大腸桿菌合成1,2,4-丁三醇的途徑優(yōu)化

孫雷，楊帆，朱泰承，李興華，孫紅兵，李寅，許正宏，張延平

1 江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫 2141222 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 1001013 中國科技大學(xué)生命科學(xué)院，安徽 合肥 2300224 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

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大腸桿菌合成1,2,4-丁三醇的途徑優(yōu)化

孫雷1*，楊帆2,3*，朱泰承2，李興華2，孫紅兵4，李寅2，許正宏1，張延平2

1 江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122
2 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101
3 中國科技大學(xué)生命科學(xué)院，安徽 合肥 230022
4 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

孫雷, 楊帆, 朱泰承, 等. 大腸桿菌合成1,2,4-丁三醇的途徑優(yōu)化. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(1): 51–63.

Sun L, Yang F, Zhu TC, et al. Optimization of 1,2,4-butanetriol synthetic pathway in Escherichia coli. Chin J Biotech, 2016, 32(1): 51–63.

摘 要:1,2,4-丁三醇 (BT) 是一種在工業(yè)中有多種用途的重要的非天然化合物。文中通過將外源基因xdh和mdlC導(dǎo)入大腸桿菌BW25113表達(dá)，并敲除了xylA、xylB、yagE、yjhH、yiaE和ycdW等木糖和中間產(chǎn)物代謝旁路基因，構(gòu)建了能夠?qū)-木糖轉(zhuǎn)化為BT的重組菌株。為優(yōu)化BT合成途徑，針對(duì)BT合成途徑中的限速步驟——3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸的脫羧反應(yīng)，進(jìn)行了新酶的篩選和評(píng)價(jià)，獲得了可顯著提高反應(yīng)效率的新的2-酮酸脫羧酶——KivD，并構(gòu)建了表達(dá)該酶的重組菌株BW-025。在此基礎(chǔ)上，通過初步條件優(yōu)化，將BT產(chǎn)量提高至2.38 g/L；進(jìn)一步調(diào)節(jié)途徑中各個(gè)酶的表達(dá)量，探究了它們對(duì)BW-025合成BT的影響，最終獲得了BT產(chǎn)量較BW-025提高了48.62%的重組菌株BW-074。

關(guān)鍵詞:D-木糖，1,2,4-丁三醇，大腸桿菌，2-酮酸脫羧酶，途徑優(yōu)化

Received: March 25, 2015; Accepted: May 4, 2015

Supported by: The Knowledge Innovation Project of the Chinese Academy of Sciences (No. KSCX2-EW-G-5), Beijing Municipal Natural Science Foundation (No. 31170039).

Yanping Zhang. Tel/Fax: +86-10-64807351; E-mail: zhangyp@im.ac.cn

*These authors contributed equally to this study.

中國科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重大項(xiàng)目 (No. KSCX2-EW-G-5)，北京市自然科學(xué)基金 (No. 31170039) 資助。

1,2,4-丁三醇 (1,2,4-butanetriol，簡稱BT)是一種重要的非天然多元醇，在軍工、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。BT最有潛力的應(yīng)用是作為1,2,4-丁三醇三硝酸酯 (BTTN) 的合成前體，后者可代替硝化甘油作為推進(jìn)劑和含能增塑劑，并具有更優(yōu)的理化性質(zhì)[1]。醫(yī)藥方面，BT可被用作陽離子脂質(zhì)體和多種藥物的合成前體[2-4]。此外，BT還可用于合成聚氨酯泡沫、卷煙添加劑和彩色顯影劑等[5-7]。

目前BT的商業(yè)生產(chǎn)多采用NaBH4催化的蘋果酸二酯還原或Ru-C催化的蘋果酸還原等化學(xué)合成法[8-10]。這些合成工藝都存在反應(yīng)條件苛刻、環(huán)境污染嚴(yán)重、生產(chǎn)危險(xiǎn)性大、副產(chǎn)物多等弊端。生物合成法具有原料成本低廉、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、安全高效等優(yōu)點(diǎn)。2003年，Niu等首先提出了BT的生物合成法[10]。該方法以D-木糖或L-阿拉伯糖為底物，經(jīng)過四步酶催化 (圖1) 實(shí)現(xiàn)。整個(gè)工藝使用了莓實(shí)假單胞菌Pseudomonas fragi和大腸桿菌Escherichia coli兩種微生物作為催化劑。之后，研究者將BT轉(zhuǎn)化途徑的四步酶都在E. coli中進(jìn)行表達(dá)，用E. coli即可完成整個(gè)BT的生物轉(zhuǎn)化，大大簡化了轉(zhuǎn)化工藝[11]。但從目前已有報(bào)道來看，用重組E. coli生產(chǎn)BT的催化效率較低，導(dǎo)致BT產(chǎn)量無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求[3,12-13]。如果要進(jìn)一步提高BT的轉(zhuǎn)化效率，首先必須對(duì)BT合成途徑進(jìn)行系統(tǒng)地優(yōu)化，找出催化限速步驟，精確調(diào)節(jié)催化各個(gè)步驟酶的表達(dá)量，以實(shí)現(xiàn)最大的轉(zhuǎn)化通量。

本文在構(gòu)建BT合成工程菌的基礎(chǔ)上，針對(duì)關(guān)鍵限速步驟進(jìn)行了新酶的篩選，并分別調(diào)節(jié)了途徑中各個(gè)酶的表達(dá)量，顯著提高了重組菌株利用木糖合成BT的效率。

1　材料與方法

1.1菌株及質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用菌株及質(zhì)粒見表1。

1.2酶與試劑

PrimeSTAR?HS DNA聚合酶和T4 DNA連接酶為TaKaRa (大連) 公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司。2×Taq PCR StarMix with Loading Dye購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。各試劑盒購自O(shè)mega Bio-tek公司。1,2,4-丁三醇標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。酵母提取物、胰蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品。其余試劑如D-木糖、異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)、硫酸卡那霉素 (Kanamycin)、鹽酸四環(huán)素 (Tetracycline hydrochloride)、NaCl和CaCO3等均為國產(chǎn)。引物由英濰捷基 (上海) 公司合成。

1.3遺傳操作

DNA的克隆、酶切、連接、感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取等基本基因操作技術(shù)參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[14]及試劑盒供應(yīng)商提供的操作手冊(cè)進(jìn)行。文中所用引物見表2。

1.3.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

基因xdh由Genewiz公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成，然后被插入質(zhì)粒pET30a的NdeⅠ和Bgl Ⅱ位點(diǎn)之間，從而獲得pET30a-xdh。基因adhP克隆自E. coli BW25113基因組，引物為adhP-F-NotⅠ和adhP-R-miniPtac-XhoⅠ。通過PCR將引物中的組成型啟動(dòng)子序列miniPtac (或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列Ptac) 與adhP序列融合。T1T2終止子擴(kuò)增自pTAK117載體，引物為T1T2-F-BamHⅠ和T1T2-R-NotⅠ。將兩段基因片段分別插入pET30a-xdh，獲得了重組質(zhì)粒pET30a-xdh-T1T2-adhP-miniPtac。以該質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出xdh-T1T2-adhP-miniPtac片段 (引物為expression cassette 1-F和expression cassette 1-R)，并通過PCR與xylA的上游區(qū)域和xylB的下游區(qū)域融合，獲得xylA up-xdh-T1T2-adhP-miniPtac-xylB down片段，然后將其插入載體pKmTsSacB的XhoⅠ和SalⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建了pKmTsSacB-xdh-adhP。

重組質(zhì)粒pET30a-miniPtac-mdlC的基因合成、測序驗(yàn)證和質(zhì)粒的亞克隆構(gòu)建均委托Genewiz公司完成。其中miniPtac為啟動(dòng)子，并加入AAGGAG的RBS序列，mdlC為根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性，在不改變MdlC氨基酸序列的前提下，對(duì)MdlC的編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到的核苷酸序列，將質(zhì)粒pET30a的SgrAⅠ和NcoⅠ的之間的序列替換為商業(yè)合成的miniPtac-mdlC的SgrAⅠ和NcoⅠ的位點(diǎn)之間的序列，保持pET30a的其他序列不變，將序列正確的重組質(zhì)粒命名為pET30a-miniPtac-mdlC。pET30a-miniPtac-kivD、pET30a-miniPtac-aepY 和pET30a-miniPtac-ipdC等帶有2-酮酸脫羧酶的編碼基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建方法相同。pET30a-miniPtac-2kivD是通過將另一拷貝的kivD基因插入pET30a-miniPtac-kivD而獲得的。

表1　本文所用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Plasmids and strains used in this work

續(xù)表1

表2　本文所用的引物Table 2 Primers used in this work

續(xù)表2

載體pACYC184用于基因xdh、yjhG和adhP的表達(dá)。將擴(kuò)增自pET30a-xdh-T1T2-adhP-miniPtac的xdh-T1T2片段與miniPtac或Ptac融合后插入pACYC184，便分別獲得了重組質(zhì)粒pACYC184-miniPtac-xdh-T1T2和pACYC184-Ptac-xdh-T1T2。pACYC184-miniPtac-adhP-T1T2 和pACYC184-Ptac-adhP-T1T2的構(gòu)建方法相同。將擴(kuò)增自E. coli BW25113基因組的yjhG基因與miniPtac或Ptac融合后插入pACYC184的AhdⅠ和DrdⅠ位點(diǎn)，則獲得了重組質(zhì)粒pACYC184-miniPtac-yjhG和pACYC184-Ptac-yjhG。

1.3.2基因敲除及驗(yàn)證

采用λ Red法[15-17]敲除了已知的導(dǎo)致D-木糖轉(zhuǎn)用的4種旁路基因yagE、yjhH、yiaE和ycdW，獲得菌株BW-004。通過兩輪重組的方法將基因xdh和adhP一起整合至宿主細(xì)胞的基因組中，置換木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶的編碼基因xylA和xylB，以構(gòu)建重組菌株BW-010。具體過程為：第一輪，通過將重組質(zhì)粒pKmTsSacB-xdh-adhP轉(zhuǎn)入BW-004，并在卡那平板上篩選出整合至xylAB位點(diǎn)的單交換型；在第二輪中，在含蔗糖的瓊脂平板上篩選出雙交換的陽性轉(zhuǎn)化株。最后通過菌落PCR進(jìn)行相應(yīng)的驗(yàn)證。

1.3.3重組菌株的構(gòu)建

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒以電擊轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入底盤細(xì)胞BW-010，在質(zhì)粒相應(yīng)的抗性平板上進(jìn)行陽性菌株的篩選，并通過菌落PCR加以驗(yàn)證。

1.4培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)化條件

種子培養(yǎng)基為液體LB培養(yǎng)基 (含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl)，培養(yǎng)條件為37 ℃、200 r/min。取1 mL過夜活化的種子培養(yǎng)物至100 mL LB液體培養(yǎng)基 (裝于500 mL三角搖瓶)，37 ℃、200 r/min條件下預(yù)培養(yǎng)10 h，帶有誘導(dǎo)型表達(dá)基因 (含Ptac啟動(dòng)子) 的菌株還需指數(shù)生長中期 (OD600=0.4) 加入200 mmol/L IPTG以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。

之后對(duì)種子液OD600進(jìn)行測定和計(jì)算，取一定量的菌液離心后再以20 mL補(bǔ)加了20 g/L D-木糖作為唯一碳源的M9培養(yǎng)基[13](含17.08 g/L Na2HPO4·12H2O、3.0 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、1.0 g/L NH4Cl、1 mmol/L MgSO4·7H2O、0.1 mmol/L CaCl2、10 mmol/L NaHCO3和1 μL/mL微量金屬離子溶液) 重懸，然后在30 ℃/33.5 ℃/37 ℃、200 r/min條件下轉(zhuǎn)化72 h。微量金屬離子溶液包含：3.7 g/L (NH4)6(Mo7O24)·4H2O、2.9 g/L ZnSO4·7H2O、15.8 g/L MnCl2·4H2O、24.7 g/L H3BO3和2.5 g/L CuSO4·5H2O。另外可向培養(yǎng)基中加入100 mmol/L MOPS和2.5 g/L CaCO3來控制pH的下降。每種設(shè)置3個(gè)平行。

在上述培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化過程中，視菌株所帶質(zhì)粒情況添加相應(yīng)的抗生素?？敲顾睾望}酸四環(huán)素的工作濃度分別為50 μg/mL和10 μg/mL。

1.5胞外代謝物的檢測

胞外底物、產(chǎn)物和副產(chǎn)物如木糖、木糖酸、乙酸、乳酸、BT等物質(zhì)的濃度測定采用高效液相色譜法。取1 mL菌液室溫下10 000×g離心2 min，取上清用孔徑為0.22 μm的無菌濾膜過濾，采用高效液相色譜法檢測，具體設(shè)備與條件為：柱型Bio-Rad Aminex?HPX-87H Ion Exclusion Column (300 mm × 7.8 mm)，流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫15 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測器為Agilent Technologies 1260 RID (Refractive index detector)。

通過檢測標(biāo)準(zhǔn)品的相應(yīng)數(shù)值計(jì)算樣品中各物質(zhì)的含量。

2　結(jié)果與分析

2.1大腸桿菌中丁三醇合成途徑的構(gòu)建

在構(gòu)建BT的合成途徑之前，我們首先對(duì)宿主細(xì)胞E. coli BW25113進(jìn)行了必要的代謝工程改造。如圖1所示，通過λ Red法敲除了已知D-木糖競爭旁路基因yagE、yjhH、yiaE和ycdW，獲得菌株BW-004。在此基礎(chǔ)上，將新月柄桿菌Caulobacter crescentus的D-木糖脫氫酶的編碼基因xdh和大腸桿菌E. coli中的一個(gè)醇脫氫酶的編碼基因adhP一起整合至宿主細(xì)胞的基因組中，置換木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶的編碼基因xylA和xylB，成功構(gòu)建了重組菌株BW-010。在本研究中，BW-010被用作構(gòu)建利用D-木糖合成BT的工程菌株的底盤細(xì)胞。

之后將BT合成途徑中的另一個(gè)異源基因，來自惡臭假單胞菌Pseudomonas putida的苯甲酰甲酸脫羧酶編碼基因mdlC，與組成型啟動(dòng)子miniPtac融合，并插入多拷貝質(zhì)粒pET30a。通過電擊轉(zhuǎn)化將構(gòu)建的質(zhì)粒pET30a-miniPtac-mdlC導(dǎo)入BW-010，成功得到了BT合成途徑組裝完全的E. coli重組菌株BW-011。該菌株中，BT合成途徑第1步和第3步的催化蛋白Xdh和MdlC為異源蛋白，前者的基因被插入到E. coli染色體上，后者通過表達(dá)載體引入細(xì)胞；催化第2步和第4步的蛋白YjhG和AdhP為E. coli內(nèi)源蛋白，前者利用E. coli本身攜帶的基因進(jìn)行表達(dá)，后者的基因被合成后插入到染色體上增加一個(gè)拷貝。該菌株在20 g/L木糖中轉(zhuǎn)化72 h，可成功地檢測到BT的積累，產(chǎn)量為0.3 g/L(圖2)。

2.22-酮酸脫羧酶的篩選

圖1　E. coli重組細(xì)胞中D-木糖合成1,2,4-丁三醇的代謝途徑Fig. 1 The BT synthetic pathway from D-xylose in the recombinant E. coli. The BT synthetic pathway (in the box) and by-passes (outside the box). Enzymes (coding genes, source) involved: a: D-xylose dehydrogenase (xdh, C. crescentus); b: D-xylonic acid dehydratase (yjhG and yagF, E. coli); c: benzoylformate decarboxylase (mdlC, P. putida); d: alcohol dehydrogenase (adhP, E. coli); e: xylose isomerase (xylA, E. coli); f: xylulokinase (xylB, E. coli); g: 2-Keto acid dehydrogenase (yiaE and ycdW, E. coli); h: 2-Keto-3-deoxy-D-xylonate aldolase (yagE and yjhH, E. coli). The × denotes gene disruption.

圖2　高效液相檢測色譜圖Fig. 2 The HPLC analysis of BT conversion broth. (A) Supernatant from BW-011 broth. (B) Pure BT sample.

為了優(yōu)化BT的合成途徑，需要首先識(shí)別出整個(gè)途徑的限速步驟。由于自然界中尚未發(fā)現(xiàn)天然催化3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸脫羧反應(yīng)的酶，只能選擇其他的2-酮酸脫羧酶替代，因此第3步催化反應(yīng)很可能是整個(gè)反應(yīng)的限速步驟。在上述構(gòu)建BT途徑中，我們參考之前的報(bào)道[10-11]，選擇了來自惡臭假單胞菌P. putida的苯甲酰甲酸脫羧酶。為進(jìn)一步優(yōu)化途徑，我們通過在KEGG等數(shù)據(jù)庫中檢索類似的基團(tuán)反應(yīng)，以期篩選出比MdlC更有效催化3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸脫羧反應(yīng)的2-酮酸脫羧酶。

基于“傾向于選擇能催化與BT合成途徑中第3步反應(yīng)相似基團(tuán)反應(yīng)，但與MdlC的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的2-酮酸脫羧酶”的思路，我們選擇了3種可能可用的2-酮酸脫羧酶 (表3)，其中IpdC 和KivD同屬于吲哚丙酮酸脫羧酶，AepY為磷酸烯醇丙酮酸脫羧酶。對(duì)上述3種2-酮酸脫羧酶進(jìn)行克隆，以miniPtac為啟動(dòng)子，連接到pET30a載體中。將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體pET30a-miniPtac-kivD、pET30a-miniPtac-aepY 和pET30a-miniPtac-ipdC分別轉(zhuǎn)化BW-010感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組菌株BW-025、BW-063和BW-064。

表3　篩選獲得的2-酮酸脫羧酶Table 3 2-Keto acid decarboxylase screened in this work

將重組菌株BW-025、BW-063、BW-064與BW-011一起進(jìn)行搖瓶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，比較其BT的合成能力 (圖3)。與BW-011相比，BW-025的1,2,4-丁三醇產(chǎn)量提高了191%，產(chǎn)量最高，BW-064提高了6.2%，而BW-063幾乎不產(chǎn)1,2,4-丁三醇，表明L. lactis的α-酮異戊酸脫羧酶(KivD) 比MdlC對(duì)3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸的脫羧反應(yīng)有更高的催化效率，能夠提高整條途徑的通量，從而提高重組菌株的1,2,4-丁三醇產(chǎn)量；E. cloacae的吲哚丙酮酸脫羧酶 (IpdC) 催化3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸脫羧反應(yīng)的能力與MdlC相近；而B. fragilis的磷酸丙酮酸脫羧酶(AepY) 不能催化該反應(yīng)。

圖3　表達(dá)不同2-酮酸脫羧酶的重組菌株的1,2,4-丁三醇產(chǎn)量Fig. 3 Effects of different 2-keto acid decarboxylases on BT production.

2.31,2,4-丁三醇轉(zhuǎn)化條件的初步優(yōu)化

主要考察了轉(zhuǎn)化溫度、初始細(xì)胞密度和控制轉(zhuǎn)化pH對(duì)BW-025重組菌株合成BT的影響。如圖4所示，BW-025在33.5 ℃下72 h合成的BT產(chǎn)量最高，分別比30 ℃和37 ℃高出209.64% 和16.57%。BT產(chǎn)量隨著初始菌量的增加而增加，在OD600為30時(shí)達(dá)到最大，初始OD600提升到40時(shí)，BT產(chǎn)量反而有所下降。整個(gè)轉(zhuǎn)化過程中，由于木糖酸和其他酸性中間產(chǎn)物的積累，pH值不斷下降 (結(jié)果未顯示)。通過向培養(yǎng)基中添加100 mmol/L MOPS與0.05 g輕質(zhì)CaCO3，可有效減緩轉(zhuǎn)化體系pH值的下降。BW-025的BT產(chǎn)量也在72 h內(nèi)提高了41.57%。綜合以上各最優(yōu)條件，BW-025在72 h最高可產(chǎn)BT 2.38 g/L。

圖4　不同轉(zhuǎn)化條件對(duì)BW-025合成1,2,4-丁三醇的影響Fig. 4 Comparison of BT production with different conversion conditions. BT production of BW-025 with different temperatures(A), initial cell densities (OD600) (B) and pH control (C) were evaluated.

2.4丁三醇合成途徑中各步酶表達(dá)量的調(diào)節(jié)優(yōu)化

在篩選到KivD后，菌株的BT產(chǎn)量得到顯著提高，證明第3步酶確實(shí)是整個(gè)BT合成的限速步驟。為了考察繼續(xù)提高KivD的表達(dá)量是否進(jìn)一步增強(qiáng)1,2,4-丁三醇的合成，我們首先考察了提高KivD表達(dá)量對(duì)BT合成的影響。分別通過更換強(qiáng)啟動(dòng)子和增加拷貝數(shù)的方法，將重組質(zhì)粒pET30a-Ptac-kivD和pET30a-miniPtac-2kivD分別轉(zhuǎn)化至BW-010中，構(gòu)建了重組菌株BW-055和BW-059。兩者與BW-025的搖瓶發(fā)酵72 h后的1,2,4-丁三醇產(chǎn)量如圖5所示，與BW-025相比，BW-055的丁三醇產(chǎn)量降低了32.1%，BW-059降低了6.9%?？赏茰yKivD不是現(xiàn)有1,2,4-丁三醇合成途徑的限速酶。

圖5　在BW-025基礎(chǔ)上分別過表達(dá)編碼途徑中四種酶的基因?qū)?,2,4-丁三醇產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effects of expression levels of kivD, yihG, adhP and xdh on BT production of BW-025, respectively.

為了確定其他催化步驟是否限制了BT的合成，將重組質(zhì)粒pACYC184-miniPtac-yjhG和pACYC184-Ptac-yjhG分別與pET30a-miniPtackivD共同轉(zhuǎn)入BW-010感受態(tài)細(xì)胞，得到了催化第二步反應(yīng)的酶YjhG過表達(dá)的重組菌株BW-056和BW-058；將重組質(zhì)粒pACYC184-miniPtac-adhP-T1T2和pACYC184- Ptac-adhPT1T2分別與pET30a-miniPtac-kivD共同轉(zhuǎn)入BW-010感受態(tài)細(xì)胞，獲得催化第四步反應(yīng)的酶AdhP過表達(dá)的重組菌株BW-066和BW-067；通過將重組質(zhì)粒pACYC184-miniPtac- xdh-T1T2 和pACYC184-Ptac-xdh-T1T2分別與pET30aminiPtac-kivD共同轉(zhuǎn)入BW-010感受態(tài)細(xì)胞，則構(gòu)建了催化第一步反應(yīng)的酶Xdh過表達(dá)的重組菌株BW-073和BW-074。

將上述6種重組菌株與BW-025一起進(jìn)行搖瓶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，比較其BT的合成能力 (圖5)。與BW-025相比，過表達(dá)了YjhG的重組菌株BW-056和BW-058的BT產(chǎn)量略有提高，但均不明顯；BW-025過表達(dá)AdhP后，BT產(chǎn)量有所下降。而過表達(dá)Xdh的重組菌株BW-073和BW-074其BT產(chǎn)量較BW-025均有提高，尤其是編碼基因xdh誘導(dǎo)型表達(dá)的BW-074的BT產(chǎn)量，提高了48.62%。

3　討論

丁三醇是一種具有重要應(yīng)用前景的多元醇，但作為一種非天然化合物，其生物轉(zhuǎn)化途徑仍面臨著途徑效率低的問題，因此對(duì)于BT合成途徑的優(yōu)化至關(guān)重要。為了實(shí)現(xiàn)此目的，首先應(yīng)當(dāng)識(shí)別整個(gè)催化過程的限制性步驟。Cao等利用重組E. coli轉(zhuǎn)化木糖生產(chǎn)木糖酸可達(dá)到理論得率的近88%[18]，Valdehuesa等報(bào)道了用重組E. coli轉(zhuǎn)化木糖生產(chǎn)BT時(shí)，有82.28%的木糖轉(zhuǎn)化為木糖酸，但只有10.25%的木糖最終轉(zhuǎn)化為BT[3,19]，這表明后三步酶催化可能是整個(gè)途徑的限速步驟。

由于第三步脫羧反應(yīng)是非天然催化反應(yīng)，同時(shí)脫羧反應(yīng)又是不可逆反應(yīng)，可推測該步反應(yīng)極有可能是整個(gè)反應(yīng)的限制性步驟[20]，因此選擇從脫羧反應(yīng)入手優(yōu)化BT合成途徑。之前所有的報(bào)道，都沿用Niu等采用的來自惡臭假單胞菌的苯甲酰甲酸脫羧酶MdlC[3,10-12,21]。為了尋找與3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸更加匹配的底物，我們嘗試了其他微生物來源的不同類型的脫羧酶：吲哚丙酮酸脫羧酶 (IpdC和KivD)，磷酸烯醇丙酮酸脫羧酶 (AepY)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明來自乳酸乳球菌L. lactis的α-酮異戊酸脫羧酶KivD的催化活力比MdlC提高了191%。因此，通過對(duì)于新的2-酮酸脫羧酶的篩選很大程度上解決了第三步酶對(duì)整個(gè)催化途徑的限制。

在途徑通量的優(yōu)化過程中，一個(gè)限速反應(yīng)的解決通常會(huì)導(dǎo)致其他反應(yīng)會(huì)成為新的限制步驟。在篩選到KivD的工作基礎(chǔ)上，我們通過對(duì)其他三步酶的表達(dá)量進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)一步考察了其他3個(gè)反應(yīng)是否會(huì)成為新的限速步驟。研究表明，YjhG的過表達(dá)對(duì)于BT產(chǎn)量的提升不明顯，表明此時(shí)YjhG的表達(dá)量并不構(gòu)成對(duì)整個(gè)途徑的限制。醇脫氫酶AdhP的過量表達(dá)對(duì)于BT產(chǎn)量有一定的副作用，由于E. coli體內(nèi)的AdhP具有多種功能，具有較寬的底物范圍[22-25]，因此推測AdhP的過表達(dá)會(huì)對(duì)宿主的代謝造成較大的干擾。Xdh的過表達(dá)使得整個(gè)途徑的催化效率又提高了48.62%，這表明在KivD的限制性因素得到解決后，Xdh的表達(dá)可能成為整個(gè)反應(yīng)新的限速步驟。因此，本研究為BT的合成途徑優(yōu)化提供了很好的參考，后續(xù)工作可以在Xdh和KivD過表達(dá)菌株的基礎(chǔ)上，對(duì)合成途徑進(jìn)行新一輪的優(yōu)化，以進(jìn)一步提高BT的產(chǎn)量。

除了對(duì)BT途徑的優(yōu)化外，本文還對(duì)BT的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了初步的探索。轉(zhuǎn)化初始菌量的提高可顯著增加BT的轉(zhuǎn)化效率，這是可以理解的。但當(dāng)OD600達(dá)到40時(shí)，BT的產(chǎn)量卻有所下降。我們推測，過高的菌量可能會(huì)造成溶氧不足，引起中間代謝產(chǎn)物的積累。我們?cè)谵D(zhuǎn)化發(fā)酵液中確實(shí)檢測到乙酸、乳酸和乙二醇等的積累 (結(jié)果未顯示)，這些代謝副產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)重組菌的生長和代謝造成不利影響，從而最終影響到BT的轉(zhuǎn)化效率。

綜上所述，本文首先成功構(gòu)建了以20 g/L D-木糖為底物合成0.3 g/L BT的E. coli工程菌株BW-011。之后對(duì)BT合成途徑中的瓶頸進(jìn)行了分析，確定了3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸的脫羧反應(yīng)這一限速步驟，選出了幾種可能催化該反應(yīng)的2-酮酸脫羧酶并在底盤細(xì)胞BW-010中表達(dá)，找出了催化效率更高的新酶KivD，獲得了BT產(chǎn)量更高的重組菌株BW-025。探究了溫度、初始細(xì)胞密度和pH等條件對(duì)BW-025合成BT的影響，轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化 (轉(zhuǎn)化溫度33.5 ℃、初始OD600在20–40、向培養(yǎng)基中添加緩沖劑) 后BW-025在72 h內(nèi)最高可合成BT 2.38 g/L。與此同時(shí)，進(jìn)一步對(duì)BW-025的BT合成途徑中各個(gè)酶的表達(dá)量進(jìn)行調(diào)節(jié)，評(píng)價(jià)了其對(duì)BT合成的影響，其中誘導(dǎo)型過表達(dá)xdh的重組菌株BW-074的BT得率較BW-025提高了48.62%，表明通過此方法對(duì)BT合成途徑進(jìn)行優(yōu)化的思路是可行的。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)

Optimization of 1,2,4-butanetriol synthetic pathway in Escherichia coli

Lei Sun1*, Fan Yang2,3*, Taicheng Zhu2, Xinghua Li2, Hongbing Sun4, Yin Li2, Zhenghong Xu1, and Yanping Zhang2
1 Laboratory of Pharmaceutical Engineering, School of Pharmaceutical Science, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
2 CAS Key Laboratory of Microbial Physiological and Metabolic Engineering, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
3 School of Life Sciences, University of Science and Technology of China, Hefei 230022, Anhui, China
4 National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

Abstract:1,2,4-Butanetriol (BT) is an important non-natural chemical with a variety of industrial applications. A recombinant Escherichia coli biosynthesizing BT from D-xylose was constructed by heterologously expressing xdh and mdlC, and knocking out competing pathway genes including xylA, xylB, yjhE, yagH and ycdW. To optimize BT synthesis pathway, the third catalytic step that catalyzes the decarboxylation reaction of 3-deoxy-D-glycero-pentulosonic acid was identified as a potential bottleneck. Consequently, 2-keto acid decarboxylases from three different microorganisms were screened, and the kivD gene from Lactococcus lactis was found to increase BT titer by 191%. The improved strain BW-025 reached a final BT titer of 2.38 g/L under optimized transformation conditions. Attempts on synthetic pathway optimization were also made by fine-tuning the expression levels of each enzyme involved in the whole pathway based on BW-025. As a result, an xdh overexpressed recombinant strain, BW-074 was finally generated, with 48.62% higher BT production than that of BW-025.

Keywords:D-xylose, 1,2,4-butanetriol, Escherichia coli, 2-keto acid decarboxylase, pathway optimization

DOI:10.13345/j.cjb.150126

Corresponding authors: Zhenghong Xu. Tel/Fax: +86-510-85918206; E-mail: zhenghxu@jiangnan.edu.cn