瘤胃源酵母的分離篩選及對不同底物發(fā)酵能力影響

王曉成，劉軍花，朱偉云，毛勝勇（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

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瘤胃源酵母的分離篩選及對不同底物發(fā)酵能力影響

王曉成，劉軍花，朱偉云，毛勝勇*
（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

本實(shí)驗(yàn)旨在分離篩選瘤胃源酵母，研究其對不同飼料底物的發(fā)酵特性。實(shí)驗(yàn)以山羊及奶牛瘤胃液為菌源，利用酵母選擇性培養(yǎng)基，通過分離篩選、生長曲線測定和26S rD N A鑒定，獲得1株生長速度較快的Meyerozyma屬酵母菌株。在此基礎(chǔ)上，采用體外發(fā)酵技術(shù)，分別以羊草與精料混合物、馬鈴薯淀粉和玉米淀粉為底物，以奶牛瘤胃液為接種物，研究該酵母菌株對瘤胃微生物體外發(fā)酵參數(shù)的影響。結(jié)果表明，在以羊草和精料混合物為底物時(shí)，添加瘤胃源酵母顯著降低了發(fā)酵液p H和乳酸濃度（P＜0.001），顯著提高了丙酸濃度和干物質(zhì)消失率（P＜0.05）；以玉米淀粉為底物時(shí)，添加該酵母菌顯著降低了發(fā)酵液p H和乳酸濃度（P＜0.001）；以馬鈴薯淀粉為底物時(shí)，顯著降低了p H（P＜0.05），提高了丙酸濃度（P＜0.05）；但在上述3種底物條件下，添加酵母菌對發(fā)酵液中總產(chǎn)氣量、氨態(tài)氮、乙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸濃度無顯著影響（P＞0.05）。采用Real-tim e PC R測定結(jié)果表明，添加該酵母菌可顯著提高以羊草和馬鈴薯淀粉為底物時(shí)發(fā)酵液中總菌16S rD N A的挎貝數(shù)（P＜0.05）。結(jié)果說明，本研究分離獲取的瘤胃源酵母可提高瘤胃微生物對羊草精料混合物的降解能力，降低羊草精料混合物組和玉米淀粉組發(fā)酵液中乳酸濃度，提示該菌株可能具有提高日糧消化利用效率、促進(jìn)丙酸生成和瘤胃細(xì)菌生長的作用。

酵母；瘤胃；分離；體外發(fā)酵

http://cyxb.lzu.edu.cn

王曉成，劉軍花，朱偉云，毛勝勇.瘤胃源酵母的分離篩選及對不同底物發(fā)酵能力影響.草業(yè)學(xué)報(bào)，2016，25（5）：141-148.

W A N G Xiao-Cheng，LIU Jun-H ua，Z H U W ei-Y un，M A O Sheng-Yong.Isolation and characterization of ru m en yeast and an evaluation ofits effect on ru minal ferm entation with different types of substrate.Acta Prataculturae Sinica，2016，25（5）：141-148.

在當(dāng)前反芻動物生產(chǎn)中，為提高奶牛的產(chǎn)奶量，養(yǎng)殖者常在奶牛日糧中使用高比例精料，但這種飼喂方式常導(dǎo)致奶牛瘤胃中乳酸濃度增加，瘤胃微生物功能紊亂。研究表明，相對于瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸而言，乳酸的電離度更大，因此，其更容易引發(fā)瘤胃p H降低［1］。為防止瘤胃中乳酸累積和瘤胃微生物功能失衡，人們常采用添加酵母培養(yǎng)物或乳酸利用菌等方式來降低瘤胃乳酸濃度，使瘤胃微生物功能恢復(fù)正常。一些研究表明，添加活性酵母菌可提高干物質(zhì)和中性洗滌纖維的降解率［2-3］，提高奶產(chǎn)量［2］；Chaucheyras等［4］發(fā)現(xiàn)，酵母培養(yǎng)物可促進(jìn)瘤胃乙酸菌對氫的利用；促進(jìn)瘤胃總細(xì)菌和纖維降解菌數(shù)量的增長，加強(qiáng)反芻獸新月單胞菌對乳酸的利用，顯著提高丙酸含量［5-7］。但也有一些報(bào)道顯示，添加酵母對奶牛瘤胃發(fā)酵無顯著影響。如那日蘇等［8］報(bào)道，添加酵母培養(yǎng)物對育肥羊體重、瘤胃p H和揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，V F A）含量沒有顯著影響；New bold等［5］發(fā)現(xiàn)，體外發(fā)酵中添加酵母對p H、丙酸、乙酸和總揮發(fā)性脂肪酸濃度均無顯著影響。由此，這些研究提示，酵母菌對奶牛瘤胃發(fā)酵的影響結(jié)果并不一致。分析其原因，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)前養(yǎng)殖生產(chǎn)中所用酵母培養(yǎng)物或活酵母生產(chǎn)菌株主要分離自外界環(huán)境。實(shí)際上，源自消化道外的酵母菌的最適生存環(huán)境可能與瘤胃環(huán)境并不一致，這種生存環(huán)境的不一致可能直接影響其在動物消化道內(nèi)的生長速度與作用效果，這也許是當(dāng)前生產(chǎn)中所用活酵母或酵母培養(yǎng)物在奶牛等反芻動物生產(chǎn)中的應(yīng)用效果不穩(wěn)定的主要原因之一。相對而言，利用源于動物消化道內(nèi)的微生物，可能避免以上應(yīng)用效果不穩(wěn)定的問題。由此，本論文擬分離篩選瘤胃源性酵母，并通過體外發(fā)酵技術(shù)，研究其對瘤胃微生物發(fā)酵參數(shù)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)及瘤胃液的獲取

本實(shí)驗(yàn)于2013年12月至2014年6月進(jìn)行。分離酵母的瘤胃液采自于3頭裝有永久性瘤胃瘺管的干奶期奶牛（體重為590±48 kg，干物質(zhì)采食量為12 kg/d，日糧精粗比為2∶8）及4頭裝有永久性瘤胃瘺管的波雜山羊（平均體重27±3 kg，干物質(zhì)采食量為850 g，全粗料）的瘤胃液為菌源。體外研究瘤胃源酵母對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響的實(shí)驗(yàn)中所用接種瘤胃液采自上述奶牛。奶牛與山羊皆單欄飼喂，自由飲水。

1.2 培養(yǎng)基成分及其配制

酵母浸出物3 g（購自奧博星公司），麥芽提取物3 g（購自奧博星公司），蛋白胨5 g（購自奧博星公司），葡萄糖10 g（購自奧博星公司），瓊脂20 g（購自奧博星公司），鏈霉素0.1 g（購自Sig m a公司），加蒸餾水至1 L，115℃高溫滅菌15 min，待培養(yǎng)基溫度降至60℃后，制備平板備用［9］。酵母浸出物麥芽糖液體培養(yǎng)基組成：酵母浸出物3 g，麥芽浸出物3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，鏈霉素0.1 g，加蒸餾水至1 L，115℃高溫滅菌15 min。乳酸液體培養(yǎng)基：酵母抽取物3 g，麥芽抽取物3 g，蛋白胨5 g，乳酸7.5 g（購自國藥集團(tuán)），鏈霉素0.1 g，加蒸餾水至1 L，115℃高溫滅菌15 min。

1.3 瘤胃源酵母菌的分離純化

實(shí)驗(yàn)當(dāng)日，于飼喂前分別從奶?；蛏窖蛄鑫父鼓蚁虏砍槿×鑫敢?，將瘤胃液經(jīng)3層紗布過濾。取1 m L過濾所得的瘤胃液進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋至10，100和1000倍的瘤胃液進(jìn)行平板涂布，將培養(yǎng)基放入39℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后取出培養(yǎng)基，挑取形態(tài)、顏色等不同單菌落進(jìn)行反復(fù)純化，至所獲菌株的形態(tài)完全一致后保存?zhèn)溆茫?］。

1.4 酵母菌的篩選

將分離出的酵母菌株置于含一定濃度乳酸的培養(yǎng)基中，39℃培養(yǎng)24 h后，通過測定培養(yǎng)基中乳酸含量，計(jì)算酵母對乳酸的利用能力，將乳酸利用率較高的菌株放入液體培養(yǎng)基中39℃培養(yǎng)24 h，在波長為600 n m下測定其生長曲線，最終篩選出生長較快的疑似酵母菌株［9］。

1.5 酵母菌的鑒定

將分離到的疑似菌經(jīng)體外培養(yǎng)24 h后，收集菌體用于D N A提取，D N A提取參照M urray等［10］的方法。所用引物序列如下：上游引物N L-1（5′-G C A T A T C A A T A A G C G G A G G A A A A G-3′），下游引物N L-4（5′-G G T CC G T G T T T C A A G A C G G-3′）。P C R擴(kuò)增體系為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃修復(fù)延伸10 min。通過1%瓊脂糖電泳，150 V、100 m A下20 min電泳觀察，P C R產(chǎn)物電泳條帶切割所需D N A目的條帶，P C R產(chǎn)物送至上海生工有限公司測序。測序結(jié)果通過B L A S T數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，再用M A G A（6.0）軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 體外法測定瘤胃源菌株對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

1.6.1 厭氧培養(yǎng)基制備 培養(yǎng)基成分：292 m g/L K2H P O4，240 m g/L K H2P O4，480 m g/L（N H4）2S O4，480 m g/L NaCl，100 m g/L M gS O4·7 H2O，64 m g/L CaCl2·H2O，4000 m g/L Na2C O3，600 m g/L半胱氨酸鹽酸鹽。將上述組分溶于1 L去離子水中，混合后通入飽和二氧化碳至完全厭氧［11-12］。

1.6.2 實(shí)驗(yàn)分組與瘤胃液接種 實(shí)驗(yàn)分別以羊草精料混合物、玉米淀粉和馬鈴薯淀粉為底物，在各底物條件下，分別按酵母添加量為0，0.625×107，1.250×107和2.500×107C F U/m L設(shè)為4組，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)另設(shè)16個(gè)添加羊草精料混合物的發(fā)酵瓶，用于底物干物質(zhì)消化率的測定。

試驗(yàn)開始前，準(zhǔn)確稱取266 m g羊草精料混合物（羊草∶精料＝6∶4，精料由玉米與豆粕組成，比例為7∶3，羊草、玉米與豆粕均經(jīng)粉碎、過篩和烘干處理）、玉米淀粉和馬鈴薯淀粉于100 m L發(fā)酵瓶中。于晨飼前經(jīng)瘤胃瘺管分別從奶牛腹囊下部抽取瘤胃內(nèi)容物，經(jīng)3層紗布過濾。將所得瘤胃液與厭氧培養(yǎng)基按1∶2混合，取混合厭氧培養(yǎng)基40 m L厭氧條件下分裝至上述已裝入底物的并提前預(yù)熱至39℃的發(fā)酵瓶中后，各發(fā)酵瓶經(jīng)橡膠塞密封、鋁蓋封口和平衡氣壓后，迅速放入39℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)期間，分別于接種后2，4，6，8，12，24 h采用氣壓轉(zhuǎn)換儀測定各發(fā)酵瓶中的總產(chǎn)氣量。發(fā)酵結(jié)束后立即測定各發(fā)酵瓶中發(fā)酵液的p H值，同時(shí)冰浴終止發(fā)酵，隨后取樣備測氨態(tài)氮和乳酸等指標(biāo)。另將16個(gè)添加羊草精料混合物的發(fā)酵瓶轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃下10000 r/min離心15 min，105℃烘干測定干物質(zhì)消失率。

1.6.3 發(fā)酵液D N A提取 取發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液1 m L，采用珠磨法，參照M urray等［10］的方法提取瘤胃微生物總D N A。

1.6.4 Real-tim e P C R法定量總菌數(shù)量 參照K onstantinov等［13］的方法，利用iCycler IQ real-tim e檢測系統(tǒng)及配套軟件（iCycler optical syste m interface software version 2.3）進(jìn)行Real-tim e P C R分析。P C R反應(yīng)體系為20μL：S Y B R Green Supermix（Bio-Rad，美國）10.4μL，上、下游引物（25μm ol/L）各0.4μL、D N A樣品2μL、超純水6.8μL。引物為1369F（5′-C G G T G A A T A C G T T C Y C G G-3′）和1492 R（5′-G G W T A C C T T G T T A C G A C T T-3′），反應(yīng)條件參照Su等［14］的方法。

1.7 指標(biāo)測定

p H的測定采用手持型p H計(jì)；產(chǎn)氣量測定參照T heodorou等［15］的方法；氨態(tài)氮測定參照馮宗慈和高民［16］的方法；揮發(fā)性脂肪酸測定參照秦為琳［17］的方法。

乳酸的測定采用試劑盒法（購自南京建成生物工程研究所），按照試劑盒說明書，分別向空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管中相對應(yīng)地加入0.02 m L蒸餾水、3 m m ol/L標(biāo)準(zhǔn)液和待測樣品，然后均加入1 m L酶工作液和0.2 m L顯色劑，混勻后置于37℃水浴鍋中準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，再分別加入2 m L終止液，混勻，用空白管調(diào)零，在530 n m波長、1 c m光徑下分別測各管吸光度值。乳酸的計(jì)算公式如下：

瘤胃液中乳酸含量（m m ol/L）＝（測定O D值－空白O D值）/（標(biāo)準(zhǔn)O D值－空白O D值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（3 m m ol/L）×樣品測試前稀釋倍數(shù)

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel（2010）初步處理后，采用SPSS（20.0）統(tǒng)計(jì)軟件中的O ne-way A N O V A分析，顯著性水平置于0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃源酵母的富集與分離純化

采用涂板劃線分離法，大量挑取形態(tài)與顏色不同的菌落，經(jīng)連續(xù)分離純化，最終從奶牛瘤胃液中分離出30株疑似酵母菌株，從山羊瘤胃液中分離出64株疑似酵母菌株，共計(jì)94株。如圖1所示，對分離菌株進(jìn)行乳酸利用率試驗(yàn)，結(jié)果共獲得14株乳酸利用率相對較高的疑似酵母菌株。對上述14株菌進(jìn)行生長速率測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中6株菌生長速率較低，另外9株生長速率相對較快（圖2）。結(jié)合生長速率與乳酸利用率數(shù)據(jù)結(jié)果，最終篩選到1株乳酸利用率較高及生長速度較快的疑似酵母菌株，編號為Y09。

圖2 分離酵母的生長曲線Fig.2 Growth curve of isolates

2.2 菌株鑒定

圖3 Y09號酵母菌形態(tài)（×400）Fig.3 M orphological characterization of isolates Y09

2.2.1 菌落及菌體形態(tài)的觀察 將Y09號菌在麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h后，菌落呈乳白色，棋子狀突起，邊緣整齊，表面無光澤，菌落松軟濕潤，發(fā)酵產(chǎn)物呈酒香味；在麥芽汁液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)時(shí)，有菌環(huán)，沉淀，液體澄清。400倍光學(xué)顯微鏡下顯示該菌為橢圓狀，細(xì)胞多為單個(gè)或成對出現(xiàn)，出芽生殖（圖3）。2.2.2 Y09號酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 采用B L A S T軟件，將該菌擴(kuò)增序列與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比較（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Y09號菌與Meyerozyma屬的相似性達(dá)100%，故將該菌歸屬于Meyerozyma屬酵母菌。該菌序列已提交GenBank，序列號為K P797883.1。

2.3 體外法評定添加Y09號瘤胃源酵母對3種不同底物發(fā)酵參數(shù)的影響

2.3.1 添加Y09號酵母菌對羊草精料混合物為底物時(shí)瘤胃微生物體外發(fā)酵參數(shù)的影響 與對照組相比，當(dāng)以羊草精料混合物為底物時(shí)，添加活酵母顯著降低了發(fā)酵液p H和乳酸含量（P＜0.001）（表1），顯著提高了（P＜0.05）丙酸濃度、總菌數(shù)和干物質(zhì)消失率，其中酵母添加量為0.625×107C F U/m L組的p H降低了2%，酵母菌添加量為2.500×107C F U/m L組的乳酸濃度降低了25%，丙酸濃度提高了6%，總菌數(shù)提高了31%，干物質(zhì)消失率提高了17%；但添加酵母對氨態(tài)氮濃度、總產(chǎn)氣量、乙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸濃度與乙丙比無顯著影響（P＞0.05）。隨酵母添加量的逐漸增加，添加酵母對p H的影響呈線性和二次方效應(yīng)（P＜0.001），但對乳酸、丙酸濃度和底物干物質(zhì)消失率僅呈線性效應(yīng)（P＜0.05）。

圖4 篩選酵母26S rD N A系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建Fig.4 Phylogenetic tree of 26S rD N A sequence of isolate

表1 以羊草精料混合物為底物時(shí)添加瘤胃源酵母對瘤胃微生物體外發(fā)酵參數(shù)的影響Table 1 Effect of live yeast addition on invitro fermentation with mixture of chinese wildrye and concentrate as substrate

2.3.2 添加Y09號酵母菌對以玉米淀粉為底物時(shí)瘤胃微生物體外發(fā)酵參數(shù)的影響 與對照組相比，當(dāng)以玉米淀粉為底物時(shí)，添加活酵母顯著降低了發(fā)酵液p H和乳酸含量（P＜0.001）（表2），其中2.500×107C F U/m L組的發(fā)酵液p H值降低了3%，乳酸濃度降低了76%；但對總產(chǎn)氣量、氨態(tài)氮、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸濃度、總菌數(shù)和乙丙比無顯著影響（P＞0.05）。隨酵母添加量的逐漸增加，添加酵母對發(fā)酵液p H和乳酸濃度的影響呈線性效應(yīng)（P＜0.001）。

2.3.3 添加Y09號酵母菌對以馬鈴薯淀粉為底物時(shí)瘤胃微生物體外發(fā)酵參數(shù)的影響 以馬鈴薯淀粉為底物時(shí)，與對照組相比，添加活酵母顯著降低了發(fā)酵液p H（P＜0.05）（表3），提高了丙酸濃度和總菌數(shù)量（P＜0.05），其中，酵母添加量為2.500×107C F U/m L組的發(fā)酵液p H降低了1%，丙酸提高了9%，總菌數(shù)提高了19%；但添加酵母未顯著影響總產(chǎn)氣量、氨態(tài)氮、乳酸、乙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸濃度（P＞0.05）。隨酵母添加量的逐漸增加，添加酵母對發(fā)酵液p H和丙酸濃度的影響呈線性效應(yīng)（P＜0.05）。

表2 以玉米淀粉為底物時(shí)添加酵母對瘤胃微生物體外發(fā)酵參數(shù)的影響Table 2 Effect of live yeast addition on invitro fermentation with corn starch as substrates

表3 以馬鈴薯淀粉為底物時(shí)添加酵母對瘤胃微生物體外發(fā)酵參數(shù)的影響Table 3 Effect of yeast addition on invitro fermentation with potato starch as substrate

3 討論

研究表明，在反芻動物飼料中添加活酵母或酵母培養(yǎng)物可改善瘤胃內(nèi)環(huán)境、調(diào)整菌群結(jié)構(gòu)以及提高日糧纖維消化率［18］；同時(shí)，一些報(bào)道顯示，添加酵母還可顯著提高瘤胃內(nèi)乳酸的利用速度，降低瘤胃乳酸濃度［11］。本研究從山羊及奶牛瘤胃中分離獲得了14株酵母菌，通過乳酸利用和生長速度比較實(shí)驗(yàn)，篩選到一株乳酸利用率較高且生長速度較快的酵母菌株。該酵母菌對乳酸的利用率可達(dá)69.92%，說明其對乳酸具有較強(qiáng)的代謝能力。同時(shí)體外試驗(yàn)也表明，添加所分離的酵母菌顯著降低了羊草精料組和玉米淀粉組發(fā)酵液中的乳酸濃度，該結(jié)果進(jìn)一步說明，所分離酵母具有利用乳酸的能力。我們在以前的研究中發(fā)現(xiàn)，瘤胃中的一些乳酸利用菌具有利用乳酸生成丙酸的能力［19］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的報(bào)道結(jié)果，我們認(rèn)為，在瘤胃微生物區(qū)系中，除瘤胃細(xì)菌具有利用乳酸的能力外，瘤胃內(nèi)的酵母等部分微生物也具有代謝乳酸的能力，這些結(jié)果顯示，瘤胃微生物可能通過多類微生物代謝利用乳酸。

瘤胃p H是衡量瘤胃發(fā)酵程度的一項(xiàng)重要參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加瘤胃源酵母顯著降低了3種底物下發(fā)酵液的p H值，由于p H值是反映瘤胃酸度的一個(gè)重要指標(biāo)，p H值降低暗示瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)物尤其是揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量增加，但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加酵母并未顯著影響揮發(fā)性脂肪酸濃度，僅在數(shù)字上提高了總揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)量。該結(jié)果與Chung等［20］報(bào)道基本一致，其在研究中也發(fā)現(xiàn)，添加酵母可影響奶牛瘤胃p H值，但并未顯著影響瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸濃度。本研究顯示，添加酵母對羊草、玉米淀粉和馬鈴薯淀粉3種底物下乳酸濃度的影響并不一致。其中對以玉米淀粉組影響最大、羊草精料混合組次之，而對馬鈴薯淀粉組無顯著影響。該結(jié)果說明，酵母對瘤胃微生物發(fā)酵參數(shù)的影響具有底物特異性。To m ankova和H o m olka［21］報(bào)道，較其他谷物類飼料比較，玉米淀粉的瘤胃降解速率相對較低，其原因與玉米淀粉相對較低的溶解度及較低比例的支鏈淀粉有關(guān)。本試驗(yàn)中，玉米淀粉處理組中未添加酵母組的發(fā)酵液p H值相對高于馬鈴薯組，其原因可能與玉米淀粉的較低發(fā)酵速率有關(guān)。由于相對較高的p H值及較低的底物發(fā)酵速率有利于瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及功能發(fā)揮，因此，玉米淀粉組發(fā)酵液中乳酸濃度顯著下降可能該底物下乳酸利用菌群的活力較高有關(guān)。另一方面，較玉米淀粉與馬鈴薯淀粉等單一原料為底物時(shí)比較，羊草與精料混合物組發(fā)酵液p H值更高，而高p H值有利于瘤胃乳酸利用菌生長并發(fā)揮作用，這也可能是該底物條件下乳酸濃度較低的主要原因之一。

在瘤胃中，丙酸主要通過兩條途徑生成，一為乳酸經(jīng)琥珀酸途徑生成丙酸，另一方面是經(jīng)丙烯酸途徑生成。本研究發(fā)現(xiàn)，添加活酵母顯著提高了羊草精料混合組發(fā)酵液中丙酸濃度，該結(jié)果與乳酸濃度降低相對應(yīng)，結(jié)果說明，在以羊草精料混合物為底物時(shí)，添加9號酵母可能有利于瘤胃微生物發(fā)酵乳酸生成丙酸。但本研究發(fā)現(xiàn)，添加酵母雖未顯著影響馬鈴薯淀粉組發(fā)酵液中乳酸濃度，但顯著提高了丙酸濃度。我們推測，以馬鈴薯淀粉為底物時(shí)，發(fā)酵液中丙酸濃度顯著升高可能與添加酵母影響了丙烯酸途徑相關(guān)菌群的組成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，添加酵母對3種不同底物條件下發(fā)酵液中總菌數(shù)均有不同程度的提高，其中對以羊草和精料混合物為底物時(shí)的作用效果更明顯。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，添加瘤胃源酵母菌顯著促進(jìn)了羊草精料混合物組的瘤胃降解率，該結(jié)果也與Lila等［11］的報(bào)道一致。這些結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)，添加酵母可影響瘤胃微生物的生長與功能。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從奶牛和山羊瘤胃液中分離到94株疑似酵母菌，基于乳酸利用率和生長參數(shù)，篩選獲得1株乳酸利用率較高及生長速率較快的酵母菌，基因比對表明，該酵母菌屬于Meyerozyma屬。體外試驗(yàn)表明，添加酵母可顯著提高羊草精料混合物的底物降解率，降低羊草精料混合物組和玉米淀粉組中的乳酸濃度，提高羊草精料混合物組和馬鈴薯淀粉組發(fā)酵液中丙酸含量以及發(fā)酵液中總菌數(shù)。結(jié)果說明，所篩選的瘤胃酵母菌具有影響瘤胃微生物發(fā)酵的作用，但影響程度和作用效果與底物類型相關(guān)。

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Isolation and characterization of ru men yeast and an evaluation of its effect on ru mi-nal fermentation with different types of substrate

W A N G Xiao-Cheng，LIU Jun-H ua，Z H U W ei-Y un，M A O Sheng-Y ong*
The College of Animal Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China

T his study was conducted to isolate ru m en yeast and evaluate its possible role in changing ferm entation characteristics by using in vitro ferm entation with three different substrates.A yeast strain with a fast growth rate belonging to the Meyerozyma genus was isolated through screening，growth curve determination and identification of 26S rD N A using a selective m ediu m of yeast co m posed of goat and dairy cow ru minalfluid.T he effect of thisisolated culture on ru minalferm entation was evaluated with three substrates：Chinese wildrye plus concentrate mixture，potato starch and corn starch.Ru minal fluid fro m dairy cattle was used as an inoculant.T he results showed that with the Chinese wildrye plus concentrate mixture as substrate，yeast addition decreased ru minal p H and the concentration of lactic acid（P＜0.001），w hile it increased the concentration of propionic acid and the digestibility of dry m atter（P＜0.05）.T he addition of yeast decreased ru minal p H and lactic concentration（P＜0.001）in the corn starch substrate.M oreover，the addition of yeast culture decreasedru minal p H（P＜0.05）and increased the concentration of propionic acid（P＜0.05）.H owever，total gas production and concentrations of a m m onia-N，acetic acid，butyric acid，isobutyric acid，valeric acid and isovaleric acid were not affected（P＞0.05）by yeast addition in the three substrate groups.T he real-tim e P C R data showed that isolate addition increased the nu m ber of total bacteria in the Chinese wildrye plus concentrate and potato starch substrates.Results indicate that the ru m en yeastisolates can im prove the ru m en’s dietary degradation capability and reduce lactic acid levels for the Chinese wildrye plus concentrate and corn starch substrates.T his suggests that the yeastisolates could im prove digestibility efficiency in ways that enhance the propionate production and the growth of ru minal bacteria.

yeast；ru m en；isolation；ferm entation in vitro

.E-m ail：m aoshengyong＠163.com

10.11686/cyxb2015348

2015-07-15；改回日期：2015-10-12

奶業(yè)“973”項(xiàng)目子課題（2011 C B100801）資助。

王曉成（1991-），男，江蘇南京人，在讀碩士。E-m ail：2013105055＠njau.edu.cn