球孢白僵菌與苦參堿混用對雙線卷裙夜蛾的協(xié)同增效作用

關朝陽，周國英，李 聰，劉君昂

（中南林業(yè)科技大學/南方人工林病蟲害防控國家林業(yè)局重點實驗室/森林有害生物防控湖南省重點實驗室/經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室，長沙 410004）

降香黃檀DalbergiaodoriferaT.Chen，又名降香、花梨、花梨木等，是我國海南特有種、國家二級保護植物，天然分布于島內(nèi)西南部半干旱地區(qū)，現(xiàn)在廣東、廣西、福建以及云南等地均有引種栽培，其木材在用材和藥用等方面有重要經(jīng)濟價值[1-4]。雙線卷裙夜蛾Spodopterabilinealis隸屬鱗翅目，夜蛾科，其幼蟲是珍貴樹種降香黃檀的主要食葉害蟲之一。嚴重發(fā)生時會大量取食葉片，嚴重影響降香黃檀的生長，造成其芯材累積減緩[5]。目前，主要使用化學藥劑來防治雙線卷裙夜蛾，不僅造成了環(huán)境的污染，而且使雙線卷裙夜蛾抗藥性增強，還打破了害蟲與天敵間的平衡，使得雙線卷裙夜蛾的為害日益嚴重。

球孢白僵菌寄主范圍廣泛，對鞘翅目、同翅目、鱗翅目以及螨類等諸多害蟲均能達到滿意的防治效果[6-8]。球孢白僵菌為生物防治的重要手段，能夠在自然條件下通過體壁接觸感染殺死害蟲[9-11]，具有對環(huán)境安全、人畜無害、潛伏期長等優(yōu)點，但也有殺蟲效果慢、受環(huán)境影響較大等缺點。因此許多專家學者利用低用量的殺蟲劑與蟲生真菌混配進行害蟲防治，既可使菌劑增效，又可大幅度降低化學藥劑用量，減少對環(huán)境的污染[12]。Rivero-Borja等[13]研究了球孢白僵菌和金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae與乙基毒死蜱和多殺菌素混用對草地貪夜蛾SpodopterafrugiperdaJ.E.Smith幼蟲的防治。結(jié)果表明，低濃度乙基毒死蜱和多殺菌素能夠提高球孢白僵菌和綠僵菌對草地貪夜蛾幼蟲的殺蟲效果，并減少了殺蟲劑的使用量，減少殺蟲劑對環(huán)境的影響。吳晉華等[14]利用共毒系數(shù)法研究球孢白僵菌S8與印楝素混配對草地螟Loxostegesticticalis的防效，在菌藥比為1:2時協(xié)同作用最高，共毒系數(shù)高達327.5，在田間防治中也存在顯著的增效作用。殺蟲劑與球孢白僵菌合理混用，既可提高殺蟲效果，還可以減緩化學殺蟲劑抗藥性的產(chǎn)生。

本研究通過評價六種無公害殺蟲劑對球孢白僵菌菌株HB-P-04的相容性，測定球孢白僵菌與低劑量無公害殺蟲劑對雙線卷裙夜蛾幼蟲的聯(lián)合殺蟲效果，為雙線卷裙夜蛾的田間合理用藥及抗性治理具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

球孢白僵菌菌株 HB-P-04于 2019年 9月分離自海南省?？谑谐芜~林場（110°32′51″～110°34′54″ E，21°43′42″～21°44′09″ N）的僵死蟲。由湖南省中南林業(yè)科技大學森林有害生物防控湖南省重點實驗室保存。雙線卷裙夜蛾于2020年8月在海南省澄邁縣澄邁國營林場的降香黃檀人工林間捕捉，用未施藥的降香黃檀嫩葉飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，相對濕度80%，光周期14L:10D，選取健康的3～4齡雙線卷裙夜蛾幼蟲備用。供試殺蟲劑為海南地區(qū)可購買到的常用于防治降香黃檀蟲害的無公害殺蟲劑，種類見表1。

表1 供試殺蟲劑種類信息Table 1 Types of pesticides tested

1.2 無公害殺蟲劑對菌株HB-P-04 孢子萌發(fā)、菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

將菌株HB-P-04接種于SDAY平板上培養(yǎng)7 d后獲得新鮮的孢子，血球計數(shù)板計數(shù)，含0.05%吐溫-80的無菌水配制成1.0×107孢子/mL的孢子懸浮液。六種無公害殺蟲劑用無菌水稀釋3種濃度梯度：常規(guī)推薦使用濃度（×1）、常規(guī)推薦使用濃度稀釋5倍（×5）、常規(guī)推薦使用濃度稀釋10倍（×10）。六種無公害殺蟲劑處理后的球孢白僵菌分生孢子萌發(fā)率、菌落生長及產(chǎn)孢量的測定及計算方法參照文獻[15]。

1.3 球孢白僵菌與無公害殺蟲劑對雙線卷裙夜蛾的聯(lián)合毒力

用含0.05%的吐溫-80的無菌水將苦參堿配制成5.81、11.62、23.23、58.09、116.18 mg/L，采用浸液法對雙線卷裙夜蛾進行毒力測定，將供試幼蟲放入配制好的藥液中進行浸蘸3～5 s，迅速取出放置于經(jīng)過高壓滅菌的濾紙上，使其任意爬行2～3 min，待水分晾干，然后放入無菌的塑料培養(yǎng)盒中，并以降香黃檀嫩葉為食物。每個處理設置3組重復，每組處理20只試蟲，置于培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，接種后每天觀察記錄幼蟲的死亡情況，連續(xù)觀察10 d。分別設置0.05%吐溫-80空白對照。計算苦參堿單劑對試蟲的半致死濃度LC50值。

用含0.05%的吐溫-80的無菌水將球孢白僵菌配制成濃度為1×108孢子/mL的孢子懸浮液，并將孢子懸浮液分別稀釋為1×107、1×106、1×105、1×104孢子/mL，采用浸液法對雙線卷裙夜蛾進行毒力測定，測定方法同上。每個處理設置 3組重復，每組重復接種20只試蟲，分別設置0.05%吐溫-80空白對照。計算半致死濃度LC50值。

根據(jù)試驗方法中測定的苦參堿單劑的LC50值，配置苦參堿的藥液濃度LC50稀釋液；球孢白僵菌孢子懸液濃度選定1×107孢子/mL。將苦參堿藥劑與球孢白僵菌孢子懸液按體積比9:1、4:1、1:1、1:4和1:9配置母液，再分別用無菌水稀釋成倍數(shù)濃度梯度。采用浸液法對雙線卷裙夜蛾進行毒力測定，每個處理設置3組重復，每組重復接種20只試蟲，分別設置0.05%吐溫-80空白對照。計算各組藥劑對試蟲的半致死濃度 LC50值。通過復配劑共毒系數(shù)（co-toxicity efficient，CTC）的數(shù)值判斷聯(lián)合毒力效果。

1.4 球孢白僵菌與殺蟲劑的使用順序和時間對雙線卷裙夜蛾協(xié)同作用的影響

配置苦參堿的藥液濃度LC50稀釋液；球孢白僵菌孢子懸液濃度選定1×107孢子/mL，苦參堿藥劑的濃度為28.12 mg/L，球孢白僵菌孢子懸液與苦參堿藥劑的用量體積比為1:4。設置兩組試驗，①采用浸液法對雙線卷裙夜蛾進行毒力測定，先用球孢白僵菌孢子懸液處理，間隔12 h、24 h、36 h后用苦參堿藥劑處理；②采用浸液法對雙線卷裙夜蛾進行毒力測定，先用苦參堿藥劑處理，間隔12 h、24 h、36 h后用球孢白僵菌孢子懸液處理。兩組試驗分步處理兩種藥劑的比例仍按照增效體積比配制，苦參堿處理組按照表2試驗組處理方法。

表2 球孢白僵菌與苦參堿試驗組合編號及處理方法Table 2 Number and treatment method of test combination of Beauveria bassiana and matrine

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)通過Excel 2010及SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理分析，計算均值、標準誤，并利用Ducan氏新復極差法分析各處理的差異顯著性，采用Probit回歸計算LT50、LC50。參考Sun等[16]方法測定共毒系數(shù)（co-toxicity co-efficient，CTC），以CTC 值判斷聯(lián)合毒力作用：100＜CTC＜120 表示混用劑有相加作用；≥120表示混用劑有明顯增效作用；≤100表示混用劑有拮抗作用。由χ2檢驗球孢白僵菌與苦參堿協(xié)同的交互作用類型，各個處理對雙線卷裙夜蛾的校正死亡率進行反正弦值轉(zhuǎn)化。參考Huang等[17]的方法，計算公式：Me＝Ma＋Mb(1―Ma)；χ2＝[(Mab―Me)×100]2/(Me×100)。

其中，Ma和 Mb分別是苦參堿藥劑和球孢白僵菌孢子懸浮液單獨處理雙線卷裙夜蛾的實際校正死亡率；Mab是菌藥混用對雙線卷裙夜蛾的實際校正死亡率；Me是菌藥混用對試蟲的期望死亡率；計算得出的χ2與χ2值進行比較，在χ2表格中查找df＝1對應的P值。當計算得的χ2＜P，則表示球孢白僵菌和苦參堿混用表現(xiàn)出拮抗作用；當計算得的χ2＞P，則表示球孢白僵菌和苦參堿混用表現(xiàn)出協(xié)同增效作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 無公害殺蟲劑對菌株HB-P-04 孢子萌發(fā)、菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

評估球孢白僵菌與無公害殺蟲劑的生物相容性，結(jié)果如表3所示。六種無公害殺蟲劑在試驗中的三種濃度梯度下對球孢白僵菌的孢子萌發(fā)、菌絲生長均有程度各異的抑制作用。隨著殺蟲劑稀釋倍數(shù)增加，殺蟲劑對球孢白僵菌孢子萌發(fā)、菌絲生長的抑制率逐漸降低。在推薦使用濃度下，六種無公害殺蟲劑對球孢白僵菌孢子萌發(fā)、菌絲生長的抑制率均較高。在5倍和10倍稀釋濃度下，苦參堿對球孢白僵菌孢子萌發(fā)、菌絲生長的抑制率最低。六種無公害殺蟲劑對白僵菌產(chǎn)孢量的影響結(jié)果如圖1所示。在推薦使用濃度和5倍稀釋濃度下，六種無公害殺蟲劑對球孢白僵菌產(chǎn)孢量均有不同程度的抑制作用。在10倍稀釋濃度下，苦參堿反而促進球孢白僵菌的產(chǎn)孢。綜合評價菌株HB-P-04與六種無公害殺蟲劑的生物相容性，苦參堿對球孢白僵菌的影響較小，即相容性最高。

表3 六種無公害殺蟲劑對菌株HB-P-04孢子萌發(fā)、菌絲生長的影響Table 3 Effects of six pollution-free pesticides on spore germination and hypha growth of strain HB-P-04

圖1 六種無公害殺蟲劑對菌株HB-P-04產(chǎn)孢量的影響Fig.1 The effect of six pollution-free insecticides on the spore production of strain HB-P-04

2.2 球孢白僵菌與無公害殺蟲劑對雙線卷裙夜蛾的聯(lián)合毒力

將球孢白僵菌與無公害殺蟲劑對雙線卷裙夜蛾的室內(nèi)毒力測定結(jié)果進行線性回歸分析，計算得出各藥劑的毒力回歸方程，分析結(jié)果表明，0.5%苦參堿的LC50為28.12 mg/L。低濃度的苦參堿與球孢白僵菌對雙線卷裙夜蛾的聯(lián)合毒力從表4可看出球孢白僵菌與0.5%苦參堿可溶液劑的混配劑在1:4、1:1、4:1和9:1體積配比下的共毒系數(shù)均大于 120，表明球孢白僵菌與苦參堿的混配劑對雙線卷裙夜蛾的生物防治均有不同程度的增效作用，其中球孢白僵菌與苦參堿體積比為1:4的處理組的共毒系數(shù)最高，達到223.48，有最高的聯(lián)合毒力效果，顯示出了明顯增效作用；球孢白僵菌與苦參堿的混配劑在1:9體積配比下的共毒系數(shù)接近120，顯示出混劑有相加作用，并沒有明顯的增效作用。

表4 苦參堿與球孢白僵菌對雙線卷裙夜蛾的聯(lián)合毒力Table 4 The combined virulence of matrine and B.bassiana to S.bilinealis

2.3 球孢白僵菌與殺蟲劑的使用順序和時間對雙線卷裙夜蛾的協(xié)同增效作用

球孢白僵菌與苦參堿的使用順序和時間對雙線卷裙夜蛾的協(xié)同增效作用如表5所示。其中，球孢白僵菌與苦參堿協(xié)同作用對雙線卷裙夜蛾的校正死亡率顯著高于單一使用球孢白僵菌和苦參堿。單一使用苦參堿9 d時校正死亡率為53.57%，單一使用球孢白僵菌9 d時校正死亡率為73.81%。組合T3在3 d、5 d、7 d時均表現(xiàn)為協(xié)同增效作用，組合T4在3 d、9 d時未表現(xiàn)協(xié)同增效作用，組合T5、T6在5 d、7 d、9 d時均未表現(xiàn)協(xié)同增效作用，因此組合T4、T5、T6在先使用苦參堿后再球孢白僵菌處理并不能對雙線卷裙夜蛾起到協(xié)同增效作用。組合T7在3 d、5 d、7 d時均表現(xiàn)為協(xié)同增效作用，組合T8在3 d、5 d、7 d、9 d時均表現(xiàn)為協(xié)同增效作用，而T9在除3 d之外均未表現(xiàn)協(xié)同增效作用。組合T7、T8、T9結(jié)果表明，先使用球孢白僵菌處理，間隔12 h、24 h后使用苦參堿均表現(xiàn)出不同程度的協(xié)同增效作用，其中在間隔24 h時表現(xiàn)出顯著的協(xié)同增效作用，9 d的校正死亡率為92.86%，但間隔36 h時未表現(xiàn)出協(xié)同增效作用。因此可選擇先球孢白僵菌處理，24 h后苦參堿處理的混用方法防治雙線卷裙夜蛾，以達到更好的防治效果。

表5 球孢白僵菌和苦參堿對雙線卷裙夜蛾協(xié)同作用的累計致病力Table 5 Cumulative pathogenicity of the synergistic effect of B.bassiana and matrine on S.bilinealis

2.4 球孢白僵菌與苦參堿混用對雙線卷裙夜蛾的殺蟲效果

球孢白僵菌與苦參堿混用對雙線卷裙夜蛾的殺蟲效果結(jié)果如表6所示。試驗顯示，球孢白僵菌與苦參堿體積比為1:4混用處理的9 d累計校正死亡率顯著高于球孢白僵菌單劑處理（P＜0.05）。球孢白僵菌與苦參堿體積比為1:4，先球孢白僵菌處理，24 h后苦參堿處理組的9 d累計校正死亡率顯著高于球孢白僵菌單劑處理（P＜0.05）。球孢白僵菌與苦參堿體積比為1:4混用處理的LT50為4.43，先球孢白僵菌處理，24 h后苦參堿處理的LT50為3.55，表明球孢白僵菌與苦參堿混用均可有效提高球孢白僵菌的殺蟲效果。

表6 球孢白僵菌與苦參堿混用對雙線卷裙夜蛾的致死中時Table 6 The lethal time of the mixed use of B.bassiana and matrine on S.bilinealis

3 討論

目前林間對雙線卷裙夜蛾的防治主要以化學防治為主，大量使用化學殺蟲劑會造成環(huán)境的污染，使雙線卷裙夜蛾抗藥性增強，還會打破害蟲與天敵間的平衡?？鄥A是天然的植物源殺蟲劑，具有高效、廣譜、低毒等特點[18]?；瘜W殺蟲劑與蟲生真菌混用不僅緩解了真菌侵染害蟲較慢的特點，縮短殺蟲時間，提高殺蟲效率；而且減緩害蟲抗性的升高，大大減少了化學污染[19]。本文在選擇合理混用的殺蟲劑時，選擇了與球孢白僵菌相容性高的苦參堿，低濃度處理對球孢白僵菌孢子萌發(fā)、菌絲生長及產(chǎn)孢影響較小，相容性良好，使苦參堿和球孢白僵菌能夠發(fā)揮更好的防治優(yōu)勢。當球孢白僵菌與苦參堿體積比為1:4時的共毒系數(shù)最高，達到223.48，有最高的聯(lián)合毒力效果，顯示出了顯著的增效作用。在球孢白僵菌與苦參堿的使用順序和時間對雙線卷裙夜蛾協(xié)同作用影響的試驗中表明，先球孢白僵菌處理，間隔24 h后苦參堿處理的混用方案表現(xiàn)出顯著的協(xié)同增效作用，9 d的校正死亡率為92.86%。在室內(nèi)毒力試驗中，球孢白僵菌對雙線卷裙夜蛾顯示出良好的殺蟲效果，以球孢白僵菌與苦參堿混用對雙線卷裙夜蛾的殺蟲效果更佳。同時不論是球孢白僵菌與苦參堿以體積比1:4混用，還是先球孢白僵菌處理，間隔24 h后苦參堿處理的混用方案，都能有效地縮短殺蟲時間，提高殺蟲效率。

理論上，殺蟲劑的使用能夠降低害蟲的免疫力，為球孢白僵菌在蟲體寄生提供條件[20-22]。在聯(lián)合毒力的測定中，苦參堿與球孢白僵菌的最佳配比為體積比4:1。胡安嶺等[23]研究了昆蟲生長調(diào)節(jié)劑氟鈴脲與球孢白僵菌防治甜菜夜蛾的最佳配比的體積比也為 4:1。但很少有研究探討殺蟲劑與蟲生真菌的使用順序和時間間隔對試蟲協(xié)同作用的影響。Meyling等[24]研究了球孢白僵菌KVL03-122與擬除蟲菊酯類殺蟲劑高效氯氟氰菊酯在不同時間間隔和使用順序下對黃粉蟲Tenebriomolitor的殺蟲效果。結(jié)果表明，先使用球孢白僵菌后使用高效氯氟氰菊酯時，僅在用藥間隔大于48 h時才有協(xié)同作用。Furlong等[25]研究了球孢白僵菌與亞致死劑量吡蟲啉和環(huán)丙氨嗪的殺蟲劑在科羅拉多馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata(Say)幼蟲上的協(xié)同作用。使用亞致死劑量的吡蟲啉和一定劑量的球孢白僵菌處理馬鈴薯甲蟲幼蟲時，顯示出協(xié)同作用；當先使用吡蟲啉處理24 h后噴施球孢白僵菌分生孢子時，表現(xiàn)出協(xié)同增效作用。殺蟲劑與蟲生真菌同時混配應用也許不是唯一的協(xié)同增效方案，殺蟲劑與蟲生真菌的使用順序和時間間隔也會影響對害蟲的協(xié)同作用。因此利用低用量的殺蟲劑與蟲生真菌混用進行害蟲防治，進而提高防治效率，是克服或緩解害蟲抗藥性的有效途徑之一。