調節(jié)球囊內的液體量使左心室舒張末壓界于0.67～1.33 kPa(5～10 mmHg)之間，平衡灌流15 min，待心臟跳動穩(wěn)定后標記為灌注開始，按照實驗分組進行灌流。

1.2.2實驗分組如Fig 1所示，32只大鼠隨機分成4組(n=8)：① 正常對照組(Control)：KH液灌注40 min； ② 藥物對照組(KN-93+control)：用KH液灌注7 min，含KN-93的KH液灌注8 min，再用KH液灌注25 min；③ 鈣反常組(Ca2+paradox, CaP)：KH液灌注8 min，無鈣KH液灌注2 min，KH液灌注30 min；④ KN-93處理組(KN-93+CaP)：KH液灌注7 min，含KN-93的KH液灌注1 min，無鈣含KN-93的KH液灌注2 min，含KN-93的KH液灌注5 min，正常KH液灌注 25min。

Fig 1　 Experimental protocol

The time upon re-perfusion with KH solution containing 1.25 mmol·L-1Ca2+was set as 0.

1.2.3心臟功能的測定采用AcqKnowledge 3.8.1系統(tǒng)全程記錄左心室內壓(left ventricular pressure，LVP)、左室收縮峰壓(left ventricular peak systolic pressure，LVPSP)及LVEDP的變化。左室發(fā)展壓(LVDP)采用LVPSP-LVEDP計算獲得，以LVDP和LVEDP反映左室功能變化。

1.2.4LDH檢測收集各組復鈣開始后5 min內的冠脈流出液，按照Abnova公司提供的ELISA試劑盒說明，依次加入反應液，450 nm處檢測吸光值。結果以實驗組吸光值/對照組吸光值的比值來表示各組LDH的相對活性。

1.2.5心肌梗死面積的測定實驗結束后，快速取下心臟，置于-80 ℃凍存1 h；去除心房組織，沿心臟長軸自心尖向心底方向，連續(xù)切6片厚度為1 mm左右的環(huán)形切片，置于10 g·L-1TTC溶液中，37 ℃下避光孵育10 min；4%多聚甲醛固定過夜；數(shù)碼相機拍照，用OPTIMASv5.2軟件雙盲法分析心肌梗死面積。正常心肌組織呈現(xiàn)磚紅色，壞死組織為白色。

心肌梗死面積百分比/%=(壞死區(qū)面積/總面積)×100%。

1.3統(tǒng)計學分析

2結果

2.1各組大鼠心肌梗死面積比較

TTC染色結果顯示，對照組于心臟實驗結束后未檢測到心肌死亡(Fig 2A)；藥物對照組心臟接受KN-93(2.5 μmol·L-1)處理8 min，與正常對照組大鼠相比，心梗面積沒有明顯變化(P>0.05，F(xiàn)ig 2B，F(xiàn)ig 3)；鈣反常組心臟在用2 min無鈣液、30 min正常KH液接替灌注后，心肌梗死面積明顯增大，達(18±7.2)%(P<0.01,Fig 2C，F(xiàn)ig 3)；KN-93處理心臟后可進一步增加梗死面積，變?yōu)?90±4.8)%(P<0.01,Fig 2D，F(xiàn)ig 3)。

Fig 2　TTC staining of myocardial tissue slices in different groups

A: Control; B: KN-93+control; C: CaP group; D: KN-93+CaP group.

2.2KN-93處理對冠脈血流量的影響

如Tab 1所示，與正常對照組相比，KN-93(2.5 μmol·L-1)藥物對照組大鼠心臟的冠脈流量沒有明顯變化(P<0.05)；鈣反常組在無鈣KH液灌注末(0 min)、復鈣液灌注的3 min、15 min、30 min時的冠脈流量減少(P<0.01)；與鈣反常組相比，KN-93處理組在無鈣KH液灌注末(0 min)、復Ca2+灌注后3 min、15 min、30 min 的冠脈流量顯著減少(P<0.01)。

2.3各組大鼠心臟冠脈流出液中LDH含量的比較

藥物對照組大鼠心臟冠脈流出液中LDH含量與對照組相比較無明顯差異(Fig 4)；與對照組相比，鈣反常組大鼠冠脈流出液中LDH含量升高(P<0.01，F(xiàn)ig 4)；與鈣反常組相比，KN-93處理組冠脈流出液中LDH含量明顯增加(P<0.01，F(xiàn)ig 4)。

Tab 1　Comparison of coronary flow of isolated rat hearts

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsCaP.

Fig 3　The percentage of myocardial infarction

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsCaP.

2.4KN-93處理惡化心功能

平衡灌注期，各組 LVEDP、LVDP均無顯著差異，對照組大鼠心臟正常KH液灌注40 min，心功能基本保持不變；用含KN-93(2.5 μmol·L-1)的KH液灌注8 min，與對照組相比，于實驗結束時,心功能沒有明顯變化(P>0.05，F(xiàn)ig 5)；鈣反常組大鼠心臟接受2 min無鈣液、30 min正常KH液接替灌注后，與正常對照組相比，LVEDP抬升，LVDP減小(P<0.01，F(xiàn)ig 5)；KN-93干預鈣反常大鼠心臟后，LVEDP升高更加明顯，且LVDP消失(P<0.01，F(xiàn)ig 5)。

Fig 4　The content of LDH in coronary effluent

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsCaP.

3討論

心肌細胞缺血一段時間后會導致一定程度的損傷，然而，恢復血液供應后，缺血心肌的損傷不但沒有改善，反而進一步加重，最終導致不可逆損傷，形成心肌缺血/再灌注損傷。目前，關于缺血/再灌注損傷的發(fā)病機制并不是十分清楚，而在心肌細胞缺血期的可逆性損傷轉化為不可逆損傷的過程中，鈣超載及其觸發(fā)的復雜細胞信號轉導過程起著重要作用[1]。本研究采用大鼠離體心臟急性鈣超載模型，首次觀察到CaMKⅡ抑制劑KN-93加重鈣超載引起的心肌損傷，提示CaMKⅡ可能參與大鼠鈣超載性心肌損傷，進一步完善了以往的研究。

Fig 5　KN-93 aggravates the heart function in calcium paradox

The upper panel, the representative of left ventricular pressure (LVP) recording. The lower panel, group results on the recovery of LVDP and the LVEDP at the end of perfusion. 1 mmHg=0.133 kPa,**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsCaP.

CaMKⅡ參與胞內鈣穩(wěn)態(tài)的調節(jié)，調控胞內某些基因的表達以及細胞凋亡，是胞內生理活動和病理信號轉導的關鍵蛋白之一。目前，關于CaMKⅡ的激活方式有Ca2+/CaM依賴激活、自身激活和氧化激活，研究比較清楚的是Ca2+/CaM依賴性的激活。Ca2+和CaM首先形成有活性的Ca2+/CaM復合體，進而結合CaMKⅡ調節(jié)域中的CaM識別區(qū)并激活CaMKⅡ，使CaMKⅡ單體構象發(fā)生改變[7]。有學者指出，CaMKⅡ是一種損傷分子，在離體灌注心臟的實驗中45 min缺血后再灌注可激活CaMKⅡ，進而增加細胞凋亡/壞死，造成收縮功能障礙，且這種作用能被CaMKⅡ的抑制劑所拮抗[8-9]；在心臟特異性敲除CaMKⅡ的小鼠，也觀察到缺血/再灌注心肌梗死面積縮小，細胞凋亡減少，改善心功能[10]。然而有文獻報道，CaMKⅡ是一種細胞保護分子，同樣在離體灌注心臟的實驗中，20 min缺血后再灌注可激活CaMKⅡ，減輕心肌頓抑，其作用可能與磷酸化肌漿網鈣泵調節(jié)分子受磷蛋白(phospholamban)有關[11]。KN-93是研究CaMKⅡ功能的重要工具藥[12-13]，本實驗觀察到： KN-93干預鈣反常處理后，心臟梗死面積顯著增大，冠脈流出液中LDH量明顯增加，提示CaMKⅡ可能具有心肌保護作用，這與Said等[11]在心肌頓抑研究中的報道一致。然而，有文獻報道，KN-93抑制鉀通道，這一作用可不依賴CaMKⅡ[14]。因而，在離體心臟鈣超載損傷中，KN-93對CaMKⅡ活性及其底物的影響有待進一步明確。綜上所述，我們觀察到CaMKⅡ抑制劑KN-93能加重急性鈣超載引起的心肌損傷，提示CaMKⅡ可能在這一過程中發(fā)揮重要作用。后續(xù)工作還需測定CaMKⅡ的活性，并探討其分子機制，這將有助于闡明缺血/再灌注損傷機制，為心肌保護提供新思路。

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Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ inhibitor KN-93 aggravates the calcium paradox-induced heart injury

KONG Ling-heng1,GU Xiao-ming2, NAN Ying1, ZHANG Jiang-ying2, SUN Na1, Zhu Juan-xia1, ZHOU Jing-jun2

(1.DeptofPhysiology,InstituteofBasicMedicine,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China2.DeptofPhysiology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

Abstract:AimTo investigate the effects of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ inhibitor KN-93 on calcium overload-induced heart injury. MethodsThirty-two isolated rat hearts were randomly divided into the control group, KN-93 control group, calcium paradox group, and calcium paradox with KN-93 treatment group. Left ventricular pressure were recorded, and the heart function was evaluated by the left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) and developed pressure (LVDP). Coronary flow (CF) were collected, and lactate dehydrogenase (LDH) content was determined. Triphenyltetrazolium chloride staining was used to measure the infarct size. ResultsCompared with the control group, KN-93 at 2.5 μmol·L-1had no effects on coronary flow, cardiac performance and cell death at the end of perfusion in normal rats (P>0.05); The hearts of calcium paradox exhibited a decrease in LVDP and CF, meanwhile an increase in LVEDP, LDH, and infarct size of 18±7.2% (P<0.01). 2.5 μmol·L-1KN-93 further increased the levels of LVEDP, LDH and infarct size (P<0.01) in Ca2+paradoxical hearts, while it provoked the decline in the CF and LVDP (P<0.01). ConclusionThe data demonstrates that KN-93 aggravates heart injury in calcium paradox, it also suggests that CaMKⅡ is involved in the Ca2+overload-induced heart injury.

Key wordscalcium overload; CaMKⅡ; KN-93; calcium; heart; myocardial injury

收稿日期：2016-01-22，修回日期：2016-03-29

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No. 31371181)；陜西省科技廳項目(No 2014JM2-8164);西安醫(yī)學院學科建設經費資助

作者簡介：孔令恒(1984-)，男，博士生，講師， Tel:029-86177559,E-mail:lhkong1984@163.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.018

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0832-05

中國圖書分類號：R-332；R322.11；R348.1；R542.202.2；R977.3；R977.6

網絡出版時間：2016-5-25 15:39網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.036.html

周京軍(1971-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：心肌保護，通訊作者，E-mail: jjzhou@ fmmu.edu.cn