重組溶葡萄球菌酶的PEG定點(diǎn)修飾

陸海榮，張宜濤，黃青山

1 上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司，上海 2012062 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院 遺傳學(xué)研究所 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

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重組溶葡萄球菌酶的PEG定點(diǎn)修飾

陸海榮1,2，張宜濤1，黃青山1,2

1 上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司，上海 201206
2 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院 遺傳學(xué)研究所 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

陸海榮, 張宜濤, 黃青山. 重組溶葡萄球菌酶的PEG定點(diǎn)修飾. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(1): 127–134.

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摘 要:為獲得高抗菌活性聚乙二醇 (PEG) 定點(diǎn)修飾的溶葡萄球菌酶 (Lysn)，根據(jù)該酶的高級結(jié)構(gòu)，在它的催化域和結(jié)合域上優(yōu)選8個位點(diǎn) (Q9、N13、N40、T172、N174、G197、V240和T244)，將其分別突變成半胱氨酸，純化后的溶葡萄球菌酶突變體經(jīng)DTT處理后與20 kDa的單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺 (mPEG-MAL)進(jìn)行定點(diǎn)修飾反應(yīng)，RP-HPLC分析顯示PEG修飾率大于70%，修飾產(chǎn)物經(jīng)MacroCap SP陽離子交換層析純化后，PEG化溶葡萄球菌酶的純度大于95%。比濁法和最小抑菌濃度 (MIC) 實(shí)驗(yàn)表明20K-PEG-LysnV240C和20K-PEG-LysnT244C的抗菌活性維持在原來的50%左右。研究結(jié)果為溶葡萄球菌酶全身給藥治療金黃色葡萄球菌感染奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:溶葡萄球菌酶，金黃色葡萄球菌，抗菌活性，最小抑菌濃度

Received: March 11, 2015; Accepted: May 21, 2015

Supported by: China Postdoctoral Science Foundation (No. 2014M551322), Post-doctor Research Foundation Project of Shanghai (No. 14R21421300), Shanghai Engineering Research Center of Industrial Microorganisms (No. 13DZ2252000).

中國博士后科學(xué)基金 (No. 2014M551322)，上海市博士后科研資助計(jì)劃 (No. 14R21421300)，上海市工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心(No. 13DZ2252000) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-06-08 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150608.1417.002.html

金黃色葡萄球菌是臨床主要病原菌，它能引起肺炎、骨髓炎、心內(nèi)膜炎及敗血癥等多種感染性疾病[1-2]。隨著抗生素的廣泛使用，金葡菌耐藥性問題日益突出，尤其是耐甲氧西林金葡菌 (MRSA)[3-4]。MRSA已經(jīng)造成臨床治療上的困難及病死率增高，嚴(yán)重威脅人類健康[5-6]。

溶葡萄球菌酶 (Lysostaphin，Lysn) 是1964 年Schindler和Schuhar[7]首次從模仿葡萄球菌培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)并分離的一種細(xì)菌素。它是一種含鋅的金屬蛋白酶，由特異性靶向細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和高效水解葡萄球菌細(xì)胞壁肽聚糖中甘氨酸肽鍵的催化結(jié)構(gòu)域組成 (圖1)。Lysn通過溶解細(xì)菌細(xì)胞壁，從而達(dá)到殺菌目的，其對葡萄球菌 (包括MRSA) 具有很強(qiáng)的殺菌作用 (MICs在0.003–0.125 μg/mL之間)[8]，并且不容易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌株。但由于Lysn的體內(nèi)半衰期非常短 (<1 h)[9]，它的臨床應(yīng)用還停留在局部外用階段，主要用于治療創(chuàng)面金葡菌感染和清除鼻部定殖的金葡菌[10-13]。

如何改善Lysn的體內(nèi)穩(wěn)定性，是擴(kuò)大其臨床應(yīng)用所面臨的關(guān)鍵問題。近年來，國內(nèi)外開展了Lysn的PEG修飾方面的工作。Walsh等[14]報(bào)道通過偶聯(lián)PEG到Lysn的賴氨酸，PEG化Lysn的體內(nèi)半衰期從原來的不到1 h提高至24 h以上；同時，ELISA檢測顯示，PEG化Lysn抗體的產(chǎn)生水平比PEG化前降低了10倍以上，說明Lysn經(jīng)PEG化后，不但延長了其體內(nèi)半衰期，而且顯著降低了抗體產(chǎn)生。然而由于是非定點(diǎn)修飾 (Lysn有16個賴氨酸可被修飾)，修飾后產(chǎn)物的異構(gòu)體多，其中大部分位點(diǎn)的修飾會降低Lysn與細(xì)菌細(xì)胞壁 (大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)) 的親和力，導(dǎo)致生物活性急劇下降。最近，王永等[15]同樣也進(jìn)行了Lysn的PEG非定點(diǎn)修飾工作，獲得的PEG-Lysn的生物活性只有原來的25%。吳宏等[16]在Lysn兩個結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)引入半胱氨酸，再進(jìn)行PEG定點(diǎn)修飾 (偶聯(lián)PEG至半胱氨酸的巰基)，雖然產(chǎn)物單一，但抗菌活性只有修飾前的20%左右。

之前PEG修飾Lysn研究的一個重要限制因素是該酶的空間結(jié)構(gòu)尚不明確，因此只有充分了解Lysn的作用機(jī)制以及兩個結(jié)構(gòu)域之間的相互關(guān)系，才能更好地進(jìn)行該酶的PEG修飾。最近我們[17]和Sabala等[18]對Lysn高級結(jié)構(gòu)的研究，闡明了該酶高效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的作用依賴于兩個結(jié)構(gòu)域之間一定范圍內(nèi)的相對運(yùn)動。為獲得高抗菌活性PEG定點(diǎn)修飾的Lysn，本文根據(jù)Lysn高級結(jié)構(gòu)，優(yōu)選8個位點(diǎn)，將其分別突變成半胱氨酸，再進(jìn)行PEG定點(diǎn)修飾，并進(jìn)一步用比濁法和最小抑菌濃度 (MIC) 法評價了PEG化Lysn的體外抗菌活性。

1　材料與方法

1.1材料

表達(dá)載體pET28a(+)、大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3) 購自Novagen公司；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 6538購自中國生物制品檢定所；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自NEB公司；DNA marker、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)購自TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自天根生化科技有限公司；定點(diǎn)突變引物由上海生工生物工程有限服務(wù)公司合成；QuikChange lightning site-directed mutagenesis kit購自Stratagene公司；mPEG-MAL (單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺)購自北京鍵凱科技有限公司；

1.2Lysn的表達(dá)和純化

為在大腸桿菌中表達(dá)Lysn，在編碼成熟Lysn基因的5?端引入NcoⅠ位點(diǎn)和編碼OmpA信號肽的基因序列；在其3?端引入Hind Ⅲ位點(diǎn)。OmpA-Lysn基因片段經(jīng)NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，割膠回收OmpA-Lysn基因片段，克隆到pET28a(+) 載體的NcoⅠ和Hind Ⅲ位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-OmpA-Lysn，陽性克隆送上海英駿生物公司測序。將測序正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，獲得表達(dá)Lysn的工程菌。

挑單克隆接種于LB培養(yǎng)液 (含30 mg/L卡那霉素)，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，按1%接種到相同的LB培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至光密度值 (波長600 nm) 約為0.6時，加入終濃度為0.05 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，繼續(xù)37 ℃振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)4 h左右，離心收集發(fā)酵上清，保存于4 ℃。

將離心后發(fā)酵上清進(jìn)樣至預(yù)先用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 9.0)平衡的Capto MMC陽離子交換層析柱 (26 mm×60 mm)，用含1.0 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液洗脫，收集目的峰。收集峰經(jīng)超濾濃縮后，進(jìn)樣至Sephadex G50凝膠過濾層析柱進(jìn)行精純，用含150 mmol/L NaCl 的PBS緩沖液 (pH 7.0) 進(jìn)行洗脫，收集目的峰。純化后的樣品經(jīng)超濾濃縮后置于–20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

用12% SDS-PAGE測定重組蛋白樣品的大小和純度。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用BCA (Bicinchoninic acid，二喹啉甲酸) 法測定蛋白濃度。

1.3Lysn半胱氨酸 (Cysteine，Cys) 突變體的表達(dá)和純化

Lysn不含Cys，通過定點(diǎn)突變技術(shù)在擬PEG修飾的位置引入一個Cys，利用Cys的巰基和mPEG-MAL的特異性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾。為減少PEG修飾對Lysn生物活性的影響，我們根據(jù)Lysn的高級結(jié)構(gòu)優(yōu)選8個位點(diǎn)進(jìn)行Cys突變，如圖1所示。擬突變的位點(diǎn)需要滿足3個條件：必須在分子表面；不在結(jié)構(gòu)域的活性中心一側(cè)；不在兩個結(jié)構(gòu)域的相互作用界面上。

為表達(dá)Lysn突變體，設(shè)計(jì)合成系列引物，以pET28a-OmpA-Lysn為模板，按照QuikChange?lightning site-directed mutagenesis試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用DpnⅠ消化模板，然后轉(zhuǎn)化DH5α。挑克隆測序分析，將測序正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，獲得表達(dá)Lysn突變體的工程菌。蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化方法同上。

圖1　溶葡萄球菌酶中8個Cys突變位點(diǎn)Fig. 1 Eight selected sites in lysostaphin for cysteine substitutions.

1.4比濁法測定重組蛋白抗菌活性

采用比濁法[19]，在特定條件下細(xì)菌懸液濁度下降值代表Lysn的酶活。將過夜培養(yǎng)的金葡菌 (ATCC 6538) 轉(zhuǎn)接后生長到對數(shù)中期 (OD600大約0.5)，離心 (5 000 ×g，5 min) 收集菌體。菌體用PBS (pH 7.2) 清洗2次，然后重懸于含150 mmol/L NaCl的PBS緩沖液中 (OD600約為1.0)。在比色皿中加入20 μL樣品 (0.5 mg/mL) 和2 mL的菌懸液，室溫 (25 ℃) 下在分光光度計(jì)600 nm波長下讀數(shù) (間隔1 min，共15 min)。

1.5重組蛋白的PEG修飾以及純化

將純化獲得的Lysn突變體用20 mmol/L的DTT處理 (室溫15 min)，DTT處理的樣品經(jīng)SP-650M陽離子柱純化去除DTT。將洗脫峰與分子量20 kDa的mPEG-MAL修飾劑按1∶5摩爾比混合，再加入10%的DMSO，于4 ℃反應(yīng)2–3 h，RP-HPLC分析PEG修飾率。反應(yīng)混合物與純水1∶5稀釋后，進(jìn)樣至預(yù)先用50 mmol/L NaAc緩沖液 (pH 4.5) 平衡的MacroCap SP陽離子交換層析柱 (16 mm×30 mm)，用含1.0 mol/L NaCl 的Tris-HCl緩沖液 (pH 9.0) 梯度洗脫，收集目的峰。純化后的樣品置于–20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。?2% SDS-PAGE測定PEG修飾樣品的大小和純度。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用BCA法測定PEG修飾樣品的蛋白濃度。

1.6最小抑菌濃度 (MIC) 檢測

采用二倍稀釋法測定MIC。將金黃色葡萄球菌ATCC6538復(fù)蘇，細(xì)菌在營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)過夜，經(jīng)過MH液體培養(yǎng)基逐級稀釋至細(xì)菌濃度為104–105CFU/mL，備用。待檢樣品用MH培養(yǎng)基二倍稀釋成各種所需濃度，分別加100 μL到96孔板中，再加入100 μL含受試菌液的MH培養(yǎng)基到96孔板中與待檢樣品混勻，置35 ℃培養(yǎng)18–24 h后觀察結(jié)果。肉眼未見細(xì)菌生長的樣品孔中所含藥物最小的濃度即為MIC值。

2　結(jié)果

2.1Lysn及其突變體的表達(dá)和純化

根據(jù)Lysn的高級結(jié)構(gòu)，優(yōu)選8個位點(diǎn)進(jìn)行Cys突變。通過QuikChange?lightning site-directed mutagenesis點(diǎn)突變試劑盒構(gòu)建8個Lysn突變體的表達(dá)載體，DNA測序結(jié)果顯示突變體的DNA序列均正確。

將表達(dá)Lysn和Lysn突變體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 感受態(tài)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。Lysn在信號肽的作用下分泌至發(fā)酵上清中。經(jīng)Capto MMC陽離子交換和Sephadex G50凝膠排阻純化，SDS-PAGE顯示重組蛋白位于27 kDa處，與理論分子量 (26 941 Da) 相符，且純度大于95% (圖2)。

圖2　溶葡萄球菌酶半胱氨酸突變體的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of single cysteine substitutions in lysosatphin.

2.2重組蛋白的生物活性測定

采用比濁法[19]測定重組Lysn及其Cys突變體的生物活性。結(jié)果顯示，與Lysn的溶菌活性相比，突變體N40C、V240C和T244C的活性基本沒有下降，分別為Lysn酶活性的95%、100% 和98%；突變體Q9C和G197C的活性有輕微下降，分別為Lysn酶活性的88%和91%；而突變體N13C、T172C和N174C的活性下降了近20%，為Lysn酶活性的82%、81%和83% (圖3)。說明這些位點(diǎn)的突變對Lysn的結(jié)構(gòu)和功能影響并不明顯，純化獲得的突變體可進(jìn)一步用于PEG修飾。

2.3PEG定點(diǎn)修飾及PEG-Lysn的純化

將Lysn突變體與mPEG-MAL (分子量20 kDa) 按1:5摩爾比4 ℃反應(yīng)2–3 h后，RP-HPLC分析結(jié)果顯示Lysn突變體的PEG修飾率大于70%(數(shù)據(jù)未顯示)。將mPEG-MAL與Lysn的反應(yīng)液經(jīng)MacroCap SP柱純化。通過梯度洗脫，PEG-Lysn最先被洗脫下來。Lysn被PEG修飾后，蛋白分子表面的帶電基團(tuán)被PEG覆蓋，導(dǎo)致PEG-Lysn帶電荷比Lysn少，因此與MacroCap SP陽離子純化介質(zhì)的結(jié)合能力減弱。SDS-PAGE顯示經(jīng)純化后的PEG-Lysn的純度達(dá)到了95%以上 (圖4)。電泳顯示PEG-Lysn位于70 kDa處，比理論分子量 (47 kDa) 大，可能是由于線性PEG分子在SDS-PAGE中的泳動速度比橄欖型蛋白分子慢所致。

圖3　溶葡萄球菌酶Cys突變體的生物活性分析Fig. 3 The bacteriolytic activities of single cysteine substitutions in lysosatphin.

圖4　PEG修飾溶葡萄球菌酶的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of PEGylated lysostaphin. M: protein marker; 1: single-cysteine mutant (LysnQ9C); 2: PEGylation reaction mixture; 3: purified 20K-PEG-LysnQ9C.

2.4PEG-Lysn的生物活性測定

采用比濁法和MIC法測定PEG-Lysn的生物活性。結(jié)果顯示，與Lysn的溶菌活性相比，突變體V240C和T244C經(jīng)PEG修飾后的生物活性保留較高，分別為Lysn酶活性的45%和51%；突變體N174C和G197C經(jīng)PEG修飾后的生物活性有明顯下降，分別為Lysn酶活性的29%和36%；而突變體Q9C、N13C、N40C和T174C經(jīng)PEG修飾后活性急劇下降，分別只有Lysn酶活性的9%、11%、20%和23% (圖5)。

MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20K-PEG-LysnT244C 和20K-PEG-LysnV240C對金黃色葡萄球菌ATCC 6538的MIC均為0.25 μg/mL，MIC值是Lysn的2倍。其他PEG-Lysn的MIC值在0.5–1.0 μg/mL之間，抗菌活性明顯低于Lysn (表1)。

3　討論

病原菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重，尤其是MRSA，因此迫切需要研發(fā)具有新型作用模式的抗菌藥物。近年來，抗菌蛋白 (包括細(xì)菌素、噬菌體裂解酶、細(xì)菌自溶素等) 因其能高效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁而具有很好的應(yīng)用前景[20-23]。其中Lysn的研究最為廣泛[24]，它作為治療創(chuàng)面金葡菌感染的新藥，目前處于臨床III期研究階段。但由于Lysn的體內(nèi)半衰期問題，它只能局部外用。PEG修飾已被廣泛應(yīng)用于蛋白類藥物，它能顯著延長藥物體內(nèi)半衰期并減少免疫原性，增強(qiáng)藥物的生物利用度[25-26]。目前有多個PEG修飾藥物已經(jīng)上市銷售，還有大量PEG 修飾藥物處于臨床研究階段，然而前期PEG修飾Lysn的研究進(jìn)展并不順利[14-16]。

圖5　PEG化溶葡萄球菌酶的生物活性分析Fig. 5 The bacteriolytic activities of PEGylated lysostaphin.

為獲得高生物活性的PEG-Lysn，本研究基于Lysn最新研究的高級結(jié)構(gòu)，在其分子表面優(yōu)選8個位點(diǎn)，通過定點(diǎn)突變技術(shù)分別引入Cys，完成8個突變體的構(gòu)建、表達(dá)和生物活性分析。進(jìn)一步建立了簡便可控、適合放大的PEG修飾和純化工藝。由于是定點(diǎn)修飾，因此不存在多P E G修飾產(chǎn)物或者同分異構(gòu)體，降低了PEG-Lysn質(zhì)量控制的難度。研究過程中發(fā)現(xiàn)，在PEG修飾前通過DTT處理，能顯著提高PEG的修飾率，這可能是由于在表達(dá)和純化過程中部分巰基已經(jīng)被氧化，導(dǎo)致無法被mPEG-MAL修飾，經(jīng)過快速DTT處理，還原Cys上的巰基。PEG修飾可以延長Lysn的體內(nèi)半衰期，從而延長體內(nèi)作用時間，但由于引入的PEG會對Lysn與細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)合產(chǎn)生空間位阻，使其溶菌活性急劇下降。之前，王永等[15]和吳宏等[16]的研究結(jié)果表明，Lysn分子中賴氨酸的隨機(jī)PEG修飾產(chǎn)物和Lysn兩個結(jié)構(gòu)域之間linker處的定點(diǎn)PEG修飾產(chǎn)物的溶菌活性都顯著下降。與這些報(bào)道相似，我們在研究過程中也發(fā)現(xiàn)催化域上的一些位點(diǎn) (LysnQ9C和LysnN13C) 經(jīng)PEG修飾后，其溶菌活性只有修飾前的10%左右 (圖5)，提示這些位點(diǎn)的PEG修飾嚴(yán)重影響了Lysn催化域與細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)合。

表1　Lysn和PEG-Lysn對金葡菌的最小抑菌濃度(MIC)Table 1 Antibacterial activity of Lysn and PEG-Lysn against Staphylococcus aureus (ATCC 6538)

當(dāng)我們在位于Lysn結(jié)合域的LysnT244C和LysnV240C進(jìn)行PEG定點(diǎn)修飾后發(fā)現(xiàn)，修飾產(chǎn)物的生物活性能維持在原來的50%左右，可能是由于這些位點(diǎn)的修飾對Lysn結(jié)合域與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)合的影響相對較?。煌瑫r，這些位點(diǎn)遠(yuǎn)離Lysn催化域和結(jié)合域的相互作用界面，因此也不會影響兩個結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)作。由于本研究中選擇PEG修飾的位點(diǎn)數(shù)量有限，不排除有更好的位點(diǎn)可被用來PEG修飾，從而進(jìn)一步提高PEG-Lysn的生物活性。在下一步工作中，將通過金葡菌感染動物模型來驗(yàn)證高活性PEG-Lysn的體內(nèi)生物學(xué)活性。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

羧肽酶Y標(biāo)記蛋白質(zhì)羧基端方法的優(yōu)化及應(yīng)用

段文文，張陽，許國強(qiáng)

江蘇省重大神經(jīng)精神疾病診療技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省老年病預(yù)防與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123

段文文, 張陽, 許國強(qiáng). 羧肽酶Y標(biāo)記蛋白質(zhì)羧基端方法的優(yōu)化及應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(1): 135?148.

Duan WW, Zhang Y, Xu GQ. Optimization and application of protein C-terminal labeling by carboxypeptidase Y. Chin J Biotech, 2016, 32(1): 135?148.

摘 要: 蛋白質(zhì)水解是一種重要的翻譯后修飾，它在許多生化過程 (如細(xì)胞凋亡和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等) 中起著極其重要的作用。鑒定蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)可以進(jìn)一步加深我們對這些生化過程的認(rèn)識。盡管蛋白質(zhì)氨基端標(biāo)記方法和蛋白質(zhì)組學(xué)在復(fù)雜生物體系中鑒定獲得了許多蛋白質(zhì)的水解位點(diǎn)，但這種方法存在固有的缺陷。羧基端標(biāo)記方法是另一種可行的鑒定蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)的方法。本文優(yōu)化了蛋白質(zhì)羧基端生物酶標(biāo)記方法，提高了親和標(biāo)記效率，從而可以更好地利用正向分離方法對蛋白質(zhì)羧基端多肽進(jìn)行分離并用質(zhì)譜鑒定。我們用優(yōu)化后的羧基端標(biāo)記方法來標(biāo)記大腸桿菌Escherichia coli復(fù)雜蛋白樣品后鑒定到了120多個蛋白質(zhì)羧基端多肽和內(nèi)切多肽。在其所鑒定的蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)中，我們發(fā)現(xiàn)了許多已知和未知的位點(diǎn)，這些新的水解位點(diǎn)有可能在正常生化過程的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。該研究提供了一個可以與蛋白質(zhì)氨基端組學(xué)互為補(bǔ)充、可在復(fù)雜體系中鑒定蛋白質(zhì)水解的方法。

關(guān)鍵詞: 羧肽酶Y，羧基端標(biāo)記，ProC-TEL，蛋白質(zhì)水解，蛋白質(zhì)組學(xué)

Received: March 11, 2015; Accepted: May 13, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31470772), Jiangsu Key Laboratory of Translational Research and Therapy for Neuro-Psycho-Diseases (No. BM2013003), the Priority Academic Program Development (PAPD) of Jiangsu Higher Education Institutions.

國家自然科學(xué)基金 (No. 31470772)，江蘇省重大神經(jīng)精神疾病診療技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (No. BM2013003)，江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目 (PAPD) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-06-26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150626.1508.001.html

Site-specific PEGylation of recombinant lysostaphin

Hairong Lu1,2, Yitao Zhang1, and Qingshan Huang1,2
1 Shanghai Hi-Tech United Bio-Technological R&D Co. Ltd., Shanghai 201206, China
2 State Key Laboratory of Genetic Engineering, Institute of Genetics, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China

Keywords:lysostaphin, Staphylococcus aureus, antibacterial activity, minimum inhibitory concentration

Abstract:Lysostaphin (Lysn) is an antibacterial metalloendopeptidase that cleaves the pentaglycin bridges in the cell wall of Staphylococci. Although many studies have demonstrated its high activity in vitro, the medical application of Lysn has been hampered by its short half-life in vivo. In order to enhance its stability in vivo without significantly suppressing theenzymatic activity, we designed and tested eight single cysteine substitutions in Lysn for covalent attachment of polyethylene glycol chains (PEGylation). The purified mutants, fully reduced by Dithiothreitol (DTT), were treated with mPEG-MAL(20 kDa). The PEG modification efficiency was above 70% as determined by reverse-phase high-pressure liquid chromatography (HPLC) analysis. The PEG-Lysn proteins were further purified by cation exchange chromatography (MacroCap SP), reaching at least 95% purity. The activities of the PEG-Lysn proteins were determined by the turbidity and minimum inhibitory concentration (MIC) assays. We found that the PEGylated V240C and T244C mutants retained about 50% of the original antibacterial activity of Lysn. Overall, this study will help develop highly stable and active PEG-Lysn to treat systemic S. aureus infections.

DOI:10.13345/j.cjb.150106 10.13345/j.cjb.150107

Corresponding author:Qingshan Huang. Tel: +86-21-65642814; E-mail: qshuang@fudan.edu.cn Guoqiang Xu. Tel: +86-512-65882723; E-mail: gux2002@suda.edu.cn