中試規(guī)模純化重組鼠疫rF1-V融合蛋白及其免疫原性分析

房婷，任軍，張金龍，尹可欣，楊秀旭，于蕊，張曉鵬，于長明

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

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中試規(guī)模純化重組鼠疫rF1-V融合蛋白及其免疫原性分析

房婷，任軍，張金龍，尹可欣，楊秀旭，于蕊，張曉鵬，于長明

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

房婷, 任軍, 張金龍, 等. 中試規(guī)模純化重組鼠疫rF1-V融合蛋白及其免疫原性分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(1): 95–104.

Fang T, Ren J, Zhang JL, et al. Pilot-scale purification of rF1-V fusion protein of Yersinia pestis and characterization of its immunogenicity. Chin J Biotech, 2016, 32(1): 95–104.

摘 要:重組F1-V融合蛋白 (rF1-V) 是目前在進(jìn)行臨床研究的鼠疫亞單位疫苗的主要成分。本研究摸索了rF1-V的可溶表達(dá)條件，并對條件進(jìn)行了優(yōu)化和放大，確定的中試發(fā)酵工藝為：在重組菌對數(shù)生長期中期加入50 μmol/L IPTG，25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h。通過硫酸銨分級沉淀、離子交換、疏水相互作用層析和凝膠過濾四步純化，最終得到純度為99%、回收率大于20%且各項(xiàng)檢測指標(biāo)合格的蛋白。在此基礎(chǔ)上，將蛋白使用氫氧化鋁佐劑進(jìn)行吸附，在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了免疫原性研究。ELISA測定兩次皮下免疫后血清的抗體滴度。比較融合蛋白免疫組 (rF1-V) 與單一抗原免疫組 (rF1、rV) 以及聯(lián)合抗原免疫組 (rF1+rV) 之間體液免疫反應(yīng)的差異。結(jié)果顯示：20 μg rF1-V免疫劑量組誘導(dǎo)的抗F1抗體滴度明顯高于其他組，抗V抗體滴度與其他組相比沒有顯著差異。表明本工藝制備的rF1-V抗原有望作為鼠疫亞單位疫苗的主要組分。

關(guān)鍵詞:鼠疫耶爾森菌，重組F1-V融合蛋白，發(fā)酵，分離純化，免疫原性，亞單位疫苗

Received: February 9, 2015; Accepted: April 27, 2015

Supported by: National Science and Technology Major Project for Infectious Diseases Prevention and Control (No. 2013ZX10004001). Corresponding author: Changming Yu. Tel: +86-10-66948692; E-mail: yuchangming@126.com

國家傳染病重大專項(xiàng) (No. 2013ZX10004001) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-06-08 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150608.1503.006.html

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌 (Yersinia pestis，以下簡稱鼠疫菌) 引起的自然疫源性烈性傳染病。據(jù)記載，在人類歷史上，世界范圍內(nèi)曾暴發(fā)過3次鼠疫大流行，并致使至少1.6億人死亡[1]。人間鼠疫包括腺鼠疫、肺鼠疫、敗血型鼠疫等類型，其中肺鼠疫通過氣溶膠在人與人之間傳播，在不能及時(shí)治療的情況下病死率高達(dá)100%[2-3]。美國疾病預(yù)防控制中心將鼠疫菌歸類為易傳染、高致死率、可引起公眾恐慌社會動蕩、需要進(jìn)行特別公共衛(wèi)生準(zhǔn)備的A類微生物病原體[4]。同時(shí)鼠疫菌被作為傳統(tǒng)的生物戰(zhàn)劑之一，這種廉價(jià)且又容易操作的微生物成為國際恐怖分子制造生物恐怖的首選之一[5]，因此研究鼠疫疫苗對于有效抵御平時(shí)、戰(zhàn)時(shí)的鼠疫威脅均有重要意義。

盡管近期美國FDA (Food and drug administration) 已批準(zhǔn)左氧氟沙星 (Levofloxacin)用于應(yīng)對各種形式的鼠疫 (http://www.fda.gov/ NewsEv-ents/Newsroom/PressAnnouncements/uc m302220.htm)，預(yù)防性疫苗仍是減少鼠疫風(fēng)險(xiǎn)最有效的途徑之一。人用鼠疫疫苗有全細(xì)胞滅活疫苗 (KWCV) 和鼠疫減毒活疫苗 (EV76 株)[6-7]。甲醛滅活的全菌苗 (KWCV) 曾在美國獲得批準(zhǔn)，通常在兩個(gè)月內(nèi)免疫3次，由于可能導(dǎo)致頭疼、發(fā)熱、淋巴結(jié)炎等副反應(yīng)，副反應(yīng)發(fā)生率為10%左右，該疫苗已于1999年停止生產(chǎn)。減毒活疫苗 (EV76株) 是一種色素沉著缺損性突變株的鼠疫菌，這種疫苗可以保護(hù)小鼠抵抗皮下或吸入途徑攻擊鼠疫菌。但人體接種后的副反應(yīng)較大，如頭痛、發(fā)熱、無力等不適，另外有研究表明，小鼠和長尾猴免疫鼠疫減毒活疫苗后有導(dǎo)致死亡的情況[7-9]。因此對鼠疫減毒活疫苗的安全性存在一定的擔(dān)憂。

近20年來，疫苗研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)向以鼠疫菌莢膜蛋白F1 (Fraction 1 capsule，F(xiàn)1)、V毒力因子也稱低鈣反應(yīng)V蛋白 (Low-calcium-response V，LcrV) 和鼠疫菌外膜蛋白 (Yersinia pestis outer membrane protein，Yops) 為架構(gòu)的重組亞單位疫苗[3,10]。其中由F1抗原和V抗原聯(lián)合構(gòu)成的鼠疫亞單位疫苗已成為國內(nèi)外新型鼠疫疫苗研究的熱點(diǎn)，不僅可以有效防護(hù)腺鼠疫，而且可以有效地阻止肺鼠疫的發(fā)生。由英國 (PharmAthene UK Limited) 研發(fā)的rF1+rV疫苗[11-12]已完成一期臨床實(shí)驗(yàn)，美國 (DynPort vaccine company LLC，ACSC company) 研發(fā)的rF1-V融合蛋白疫苗[13-14]已完成二期臨床實(shí)驗(yàn)階段，同時(shí)美國(National institute of allergy and infectious diseases，NIAID) 研發(fā)的以鞭毛蛋白為佐劑的rF1-V融合蛋白疫苗[15]也已完成一期臨床實(shí)驗(yàn)(Clinical Trials govIdentifier: NCT00246467 NCT01122784 NCT01381744)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

工程菌株BL21 (DE3)/pET42a(+)-rF1-V由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2主要材料和儀器

層析柱和填料：離子交換填料：Source30 Q、疏水填料Phenyl Sepharose High Performance裝于XK 26/20柱殼，凝膠過濾預(yù)裝柱：HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade均購于GE Healthcare公司。Anti-mouse IgG-HRP (#2231) 為Santa Cruze公司產(chǎn)品。酵母提取物、胰蛋白胨為OXIOD公司產(chǎn)品。細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品購自廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司?？敲顾?Kanamycin，Kana)為華北制藥公司產(chǎn)品?？筕和抗F1單克隆抗體購自Abcam公司。其余為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。6–8周齡雌性BALB/c小鼠來自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

B. Braun C30plus型生物反應(yīng)器購自德國賽多利斯公司。高壓均質(zhì)機(jī)購自意大利Niro-soavi公司。低溫高速離心機(jī)購自Beckman Coulter公司。SDS-PAGE電泳儀為BIO-RAD公司產(chǎn)品。Image Quant LAS4000mini成像系統(tǒng)和純化儀AKTA EXPLORER均為GE Healthcare公司產(chǎn)品。酶標(biāo)儀Spectra Max Paradigm為Molecular Devices公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1發(fā)酵條件的優(yōu)化和放大

首先在5 L搖瓶 (裝有1 L LB培養(yǎng)基) 的規(guī)模上對誘導(dǎo)OD值、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化。然后將優(yōu)化好的工藝條件放大至C30plus型生物反應(yīng)器，該生物反應(yīng)器總體積42 L，裝載30 L培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.2中試發(fā)酵

挑取工程菌BL21 (DE3)/pET42a(+)-rF1-V接種于5 mL含有30 μg/mL Kana的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h。然后將其接入1 L 含30 μg/mL Kana的LB培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h。最后將其接入42 L生物反應(yīng)器中 (裝有30 L LB培養(yǎng)基)，通過生物反應(yīng)器反饋控制將溫度調(diào)節(jié)為37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為200–400 r/min，溶氧通過通氣量及攪拌轉(zhuǎn)速控制為大于20%，pH通過發(fā)酵罐酸堿流加泵自動反饋流加1 mol/L NaOH或30%磷酸控制為7.0。整個(gè)發(fā)酵過程的發(fā)酵參數(shù)通過賽多利斯MFCS型發(fā)酵智能控制軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控記錄，根據(jù)優(yōu)化條件控制發(fā)酵罐參數(shù)，放罐后離心收集菌體。

1.2.3菌體破碎及硫酸銨分級沉淀

發(fā)酵罐中誘導(dǎo)表達(dá)后，4 ℃、8 000×g離心10 min，收集菌體，稱重。按菌體濕重 (g) 與緩沖液體積 (mL) 為1∶10重懸于緩沖液A (50 mmol/L Tris，2 mmol/L EDTA，5%甘油，pH 9.0)。高壓勻漿 (工作壓力為90 MPa) 后，4 ℃、12 000 r/min離心30 min收集上清。采用硫酸銨分級沉淀，終濃度為40%，冰浴攪拌30 min，4 ℃、10 000 r/min離心30 min，棄上清。沉淀用緩沖液A洗3遍后以2倍于上述體積重懸。

1.2.4離子交換層析

采用Source30Q裝填于XK26/20層析柱內(nèi) (柱體積∶60 mL)，先用1 mol/L NaOH，接觸30 min以上去熱原，緩沖液A線性流速為110 cm/h平衡5–10個(gè)柱體積→上樣→緩沖液A再平衡5–10個(gè)柱體積→緩沖液B (50 mmol/L Tris，1 mol/L NaCl，pH 9.0) 梯度洗脫 30%B、10個(gè)柱體積，收集目的蛋白。

1.2.5疏水相互作用層析

采用Phenyl Sepharose High Performance裝填于XK26/20層析柱內(nèi) (柱體積∶60 mL)，先用 1 mol/L NaOH，接觸30 min以上去熱原，緩沖液C (50 mmol/L Tris，2 mol/L NaCl，pH 9.0)線性流速為110 cm/h平衡5–10個(gè)柱體積→樣品用母液調(diào)節(jié)電導(dǎo)到2 mol/L NaCl離心后上樣→緩沖液C再平衡5–10個(gè)柱體積→緩沖液D (50 mmol/L Tris，pH 9.0) 梯度洗脫 100% D、10個(gè)柱體積，收集目的蛋白。

1.2.6凝膠過濾層析

采用無熱原的凝膠過濾層析柱 (HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade，柱體積∶318 mL)對樣品進(jìn)行精純，緩沖液E為20 mmol/L PB，0.15 mol/L NaCl，pH 7.2，收集目的蛋白峰，用0.2 μm濾膜過濾分裝后保存于–80 ℃待用。

1.2.7純化蛋白的鑒定

將純化好的蛋白分別進(jìn)行蛋白濃度測定(Lowry法)，方法見2010年版《中華人民共和國藥典》 (三部)[16]附錄VI B第二法；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查采用凝膠限度試驗(yàn)，方法見 (2010年版《中華人民共和國藥典》三部[16]附錄XII E)；純度測定-采用還原型SDS-PAGE凝膠電泳法 (2010年版《中華人民共和國藥典》 (三部)[16]附錄IV C)；鑒別試驗(yàn)采用免疫印跡法測定 (2010年版《中華人民共和國藥典》 (三部)[16]附錄VIII A)。N末端氨基酸序列測定和相對分離質(zhì)量測定委托軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器測試中心測定。

1.2.8免疫動物

將本室保存的rF1、rV和純化好的rF1-V融合蛋白與氫氧化鋁佐劑按比例混合，配制成抗原終濃度為0.2 mg/mL的疫苗。將雌性BALB/c (6–8周) 小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別接種20 μg的rF1、rV、rF1-V，和各10 μg的rF1+ rV。后腿進(jìn)行肌肉注射0.1 mL/只，4周后用相同劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫。首次免疫前、末次免疫后，采尾血，分離血清，用ELISA 法測定血清抗體。

1.2.9ELISA 抗體分析

96孔板每孔分別包被100 μL終濃度為5 μg/mL的rF1、rV，免疫后血清作為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠-IgG為二抗，分別測定抗F1和V的抗體滴度，在450 nm測定吸光度，以630 nm為參比波長。陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)為實(shí)驗(yàn)孔A值與陰性對照A值的比值大于或等于2.1。

2　結(jié)果

2.1發(fā)酵條件的優(yōu)化和中試發(fā)酵情況

構(gòu)建的表達(dá)載體pET42a(+)-rF1-V見圖1，首先在5 L搖瓶規(guī)模上對發(fā)酵的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，將收集的菌體按比例重懸，超聲后采用SDS-PAGE分析上清和沉淀，最終確定小試的發(fā)酵條件為：誘導(dǎo)OD600值為0.6，誘導(dǎo)溫度為25 ℃，IPTG濃度為50 μmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為5 h。在以上條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了中試發(fā)酵的摸索，誘導(dǎo)OD值為1.2，其他條件不變。發(fā)酵實(shí)時(shí)監(jiān)控曲線見圖2，由圖可見整個(gè)發(fā)酵過程條件穩(wěn)定，各種參數(shù)無劇烈變化，有利于細(xì)菌生長。而且目的蛋白的表達(dá)量占20%以上，且絕大部分在上清中，實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的高效可溶表達(dá)，有利于后連續(xù)工藝的開展。

2.2菌體破碎和硫酸銨分級沉淀

經(jīng)過逐級摸索和重復(fù)，最終將目的蛋白沉淀的飽和硫酸濃度定為40%，經(jīng)過一步沉淀，可將目的蛋白進(jìn)行有效富集并能起到一定的分離提純的目的 (圖3)，目的蛋白純度從20%提高到50%以上。

圖1　F1-V表達(dá)載體示意圖Fig. 1 Diagram of pET42a(+)-rF1-V expression plasmid.

圖2　rF1-V發(fā)酵參數(shù)曲線Fig. 2 The fermentation parameters curve of rF1-V.

圖3　rF1-V硫酸銨分級沉淀結(jié)果Fig. 3 SDS-PAGE analysis of rF1-V antigen obtained after ammonium sulfate precipitation. 1: marker; 2: the whole cell lysate; 3: the supernatant after homogenate and centrifuge; 4: the precipitation after homogenate and centrifuge; 5: the supernatant after the ammonium sulfate (AS) precipitation; 6: the precipitation after the AS precipitation. The position of rF1-V protein band was marked with an arrow.

2.3層析柱純化情況

目的蛋白經(jīng)過硫酸銨分級沉淀后，分別經(jīng)過Source 30Q、Phenyl HP和Superdex 200三步層析柱純化，目的蛋白純度達(dá)到99%以上 (圖4)，回收率為24% (表1)。

2.4純化蛋白鑒定結(jié)果

將純化所得蛋白進(jìn)行了蛋白質(zhì)濃度和細(xì)菌內(nèi)毒素測定，均符合要求。Western blotting使用本實(shí)驗(yàn)室制備的rF1、rV抗原作陽性對照，一抗使用1∶10 000稀釋的抗V和抗F1單抗，Western印跡表明，rF1-V抗原與抗V、F1抗體均有特異性結(jié)合。rF1-V的理論分子量為52 769 Da，這與檢測結(jié)果一致。N端測序結(jié)果為ADLTA (圖5)，這與預(yù)測的蛋氨酸缺失的N端序列一致。原液分裝后保存在–80 ℃。

2.5抗原在小鼠體內(nèi)的免疫原性分析

利用ELISA法分別檢測各組小鼠抗F1和抗V的抗體滴度，滴度結(jié)果表示為終點(diǎn)滴度倒數(shù)的log10±s，組間抗體效價(jià)的比較采用GraphPad Prism 5.01軟件的多重比較 (One-way ANOVA)。比較結(jié)果P﹤0.05，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖6A說明rF1-V融合蛋白誘導(dǎo)抗F1的抗體滴度明顯高于單一抗原rF1組和聯(lián)合抗原免疫rF1+rV組 (P﹤0.001)，而圖6B則顯示rF1-V融合蛋白誘導(dǎo)抗V的抗體滴度與其他兩組對照組相比沒有顯著性差異。

3　討論

外源蛋白重組表達(dá)系統(tǒng)可分為原核和真核表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)體系是目前最成熟的原核表達(dá)系統(tǒng)，其生產(chǎn)周期短、成本低，但外源蛋白往往因?yàn)楫a(chǎn)物無法正確折疊以包涵體形式聚集[17]。利用基因工程生產(chǎn)外源蛋白，實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)非常重要，可溶性表達(dá)不僅有利于下游的分離純化，而且亦是衡量重組蛋白是否具有生物活性的重要標(biāo)志之一。目前國外重組F1-V融合蛋白表達(dá)主要分為3種情況：一種是不帶標(biāo)簽在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)，后期純化需要對其進(jìn)行復(fù)性[18]；一種是用植物細(xì)胞進(jìn)行可溶性表達(dá)，但表達(dá)量非常低[19]；還有一種是對F1和V進(jìn)行基因改造，使其在大腸桿菌中以可溶形式表達(dá)，但帶有His標(biāo)簽[20]。以上幾種情況均不利于工藝的穩(wěn)定、放大，也會給后期的產(chǎn)品質(zhì)量控制帶來一系列的問題。

前期工作已經(jīng)構(gòu)建了能高效表達(dá)rF1-V的工程菌，本研究對其可溶性表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化和放大，并實(shí)現(xiàn)了中試規(guī)模的高密度培養(yǎng)技術(shù) (High cell density culture，HCDC)。在42 L反應(yīng)器中，通過生物反應(yīng)器反饋控制將溫度調(diào)節(jié)為37 ℃/25 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為 200–400 r/min，溶氧通過通氣量及攪拌轉(zhuǎn)速控制為大于20%，pH值通過發(fā)酵罐酸堿流加泵自動反饋流加1 mol/L NaOH或30%磷酸控制為7.0，最終菌體產(chǎn)量為143 g/批，蛋白表達(dá)量為20.67%，且絕大多數(shù)都在上清中，這為后續(xù)各項(xiàng)工作的開展打下了良好的基礎(chǔ)。

圖4　純化洗脫圖譜和SDS-PAGE匯總圖Fig. 4 Elution profile and SDS-PAEG analysis of every purification step. (A) Elution profile of Source30Q. (B) Elution profile of Phenyl Sepharose HP. (C) Elution profile of Superdex 200. (D) SDS-PAGE analysis of every step. 1: the whole cell lysate; 2: the supernatant after homogenate and centrifuge; 3: the precipitation after the AS precipitation; 4: the fraction collection of Source 30Q; 5: the fraction collection of Superdex 200; 6: the fraction collection of Phenyl HP; 7: marker. The position of rF1-V protein band was marked with an arrow.

表1　rF1V純化過程總結(jié)Table 1 Summary of the purification of rF1V

圖5　rF1-V的Western blotting、N端測序和MALDI-TOF-MS測定結(jié)果圖Fig. 5 The results of Western blotting analysis, N terminal sequencing chromatograms using Edman degradation and MALDI-TOF-MS of rF1-V. (A) Western blotting analysis of rF1-V. 1, 3: purified rF1-V; 2: rF1; 4: rV. (B) N terminal sequencing chromatograms of rF1-V, using Edman degradation. The first five cycles of rF1-V’s N-terminal sequencing is ADLTA. (C) MALDI-TOF-MS of rF1-V for whole protein mass was observed at m/z 52 764. dptu: N,N-diphenylthiourea.

圖6　小鼠免疫后血清中抗F1和抗V的抗體滴度Fig. 6 The serum IgG titer of anti-F1 and anti-V after immunized. (A) The Logarithm of anti-F1 serum IgG titer of female BALB/c (6–8 weeks) mice which were immunized with 20 μg rF1, 10 μg rF1+10 μg rV and 20 μg rF1-V twice (day 0 and day 28). (B) The Logarithm of anti-V serum IgG titer of female BALB/c (6–8 weeks) mice which were immunized with 20 μg rV, 10 μg rF1+10 μg rV and 20 μg rF1-V twice (day 0 and day 28).

在純化工藝的開發(fā)中，充分利用目的蛋白的性質(zhì)，最終將工藝確定為硫酸銨分級沉淀、陰離子交換層析、疏水相互作用層析和凝膠過濾層析的工藝流程。該流程各步驟之間銜接順暢，無需換液、濃縮等中間步驟，在去除雜蛋白的同時(shí)也能有效去除內(nèi)毒素和宿主DNA殘留，目的蛋白純度達(dá)到99%，且各項(xiàng)檢定指標(biāo)合格。同時(shí)，該工藝采用商品化的常規(guī)填料，生產(chǎn)周期較短，且便于線性放大，具有工業(yè)生產(chǎn)的潛力。

免疫原性結(jié)果顯示，與對照rF1、rV以及rF1+V組比較，融合蛋白rF1-V誘導(dǎo)的抗體滴度更高或沒有顯著性差異，抗F1的抗體效價(jià)為1∶128 000、抗V的抗體效價(jià)為1∶640 000。通常來說，血清抗體的水平跟攻毒后小鼠的存活率密切相關(guān)。血清IgG效價(jià)越高，產(chǎn)生的保護(hù)性越好。一般來說，抗F1的抗體效價(jià)達(dá)到1∶1 000 000，抗V的抗體效價(jià)達(dá)到1∶2 000 000，即可以對600 MLD的攻毒產(chǎn)生80%以上的保護(hù)[21]，預(yù)示該疫苗對鼠疫具有良好的保護(hù)效果。

rF1-V融合蛋白疫苗在嚙齒類動物和豚鼠模型中產(chǎn)生了較高的抗體滴度[22-23]和較好的保護(hù)性[13,24]。文獻(xiàn)顯示rF1-V誘導(dǎo)的免疫主要以體液免疫為主，Dinc G等采用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩次免疫rF1-V疫苗后的小鼠淋巴細(xì)胞，結(jié)果顯示該疫苗無法顯著增加表達(dá)IFN-γ、TNF-α的 CD4+或CD8+T細(xì)胞數(shù)量[25]。

我國現(xiàn)分為11種類型的鼠疫自然疫源地，分別分布于19個(gè)省市，其面積占國土整體的15%左右。2014年7月17日甘肅省玉門現(xiàn)鼠疫病例

1人死亡，經(jīng)確診為肺鼠疫 (http://www.qhcdc.-org.cn/Item/2175.aspx)。而肺鼠疫病程急、致死率高，肺鼠疫患者咳嗽產(chǎn)生的帶菌飛沫可經(jīng)呼吸道途徑發(fā)生人-人傳播，導(dǎo)致更加嚴(yán)重的人間鼠疫[2-3]，可見鼠疫的威脅從未遠(yuǎn)離。因此實(shí)現(xiàn)鼠疫疫苗的應(yīng)急化規(guī)模生產(chǎn)，可以提高應(yīng)對鼠疫無論是作為生物武器，還是突發(fā)傳染性疾病的應(yīng)急反應(yīng)與有效處置能力，具有保障人民身體健康、維護(hù)社會穩(wěn)定的重要意義。綜上所述，本研究建立的中試規(guī)模高效純化rF1-V融合蛋白的工藝為該疫苗的應(yīng)急化規(guī)模制備提供一定的技術(shù)支撐。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

生物技術(shù)與方法

Pilot-scale purification of rF1-V fusion protein of Yersinia pestis and characterization of its immunogenicity

Ting Fang, Jun Ren, Jinlong Zhang, Kexin Yin, Xiuxu Yang, Rui Yu, Xiaopeng Zhang, and Changming Yu
Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical, Beijing 100071, China

Abstract:Recombinant F1-V (rF1-V) fusion protein is the main ingredient of the current candidate vaccine against Yersinia pestis infection, which has been under investigation in clinical trial in USA. We investigated the soluble expression conditions of rF1-V in Escherichia coli BL21 (DE3) that we constructed before. After scale-up and optimization of fermentation processes, we got the optimized fermentation process parameters: the culture was induced at the middle exponential phase with 50 μmol/L of IPTG at 25 °C for 5 h. Soluble rF1-V protein was isolated to 99% purity by ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography and gel filter chromatography. The protein recovery was above 20%. Protein identity and primary structure were verified by mass spectrometry and Edman sequencing. Results of purity, quality and western blotting analysis indicated that the target protein is a consistent and properly folded product. Furthermore, the immunogenicity of various antigens formulated with aluminum hydroxide adjuvant was evaluated in mice. Serum antibody titers of 4 groups including 20 μg rF1, rV and rF1-V and 10 μg rF1+10 μg rV, were assayed by ELISA after 2 doses. The antibody titers of anti-F1 with 20 μg rF1-V were obviously higher than titers with other groups; meanwhile there were no significant difference of anti-V antibody titers among them. These findings confirm that rF1-V would be the active pharmaceutical ingredient of the plague subunit vaccine.

Keywords:Yersinia pestis, recombinant F1-V fusion protein, fermentation, purification, immunogenicity, subunit vaccine

DOI:10.13345/j.cjb.150080