高谷物日糧對山羊小腸發(fā)酵、腸道結(jié)構(gòu)和微生物菌群數(shù)量的影響研究

薛春旭，葉慧敏，馮泮飛，劉軍花，毛勝勇（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

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高谷物日糧對山羊小腸發(fā)酵、腸道結(jié)構(gòu)和微生物菌群數(shù)量的影響研究

薛春旭，葉慧敏，馮泮飛，劉軍花，毛勝勇*
（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

本試驗(yàn)旨在研究高谷物日糧對山羊小腸微生物發(fā)酵、上皮組織形態(tài)及微生物菌群數(shù)量的影響。采用隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將12頭山羊隨機(jī)分為兩組，即全干草組（只飼喂粗飼料）和高谷物組（75%精料和25%粗飼料混合飼喂），每組6頭，試驗(yàn)期為6周，試驗(yàn)結(jié)束后屠宰取小腸內(nèi)容物及組織樣品用于相關(guān)分析。結(jié)果表明，1）與干草組相比，飼喂高谷物日糧顯著提高了空腸內(nèi)容物中總揮發(fā)性脂肪酸（P＝0.015）、丙酸（P＝0.008）、丁酸（P＝0.004）、異丁酸濃度（P＝0.035），降低了乳酸濃度（P＝0.008），但對p H值、乙酸、戊酸、異戊酸濃度及L PS含量無顯著性影響（P＞0.05）。與干草組相比，飼喂高谷物日糧顯著提高了回腸內(nèi)容物的總揮發(fā)性脂肪酸（P＝0.007）、丙酸（P＝0.013）、丁酸（P＝0.008）、戊酸（P＜0.001）、乳酸濃度（P＝0.008）以及脂多糖含量（P＜0.001），降低了p H值（P＝0.005），但對乙酸、異丁酸和異戊酸濃度無顯著影響（P＞0.05）；2）與干草組相比，高谷物日糧組山羊的十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度和隱窩深度均顯著升高（P＜0.001）；空腸絨毛高度與隱窩深度的比值顯著降低（P＝0.024）；電鏡結(jié)果表明，高谷物組空腸和回腸緊密連接受到破壞；3）與干草組相比，高谷物日糧組山羊回腸黏膜中堿性磷酸酶活性顯著提高（P＜0.05），但對空腸黏膜中堿性磷酸酶活性無顯著影響（P＞0.05）；4）Real-tim e PC R定量分析表明，與干草對照組相比，高谷物日糧山羊回腸擬桿菌門16S rR N A基因拷貝數(shù)顯著降低（P＝0.037），厚壁菌門與擬桿菌門細(xì)菌數(shù)量比值顯著升高（P＜0.001），但對厚壁菌門細(xì)菌基因拷貝數(shù)無顯著影響（P＞0.05）；空腸中擬桿菌門基因拷貝數(shù)、厚壁菌門基因拷貝數(shù)以及厚壁菌門與擬桿菌門細(xì)菌數(shù)量比值無顯著變化（P＞0.05）。結(jié)果說明，飼喂高谷物日糧對回腸上皮組織形態(tài)及回腸微生物發(fā)酵具有顯著影響，對其健康可能有不利影響。

高谷物日糧；小腸；緊密連接；堿性磷酸酶；微生物

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薛春旭，葉慧敏，馮泮飛，劉軍花，毛勝勇.高谷物日糧對山羊小腸發(fā)酵、腸道結(jié)構(gòu)和微生物菌群數(shù)量的影響研究.草業(yè)學(xué)報(bào)，2016，25（5）：175-183.X U E Chun-Xu，Y E H ui-Min，F(xiàn) E N G Pan-Fei，LIU Jun-H ua，M A O Sheng-Yong.T he effect of high-grain diets on sm all intestinal ferm entation，m orphological structure and microbial flora in goats.Acta Prataculturae Sinica，2016，25（5）：175-183.

在現(xiàn)代規(guī)模化、集約化牛羊養(yǎng)殖過程中，生產(chǎn)者為追求最大程度經(jīng)濟(jì)效益，常在動物飼料中使用高比例谷物原料，但大量使用高谷物日糧在提高動物生產(chǎn)性能的同時(shí)，也引發(fā)了一些營養(yǎng)代謝疾病如瘤胃酸中毒。近年來，研究者已對瘤胃酸中毒的致病機(jī)制和潛在危害做了大量研究。相關(guān)報(bào)道顯示，瘤胃酸中毒可改變瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)與組成［1］，致瘤胃p H值下降、揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，V F A）累積，瘤胃內(nèi)脂多糖（lipopolysaccharide，L PS）和生物胺的濃度顯著增加［2-3］，致瘤胃上皮屏障損傷；同時(shí)大量可發(fā)酵碳水化合物進(jìn)入后腸，還可引發(fā)后腸酸中毒［4］。因此，這些結(jié)果暗示，長期飼喂高谷物日糧可使反芻動物瘤胃與后腸健康受損。

小腸是動物消化道重要的生理器官，其功能包括兩方面：一是接收來自胃初步消化的營養(yǎng)物質(zhì)，起到容器作用；二是將初步消化的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)一步消化分解成小分子物質(zhì)，通過腸黏膜上皮細(xì)胞吸收進(jìn)入血液和淋巴。因此，維持小腸的正常結(jié)構(gòu)與功能對于動物健康至關(guān)重要。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高谷物日糧除影響山羊瘤胃功能外，瘤胃中未經(jīng)消化的過量精料進(jìn)入小腸后，也可能對小腸的生理結(jié)構(gòu)與小腸微生物發(fā)酵造成不利影響。然而，當(dāng)前該領(lǐng)域的研究工作主要集中于飼喂高谷物日糧對山羊前胃與后腸發(fā)酵及其上皮健康的影響，有關(guān)高谷物日糧對山羊小腸消化生理的影響尚不清楚。因此，本研究以山羊?yàn)檠芯繉ο?，探究了高谷物日糧對山羊小腸上皮形態(tài)學(xué)變化、堿性磷酸酶活性及微生物菌群的影響，擬進(jìn)一步豐富人們對高谷物日糧影響動物健康的理論認(rèn)識。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)于2014年12月到2015年3月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用12頭體重相近、安裝有永久性瘤胃瘺管的健康南京本地山羊［（28.4±3.0）kg］，單欄飼養(yǎng)，自由飲水。采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將12只山羊分為兩組，即飼喂全干草組（100%粗飼料）以及高谷物組（75%高精料+ 25%的粗飼料），每組6頭，試驗(yàn)期為6周。飼糧供給量按體重的3.5%計(jì)算，預(yù)設(shè)為1.05 kg，精料和粗飼料分開飼喂，每天飼喂兩次（分別為8：00和17：00），每次等量飼喂。干草與高谷物組的飼料原料組成以及營養(yǎng)水平見表1。

表1 日糧組成與營養(yǎng)水平（D M基礎(chǔ)）Table 1 Ingredients and nutrient composition of the experimental diets（D M basis）

1.2 樣品采集

在實(shí)驗(yàn)期第42天，晨飼前屠宰取十二指腸、空腸和回腸黏膜樣，用冰磷酸緩沖液清洗干凈后，分成3部分，其中一部分立即凍存于液氮中，用于堿性磷酸酶活性測定；另一部分用2.5%戊二醛固定，用于掃描和透射電鏡觀察；其他部分用4%多聚甲醛固定，用于石蠟切片。屠宰后立即取空腸和回腸內(nèi)容物，各部分分別混合均勻后，分別測定內(nèi)容物p H值，另取部分按1∶1的重量比與去離子水混合，5000 r/min下離心15 min后，取上清液凍存于－20℃冰箱中用于揮發(fā)性脂肪酸、乳酸和L PS濃度的測定，L PS在分析之前使用Li等［5］的方法處理，取10 g樣品轉(zhuǎn)移到無熱源的管中，其中包含10 m L的生理鹽水，并且混合均勻，4℃、13000 r/min下離心40 min后，收集大約2 m L樣品，過濾到無熱源的玻璃管中，然后100℃加熱30 min。室溫冷卻10 min，存放在－20℃下待測；同時(shí)取部分內(nèi)容物凍存于－20℃冰箱中用于細(xì)菌D N A提取。

1.3 指標(biāo)測定及方法

1.3.1 空腸、回腸發(fā)酵參數(shù)的測定 采用比色法測定空腸、回腸內(nèi)容物中乳酸濃度［6］，采用氣相色譜法（日本，G C-14B氣相色譜儀，色譜柱型號為A gilent J & W G C Colu m ns：30 m×0.32 m m×0.25μm，柱溫110℃，氣化室溫度180℃，檢測室溫度180℃）測定揮發(fā)性脂肪酸濃度［7］。p H值用p H計(jì)（HI 9024 C，H A N N A）測定。采用顯色基質(zhì)特異性鱟試劑盒測定游離L PS濃度（廈門鱟試劑廠有限公司），基本原理是內(nèi)毒素可激活鱟試劑中的C因子，進(jìn)而激活凝固酶原，凝固酶可水解人工合成顯色基質(zhì)鱟三肽釋放出呈黃色的對硝基苯胺（para nitro aniline，P N A），再將P N A重氮化形成偶氮蘭復(fù)合物（呈玫瑰紅），該復(fù)合物可于545 n m波長處測定吸光度。試劑盒包括：鱟試劑（1.7 m L/支）、顯色基質(zhì)（1.7 m L/支）、細(xì)菌內(nèi)毒素工作品（9 E U/支）、偶氮化試劑1（10 m L/支）、偶氮化試劑2（10 m L/支）、偶氮化試劑3（10 m L/支）、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（50 m L/瓶）、反應(yīng)終止液（鹽酸H Cl，50 m L/瓶）。

1.3.2 空腸和回腸黏膜堿性磷酸酶活性的測定

山羊空腸和回腸黏膜的堿性磷酸酶活性的測定采用試劑盒。試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3.3 組織切片的處理 用4%多聚甲醛固定，洗滌、酒精梯度脫水、浸蠟、包埋、切片、帖片、脫蠟復(fù)水、蘇木精－伊紅染色、封固，在光學(xué)顯微鏡下觀察十二指腸、空腸和回腸上皮組織形態(tài)的變化。

1.3.4 電鏡樣品的處理 用冰磷酸緩沖液反復(fù)清洗各腸組織樣品，2.5%的戊二醛固定后，磷酸緩沖液清洗；采用乙醇脫水后，冷凍干燥儀干燥樣品，用離子濺射儀鍍膜，掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察（S-3000 N，日本，HIT AC HI）。透射電鏡實(shí)驗(yàn)中的樣品前處理與掃描電鏡預(yù)處理一致，綴以1%的鋨酸固定，乙醇梯度脫水，用丙酮置換后，浸漬、包埋、聚合，修塊使樣品表面積小于0.2 m m×0.2 m m，超薄切片，經(jīng)鈾染色與鉛染色清洗后，透射電子顯微鏡（H-7650，日本，HIT A C HI）進(jìn)行觀察。

1.3.5 總細(xì)菌D N A提取和16S rR N A基因片段擴(kuò)增 稱取約0.1 g解凍后的腸道內(nèi)容物樣至滅菌后的Eppendorf管中，加入1.5 m L的磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（p H＝7.0），渦旋混合，13000 r/min離心5 min，棄上清，參照K hafipour等［1］的方法，用珠磨法機(jī)械破碎樣品，后用酚和氯仿/異戊醇提取其總D N A。提取D N A于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 Real-tim e P C R定量分析 使用A BI 7500 Real-tim e P C R儀（A pplied Biosysterm）對腸道內(nèi)容物樣中擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）進(jìn)行定量。分別以化膿擬桿菌（Bacteroides pyogenus）和厚壁菌的16S rR N A基因作為模板，模板拷貝數(shù)分別為3.29×109和7.48×109copies/μL。模板按照10倍梯度向下稀釋，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上使用5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)3次重復(fù)檢測，制作相應(yīng)細(xì)菌定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。Real-tim e P C R反應(yīng)體系為20μL：10.4μL S Y B R Green Supermix（T O Y O B O），10μm ol/L的上下游引物各0.4μL，2μL樣品D N A以及6.8μL無菌水。實(shí)驗(yàn)定量P C R分析所用引物見表2，引物Bact934F/Bact1060 R和Firm 934F/Firm 1060 R［8］分別用于定量山羊腸道內(nèi)容物樣中擬桿菌門和厚壁菌門的16S rR N A基因拷貝數(shù)，P C R反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃10 min，而后95℃30 s，60℃下退火及延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。

表2 本研究中所用引物序列Table 2 List of primers used in this study

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPPS（SPSS version 18.0，Chicago，IL）統(tǒng)計(jì)軟件中Independent T-test程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。顯著性置于0.05水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊空腸和回腸發(fā)酵參數(shù)

由表3可見，與干草組相比，飼喂高谷物日糧顯著提高了空腸總揮發(fā)性脂肪酸（P＝0.015）、丙酸（P＝0.008）、丁酸（P＝0.004）、異丁酸濃度（P＝0.035），降低了乳酸濃度（P＝0.008），但對空腸內(nèi)容物中p H、乙酸、戊酸、異戊酸濃度及L PS含量無顯著性影響（P＞0.05）。與干草組相比，飼喂高谷物日糧顯著提高了回腸總揮發(fā)性脂肪酸（P＝0.007）、丙酸（P＝0.013）、丁酸（P＝0.008）、戊酸（P＜0.001）、乳酸濃度（P＝0.008）以及L PS含量（P＜0.001），降低了回腸內(nèi)容物的p H值（P＝0.005），但對乙酸、異丁酸和異戊酸濃度無顯著影響（P＞0.05）。

2.2 山羊小腸上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)

由圖1可見，光學(xué)顯微鏡下觀測結(jié)果表明，與干草組相比（十二指腸：圖1 A；空腸：圖1 C），高谷物日糧組十二指腸（圖1B）和空腸（圖1 D）的細(xì)胞間空隙明顯增大。與干草組（圖1 E和圖1 G）相比，高谷物日糧組的回腸（圖1F和圖1 H）絨毛松散，出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，排列不齊。透射電鏡結(jié)果表明，與干草組（空腸：圖1I；回腸：圖1 K）相比，高谷物日糧組的空腸（圖1J）緊密連接縫隙變大、回腸（圖1 L）緊密連接結(jié)構(gòu)模糊不清。

表3 高谷物日糧對山羊空腸和回腸發(fā)酵參數(shù)的影響Table 3 Effects of a high grain diet feeding on the jejunal and ileal fermentation parameters in goats

圖1 飼喂高谷物日糧對山羊十二指腸、空腸與回腸上皮形態(tài)的影響Fig.1 The effect of a high grain diet feeding on changes in histomorphology of duodenu m，jejunu m and ileu m epitheliu m

2.3 山羊小腸絨毛高度和隱窩深度

從表4可知，高谷物組山羊十二指腸、空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度極顯著高于干草對照組（P＜0.001）。與干草對照組相比，高谷物組山羊空腸絨毛高度與隱窩深度的比值顯著下降（P＝0.024）。而十二指腸、回腸的絨毛高度與隱窩深度的比值差異不顯著（P＞0.05）。

表4 高谷物日糧對山羊小腸絨毛高度和隱窩深度的影響Table 4 Effect of a high grain diet on the smallintestinal villi height and crypt depth in goats

2.4 空腸和回腸內(nèi)容物中厚壁菌門與擬桿菌門數(shù)量

由表5可見，與干草組相比，高谷物日糧組山羊回腸擬桿菌門16S rR N A基因的拷貝數(shù)顯著降低（P＝0.037），同時(shí)厚壁菌門與擬桿菌門細(xì)菌數(shù)量比值顯著升高（P＜0.001），但兩組間厚壁菌門細(xì)菌數(shù)量無顯著差異（P＞0.05）；與對照組相比，飼喂高谷物日糧對空腸中擬桿菌門、厚壁菌門16S rR N A基因的拷貝數(shù)及二者間的比例無顯著影響（P＞0.05）。

表5 高谷物日糧對空腸、回腸內(nèi)容物中擬桿菌門和厚壁菌門16S rR N A基因拷貝數(shù)的影響Table 5 Effect of a high grain diet on the 16S rR N A gene copy nu m ber of Firmicutes and Bacteroidetes in jejunu m and ileu m digesta

2.5 山羊空腸和回腸堿性磷酸酶活性

由表6可見，與干草對照組相比，飼喂高谷物日糧可以提高回腸黏膜中堿性磷酸酶活性（P＝0.046），但對山羊空腸中堿性磷酸酶活性無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論與結(jié)論

表6 高谷物日糧對山羊空腸和回腸中堿性磷酸酶的影響Table 6 Effect of a high grain diet on the activity of alkaline phosphatase in jejunu m and ileu m m ucosa

小腸作為消化道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的主要部位，其絨毛高度及隱窩深度是衡量腸道消化吸收功能的重要指標(biāo)［9-10］。研究顯示，小腸絨毛高度下降說明其吸收功能可能下降；而隱窩深度變淺則顯示細(xì)胞成熟率上升，分泌功能增強(qiáng)［11］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼喂高谷物日糧的山羊十二指腸、空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度極顯著高于對照組（P＜0.001），結(jié)果說明飼喂高谷物日糧可促進(jìn)小腸黏膜生長，增強(qiáng)消化吸收功能，其原因可能與空腸（P＝0.004）和回腸（P＝0.008）中丁酸含量顯著升高有關(guān)。相關(guān)研究表明，腸道丁酸濃度升高可下調(diào)消化道上皮中胰島素結(jié)合蛋白3（IG FBP-3）基因表達(dá)，由于IG FBP-3是胰島素樣生長因子1（IG F-1）的重要結(jié)合蛋白，其表達(dá)水平下降可導(dǎo)致IG F-1的釋放量增加，而IG F-1增加可促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的生長［12］。此外，也有研究表明，丁酸可通過減少消化道上皮細(xì)胞的凋亡來誘導(dǎo)上皮乳頭狀突起的生長［13］。因此，丁酸可能通過多條途徑影響腸上皮生長。

研究顯示，飼喂高谷物日糧可提高奶牛與山羊后腸中總揮發(fā)性脂肪酸濃度［5］，致p H值下降。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼喂高谷物日糧的山羊空腸和回腸內(nèi)容物中總揮發(fā)性脂肪酸濃度升高，結(jié)果與上述報(bào)道相似，說明飼喂高谷物日糧同時(shí)也影響了山羊小腸微生物發(fā)酵。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，高谷物組山羊的回腸乳酸濃度顯著升高，說明高谷物日糧可能有利于回腸中乳酸菌生長。研究表明，飼喂大量谷物可提高奶牛瘤胃液中游離脂多糖的濃度，而低p H與高濃度L PS可能損傷瘤胃上皮結(jié)構(gòu)［14］。本實(shí)驗(yàn)中飼喂高谷物日糧山羊的回腸內(nèi)容中L PS濃度顯著升高，結(jié)果與上述報(bào)道相似。說明飼喂高谷物日糧不僅可影響瘤胃與后腸發(fā)酵，同時(shí)影響小腸尤其是回腸微生物發(fā)酵。

對反芻動物而言，較瘤胃復(fù)層上皮相比，由單層上皮細(xì)胞組成的小腸上皮屏障完整性更易被破壞［15］。在腸上皮屏障中，細(xì)胞間緊密連接在維護(hù)上皮屏障功能、上皮細(xì)胞極性及上皮屏障通透性中起到重要作用［16-17］。研究顯示，飼喂高谷物日糧可破壞奶牛結(jié)腸黏膜屏障的完整性和通透性，導(dǎo)致腸上皮屏障損傷，在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為腸上皮緊密連接間隙變寬，上皮細(xì)胞核破裂和線粒體結(jié)構(gòu)性損傷［18］，線粒體結(jié)構(gòu)性損傷可進(jìn)一步抑制A T P的生成［19-20］，進(jìn)而影響與上皮通透性相關(guān)的緊密連接蛋白Claudin-4和Occludin的基因轉(zhuǎn)錄與翻譯，最終導(dǎo)致這些蛋白的表達(dá)下降，上皮通透性發(fā)生改變，引發(fā)細(xì)胞腫脹壞死和大分子物質(zhì)（微生物和微生物產(chǎn)物，如L PS）易位，造成腸道損傷［14］。本實(shí)驗(yàn)中，光學(xué)顯微鏡觀測結(jié)果表明，與對照組相比，飼喂高谷物日糧的山羊回腸絨毛松散，出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，排列不齊。透射電鏡結(jié)果表明，回腸緊密連接結(jié)構(gòu)模糊不清。我們推測，出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能與高谷物日糧下山羊回腸中p H值顯著降低所引發(fā)的系列生理效應(yīng)有關(guān)。此外，本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂高谷物日糧組的山羊的空腸空隙明顯增大，緊密連接出現(xiàn)開口，空腸絨毛高度與隱窩深度的比值顯著下降。前人研究表明，腸絨毛高度與隱窩深度的比值可反應(yīng)小腸黏膜的受損程度，比值下降暗示小腸黏膜受損［21］。因此，上述結(jié)果說明，飼喂高谷物組山羊的空腸黏膜也受到損傷，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)高谷物組與干草組山羊的空腸p H值及L PS濃度有顯著差異，因此，空腸上皮出現(xiàn)明顯損傷的原因尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

日糧是影響腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)和功能的主要因素之一［22-24］。研究表明，日糧原料特性及其物理性質(zhì)改變可導(dǎo)致奶牛瘤胃與后腸發(fā)酵模式變化，進(jìn)而引發(fā)瘤胃與后腸微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。相關(guān)研究顯示，當(dāng)奶牛日糧從以粗飼料為主的日糧轉(zhuǎn)變?yōu)楦吖任锶占Z為主時(shí)，瘤胃中總揮發(fā)性脂肪酸濃度顯著升高，同時(shí)瘤胃菌群中擬桿菌門比例會顯著下降，而厚壁菌門比例顯著升高［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高谷物日糧顯著提高了空腸與回腸內(nèi)容物中總揮發(fā)性脂肪酸含量，顯著影響了回腸中擬桿菌門數(shù)量，但對山羊空腸中厚壁菌門與擬桿菌門細(xì)菌的數(shù)量無顯著影響；我們推測，高谷物日糧對兩段腸道內(nèi)容物中微生物菌群數(shù)量影響不一致的原因可能與食糜流通速度不同有關(guān)。較空腸相比，回腸中食糜的流通速度較低；因此，回腸內(nèi)容物中微生物可充分利用底物生長，因而數(shù)量較高；這也說明日糧可能更易影響微生物菌群結(jié)構(gòu)與組成。本試驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，飼喂高谷物日糧顯著降低了擬桿菌門細(xì)菌數(shù)量，由于擬桿菌門細(xì)菌主要為革蘭氏陰性菌，而革蘭氏陰性菌對環(huán)境p H值尤其敏感，因此，其數(shù)量下降可能與回腸內(nèi)容物p H值下降有關(guān)；同時(shí)，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中含有大量的脂多糖，因此，該類微生物可能因不適應(yīng)低p H而導(dǎo)致細(xì)菌大量死亡、裂解，最終導(dǎo)致內(nèi)容物中L PS濃度顯著升高［26］。

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）是一種非特異性磷酸單脂酶，廣泛存在于動物界和微生物界，可催化磷酸單脂水解反應(yīng)和轉(zhuǎn)磷酸作用。研究表明，堿性磷酸酶在腸道免疫中發(fā)揮作用，其主要存在于腸上皮表面，可作為腸道黏膜防護(hù)因子［27］，是防止脂多糖進(jìn)入機(jī)體的第一道防線。近年來研究發(fā)現(xiàn)，小牛腸堿性磷酸酶可作為一種新型藥物制劑，治療小鼠和仔豬因L PS誘發(fā)的腸源性疾?。?8］，其原理與堿性磷酸酶可通過對L PS的脫磷酸反應(yīng)，進(jìn)而減弱革蘭陰性菌毒性有關(guān)［29-31］。本研究中，高谷物日糧顯著提高了回腸黏膜中堿性磷酸酶活性（P＜0.05），但對山羊空腸黏膜的堿性磷酸酶活性無顯著影響。其原因可能與飼喂高谷物日糧組山羊空腸內(nèi)容物中L PS濃度顯著升高有關(guān)。實(shí)際上，在L PS濃度升高情況下，動物機(jī)體可能會對L PS產(chǎn)生一種生理性應(yīng)答，以阻止L PS對上皮組織的損傷。該結(jié)果同時(shí)表明，堿性磷酸酶可能在調(diào)控L PS的生理毒性和維護(hù)動物腸上皮屏障功能中起著重要作用。

綜上所述，飼喂高谷物日糧可提高山羊空腸與回腸中總揮發(fā)性脂肪酸濃度，致回腸內(nèi)容物p H下降、乳酸及L PS濃度升高；同時(shí)回腸上皮緊密連接受損，回腸擬桿菌門數(shù)量與堿性磷酸酶活性受到影響。結(jié)果暗示，飼喂高谷物日糧改變了小腸微生物發(fā)酵，導(dǎo)致小腸上皮健康受損。

References：

［1］K hafipour E，Li S，Plaizier J C，etal.Ru m en microbio m e co m position determined using two nutritional m odels of subacute ru minal acidosis.A pplied and Environ m ental Microbiology，2009，22：7115-7124.

［2］K hafipour E，Krause D O，Plaizier J C.A grain-based subacute ru minal acidosis challenge causes translocation of lipopolysaccharide and triggers infla m m ation.Journal of Dairy Science，2009，92：1060-1070.

［3］W ang D S，Zhang R Y，Zhu W Y，etal.Effects of subacute ru minal acidosis challenges on ferm entation and biogenic a mines in the ru m en of dairy cows.Livestock Science，2013，155：262-272.

［4］Gressley T F，H all M B，Arm entano L E.Ru minant nutrition sy m posiu m：productivity，digestion，and health responses to hindgut acidosis in ru minants.Journal of A nim al Science，2011，89（4）：1120-1130.

［5］Li S，K hafipour E，Krause D O，etal.Effects of subacute ru minal acidosis challenges on ferm entation and endotoxins in the ru m en and hindgut of dairy cows.Journal of Dairy Science，2012，95（1）：294-303.

［6］Zhang L X，Zhang T F，Li L Y.Bioche mical Test M ethod and Technology（second edition）［M］.Beijing：Higher Education Press，1997.

［7］Qin W L.Determination of volatile fatty acids by m eans of gas chro m atography.Journal of Nanjing A gricultural U niversity，1982，5：110-116.

［8］Guo X，Xia X，Tang R，etal.Develop m ent of a real-tim e PC R m ethod for Firmicutes and Bacteroidetesin faeces and its application to quantify intestinal population of obese and lean pigs.Letters in A pplied Microbiology，2008，47：367-373.

［9］Li D F.S wine N utrition（second edition）［M］.Beijing：China’s A gricultural Science and Technology Press，2003：7-10.

［10］Li K Z，Li N，Li J S，etal.The effect of short-chain fatty acids（SFC A）on intestinal m orphology and kinetic energy after rat s m all bowel transplantation.W orld Chinese Journal of Digestology，2002，10（6）：720-722.

［11］Eid Y Z，O htsuka A，H ayashi K.Tea polychenols reduce glucocorticoid-induced growth inhibition and oxidative stress in broiler chickens.British Poultry Science，2003，44：127-132.

［12］Van landeqhe m L，Santoro M A，M ah A T，etal.IG F1 stim ulates crypt expansion via differential activation of 2 intestinal ste m cell populations.The Journal of the Federation of A m erican Societies for Experim ental Biology，2015，29（7）：2828-2842.

［13］M entschel J，Leiser R，M ulling C，etal.Butyric acid stim ulates ru m en m ucosa develop m entin the calf m ainly by a reduction of apoptosis.Archives of A nim al N utrition，2001，55：85-102.

［14］Liu J H，Xu T T，Zhu W Y，etal.A high-grain diet alters the o m asal epithelial structure and expression of tight junction proteins in goat m odel.The Veterinary Journal，2014，201（1）：95-100.

［15］Oetzel G R.Subacute ru minal acidosis in dairy cattle.A dvances in Dairy Technology，2003，15：307-317.

［16］Graha m C，Sim m ons N L.Functional organization of the bovine ru m en epitheliu m.A m erican Journal of Physiology Regulatory Integrative and Co m parative Physiology，2005，288（1）：173-181.

［17］Penner G B，Steele M A，Aschenbach J R，etal.Ru minant nutrition sy m posiu m：m olecular adaptation of ru minal epithelia to highly ferm entable diets.Journal of A nim al Science，2011，89（4）：1108-1119.

［18］Tao S Y，Duan m u Y Q，Dong H B，etal.A high-concentrate diet induced colonic epithelial barrier disruption is associated with the activating of cell apoptosis in lactating goats.B M C Veterinary Research，2014，10：235.

［19］Gaebel G，Bell M，M artens H.The effect of low m ucosal p H on sodiu m and chloride m ove m ent across the isolated ru m en m ucosa of sheep.Q uarterly Journal of Experim ental Physiology and Cognate M edical Sciences，1989，74：35-44.

［20］Teixeira B M，Kowaltowski A J，Castilho R F，etal.Inhibition of mitochondrial perm eability transition by low p H is associated with less extensive m e m brane protein thiol oxidation.Bioscience Reports，1999，19：525-533.

［21］Xie D，Chen Y X，W ang Z X，etal.Effects of m onochro m atic light on structure of s m allintestinal m ucosa in broilers.Scien-tia A gricultura Sinica，2009，42（3）：1084-1090.

［22］Kocherginskaya S A，A minov R I，W hite B A，etal.A nalysis of the ru m en bacterial diversity under two different diet conditions using denaturing gradient gel electrophoresis，rando m sequencing，and statistical ecology approaches.A naerobe，2001，7：119-134.

［23］Tajim a K，Arai S，O gata K，etal.Ru m en bacterial co m m unity transition during adaptation to high-grain diet.A naerobe，2000，6：273-284.

［24］Zhou M，H ernandez-Sanabria E，Guan L L.Characterization of variation in ru m en m ethanogenic co m m unities under different dietary and host feed efficiency conditions，as determined by PC R-denaturing gradient gel electrophoresis analysis.A pplied and Environ m ental Microbiology，2010，76：3776-3786.

［25］Fernando S C，Purvis H T，Najar F Z，etal.Ru m en microbial population dyna mics during adaptation to a high-grain diet.A pplied and Environ m ental Microbiology，2010，76（22）：7482-8490.

［26］H uo W J，Zhu W Y，M ao S Y.Effects of feeding increasing proportions of corn grain on concentration of lipopolysaccharide in the ru m en fluid and the subsequent alterations in im m une responses in goats.Asian-A ustralasian Journal of A nim al Science，2013，26（10）：1437-1445.

［27］Chen K T，M alo M S，Beasley-Topliffe L K，etal.A role for intestinal alkaline phosphatase in the m aintenance of local gut im m unity.Digestive Diseases and Sciences，2011，56（4）：1020-1027.

［28］Tian X J，Song X H，Yan S J，etal.Study of refolding of calf intestinal alkaline phosphatase.Protein Che mistry，2003，22（5）：417-422.

［29］Goldberg R F，A usten W G Jr，Zhang X，etal.Intestinal alkaline phosphatase is a gut m ucosal defense factor m aintained by enteral nutrition.Proceedings of the National Acade m y of Sciences of the U nited States of A m erica，2008，105（9）：3551-3556.

［30］Bates J M，A kerlund J，Mittge E，etal.Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents infla m m ation in zebrafish in response to the gut microbiota.Cell H ost Microbe，2007，2（6）：371-382.

［31］Poelstra K，Bakker W W，Klok P A，etal.Dephosphorylation of endotoxin by alkaline phosphataseinvivo.A m erican Journal of Pathology，1997，151（4）：1163-1169.

［6］張龍翔，張庭芳，李玲媛.生化試驗(yàn)方法和技術(shù)第二版［M］.北京：高等教育出版社，1997.

［7］秦為琳.應(yīng)用氣相色譜測定揮發(fā)性脂肪酸方法的研究改進(jìn).南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1982，5：110-116.

［9］李德發(fā).豬的營養(yǎng)（第二版）［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2003：7-10.

［10］李可洲，李寧，黎介壽，等.短鏈脂肪酸對大鼠移植小腸形態(tài)及動能的作用研究.世界華人消化雜志，2002，10（6）：720-722.

［21］謝電，陳耀星，王子旭，等.單色光對肉雛雞小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（3）：1084-1090.

The effect of high-grain diets on small intestinal fermentation，morphological structure and microbial flora in goats

X U E Chun-Xu，Y E H ui-Min，F(xiàn) E N G Pan-Fei，LIU Jun-H ua，M A O Sheng-Y ong*

Collegeof Animal Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China

T his study investigated the effect of high-grain（H G）diets on microbial ferm entation，epithelial tissue m orphology，alkaline phosphatase activity and the quantity of microbial flora in the s m all intestine of goats.T welve goats were rando mly allocated to tw o groups（6 in each group）and were fed a hay（0%grain）or H G diet（75%grain）for 6 weeks.After 6 weeks offeeding，the goats were slaughtered to collect s m allintestinal digesta and tissue for analysis.T he results showed that：1）Co m pared with the hay group，H G feeding sig-nificantly increased the concentrations of total volatile fatty acid（P＝0.015），propionate（P＝0.008），butyrate （P＝0.004）and isobutyrate（P＝0.035），w hile it significantly decreased the concentration of lactic acid（P＝0.008）.H owever，H G diet feeding did not influence p H or the concentrations of acetate，valerate，isovalerate and L PS in jejuna digesta（P＞0.05）；Co m pared with the hay group，H G diet increased the concentrations of total volatile fatty acid（P＝0.007），propionate（P＝0.013），butyrate（P＝0.008），valerate（P＜0.001），lactic acid（P＝0.008）and lipopolysaccharide levels（P＜0.001），w hile it decreased the p H value（P＝0.005）in ileal digesta.T here were no significant differences in the concentrations of acetate，isobutyrate，isovalerate between the hay and H G groups（P＞0.05）.2）Co m pared with the control，H G feeding significantly increased villi height and crypt depth in the duodenu m，jejunu m and ileu m tissue（P＜0.001）.T he ratio of villus height to crypt depth（V/C）increased in the jejunu m（P＝0.024）.Trans mission electron micrographs ofjejunu m and ileu m tissue during the H G diet displayed a deterioration of the tight junction.3）Co m pared with the control，H G diets significantly increased the alkaline phosphatase activity of ileal m ucosa（P＜0.05），but had no influence on the alkaline phosphatase activity of jejunu m m ucosa（P＞0.05）.4）Real-tim e P C R analysis showed that in ileu m digesta the 16S rR N A gene copies of Bacteroidetes fro m the H G group were significantly lower than for the hay group（P＝0.037）.T he H G group showed an increase in the ratio of Firmicutesto Bacteroidetes（P＜0.001），w hile there was no significant difference in the 16S rR N A gene copies of Firmicutes（P＞0.05）.N o significant differences（P＞0.05）between the hay and H G groups’jejunu m digesta were observed in the 16S rR N A gene copies of Bacteroidetes and Firmicutes，or in the ratio of Firmicutes to Bacteroidetes.In su m m ary，these resultsindicate that feeding goats high proportions of grain can significantly influence the m orphological characteristics ofileal epitheliu m and microbialferm entation in ileal digesta，and m ay have a negative effect on the health of goats.

high-grain diet；s m allintestine；tight junction；alkaline phosphatase；microbial flora

.E-m ail：m aoshengyong＠163.com

10.11686/cyxb2015381

2015-08-31；改回日期：2015-11-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31372339）資助。

薛春旭（1991-），女，天津人，在讀碩士。E-m ail：xuechunxu2014＠163.com