一種非手術(shù)性小鼠胚胎移植技術(shù)

段新崇，李陽，邸科前，黃勇，李相運

1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河北 保定　071001 2 河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，河北 保定　071001 3 重慶市畜牧科學(xué)院畜牧工程研究所，重慶　402460

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一種非手術(shù)性小鼠胚胎移植技術(shù)

段新崇1，李陽1，邸科前2，黃勇3，李相運1

1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河北 保定071001 2 河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，河北 保定071001 3 重慶市畜牧科學(xué)院畜牧工程研究所，重慶402460

段新崇, 李陽, 邸科前, 等. 一種非手術(shù)性小鼠胚胎移植技術(shù). 生物工程學(xué)報, 2016, 32(4): 440–446.

Duan XC, Li Y, Di KQ, et al. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Chin J Biotech, 2016, 32(4): 440–446.

摘要:為了提高非手術(shù)性小鼠胚胎移植技術(shù)的成功率，利用塑料移植導(dǎo)管模擬非手術(shù)胚胎移植過程，通過觀察染料在子宮角的分布而評估胚胎移植效果，并在此基礎(chǔ)上將自然妊娠3.5 d的小鼠囊胚經(jīng)子宮頸移植受體小鼠。結(jié)果表明：將CD-1小鼠囊胚移植假孕2.5 d小鼠單側(cè)子宮角，平均70.9%的胚胎能夠發(fā)育至成活新生仔鼠，建立了高效非手術(shù)性小鼠胚胎移植技術(shù)。該方法簡便快捷、不易污染、費用低，無需專業(yè)的手術(shù)器械，且符合實驗動物倫理原則，完全可以取代手術(shù)法胚胎移植技術(shù)，更重要的是，它為人類和其他大動物的胚胎移植提供了研究模型。

關(guān)鍵詞:小鼠，非手術(shù)性胚胎移植，囊胚，子宮損傷，胚胎丟失

Received: July 20, 2015; Accepted: October 10, 2015

Supported by: Natural Science Foundation of Hebei Province (No. C2012204047), Young Scientist Foundation of Hebei Province (No. C2014201186).

Yong Huang. Tel: +86-23-46792355; E-mail: huangyongcqbb@126.com

小鼠是發(fā)育生物學(xué)和生殖生物學(xué)研究的重要模式動物，其胚胎移植技術(shù)是體外受精、嵌合體、轉(zhuǎn)基因、克隆、胚胎冷凍種子庫等研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。小鼠胚胎子宮移植技術(shù)包括手術(shù)法和非手術(shù)法，手術(shù)法通過皮膚和肌肉的切口暴露子宮，然后將胚胎移植并縫合切口[2]。該方法繁瑣費時且需要專用的手術(shù)器械，術(shù)后易感染并增加小鼠痛苦，而非手術(shù)法簡單易行，節(jié)約時間，節(jié)約費用，對小鼠損傷小，不易感染，恢復(fù)快，對操作者專業(yè)技能的要求大大降低，同時也符合實驗動物福利原則[3]。

早在1951年Beatty等就報道了非手術(shù)性小鼠胚胎移植技術(shù)[4]，試圖將胚胎移植導(dǎo)管穿過小鼠子宮頸而將胚胎植入子宮角，但受當(dāng)時技術(shù)水平的制約，將59枚囊胚移植到13只受體小鼠，僅出生了5只小鼠，其移植成功率非常低，但卻證明了小鼠非手術(shù)胚胎移植的可能性。1974年Marsk首次采用微量注射裝置進行移植，以及1980年我國王培生也采用Marsk的移植裝置進行移植，除了裝置繁瑣不易操作外，移植時易造成胚胎丟失，成功率為40%。1981 年Davis使用外徑0.4 mm玻璃管進行移植，移植管進入受體鼠子宮角的長度為4 cm左右，對其損傷較大，成功率僅為30%。此后，多位研究人員對此方法不斷進行改進[5-9]，這些改進包括移植導(dǎo)管的材質(zhì)、管徑、質(zhì)地、注射裝置以及移植技術(shù)等方面，但移植成功率始終維持在35%左右，且結(jié)果不穩(wěn)定。2009年，美國科學(xué)家申請了一項關(guān)于小鼠非手術(shù)胚胎移植技術(shù)的發(fā)明專利，且商業(yè)生產(chǎn)銷售小鼠非手術(shù)胚胎移植導(dǎo)管NSET (Nonsurgical embryo transfer device)，但該專利產(chǎn)品的致命缺陷依舊是胚胎移植成功率低且結(jié)果不穩(wěn)定[10]，這嚴重制約了該技術(shù)的推廣和應(yīng)用。本研究從移植導(dǎo)管的材質(zhì)、質(zhì)地、形狀、管徑、移植深度、胚胎數(shù)量、移植培養(yǎng)基體積、麻醉劑、假孕鼠天數(shù)以及移植技術(shù)等環(huán)節(jié)對該方法進行改進，以期建立高效小鼠非手術(shù)胚胎移植技術(shù)。

1　材料與方法

1.1小鼠

實驗小鼠CD-1品系購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。所有小鼠均采用12 L:12 D循環(huán)光照 (6∶00?18∶00光照)，清潔級小鼠房，溫度22–25 ℃，濕度50%?60%，小鼠自由采食和飲水。

1.2胚胎與受體小鼠

通過觀察外陰部的變化，挑選處于發(fā)情期的雌鼠 (4?8周齡) 與公鼠或者結(jié)扎公鼠在下午18∶00點合籠，次日清晨檢查陰道栓，與公鼠合籠見栓的雌鼠當(dāng)天記作妊娠0.5 d，在3.5 d時從子宮收集囊胚；與結(jié)扎公鼠合籠見栓的雌鼠當(dāng)天記做假孕0.5 d，作為胚胎移植的受體。

1.3胚胎移植導(dǎo)管和移植溶液

小鼠非手術(shù)法胚胎移植導(dǎo)管由英國德薩生物科技有限公司 (Tirzah Biotech Limited, Oxford, United Kingdom) 提供，使用方法參照該公司的產(chǎn)品使用說明。胚胎移植液選擇M2溶液[2]。

1.4非手術(shù)胚胎移植

將2.5 μL的移液器與胚胎移植導(dǎo)管連接，在顯微鏡下輕壓移液器，緩慢將6–10枚囊胚吸入移植導(dǎo)管中。將受體小鼠置于鼠籠上，使其前爪緊抓住籠子，拇指和食指抓住小鼠尾根，輕輕提起。將開膣器插入小鼠陰道，在纖維冷光源下觀察子宮頸口。將吸有胚胎的移植導(dǎo)管插入子宮頸并緩慢推入子宮角，當(dāng)移植導(dǎo)管全部進入子宮后，迅速按壓移液器按鈕將胚胎移入子宮角，此時抓住尾根的拇指和食指同時抓住移植導(dǎo)管，另一只手緩慢旋轉(zhuǎn)移液器，將移植導(dǎo)管和移液器分開，移植導(dǎo)管在小鼠子宮內(nèi)保持 3 min后再取出 (圖1)。并且以假孕2.5 d受體鼠的手術(shù)法囊胚移植作對照[2]，并將不同時間的實驗數(shù)據(jù)累計。

圖1　小鼠非手術(shù)胚胎移植Fig. 1　Nonsurgical embryo transfer in mice. (A) An anesthetized recipient mouse. (B) Grasp the base of the tail using thumb and forefinger and speculum was inserted into vagina. (C) The device of transcervical embryo transfer were inserted into a uterine horn. (D) The device was keeping in the body of recipient for 3 min.

2　結(jié)果與分析

2.1移植導(dǎo)管造成子宮內(nèi)膜損傷

在非手術(shù)法胚胎移植過程中，當(dāng)移植導(dǎo)管穿過子宮頸進入子宮角時，很可能會對子宮內(nèi)膜造成損傷，甚至扎穿子宮壁而進入腹腔。我們利用45只假孕2.5 d小鼠，模擬非手術(shù)胚胎移植過程，觀察移植導(dǎo)管是否造成子宮內(nèi)膜損傷。實驗表明：45只小鼠單側(cè)子宮角都出現(xiàn)不同程度的損傷，肉眼和顯微鏡下觀察，子宮內(nèi)膜出現(xiàn)一條紅色的劃痕 (圖2A)，劃痕長度約0.6 cm，其中5只小鼠的子宮角被扎穿，且扎穿部位都位于子宮角后約1/3處子宮系膜的對側(cè)(圖3)。

圖2　非手術(shù)胚胎移植造成小鼠子宮損傷Fig. 2　Uterine injury caused by nonsurgical embryo transfer catheter in recipient mice. The transfer device caused severe uterine injury (arrow) in nonanesthetized recipient (A) than that of anesthetized recipient (B).

圖3　非手術(shù)胚胎移植導(dǎo)管在子宮系膜對側(cè)扎穿子宮角Fig. 3　An antimesometrial puncture caused by nonsurgical embryo transfer catheter in recipient mice (2×).

2.2麻醉減輕移植導(dǎo)管對子宮內(nèi)膜的損傷

胚胎移植導(dǎo)管對子宮內(nèi)膜造成的損傷很可能會影響胚胎的著床和發(fā)育。將移植導(dǎo)管插入妊娠3.5 d的小鼠的任一側(cè)子宮角，故意造成子宮內(nèi)膜不同程度的損傷，10 d后觀察胎兒發(fā)育狀況。移植導(dǎo)管插入子宮的次數(shù)越多，造成子宮內(nèi)膜的損傷越嚴重，從而導(dǎo)致胎兒發(fā)育嚴重受阻，并出現(xiàn)大量死胎 (圖4)。因此，在胚胎移植過程中，應(yīng)盡量減少移植導(dǎo)管反復(fù)插入子宮的次數(shù)。如果小鼠處于麻醉狀態(tài)，子宮松弛，子宮壁的緊張程度降低，可能會減輕移植導(dǎo)管對子宮的損傷。利用1.25%阿佛丁麻醉劑，小鼠每10克體重腹腔注射0.2 mL進行麻醉，通過對18只假孕2.5 d小鼠麻醉實驗發(fā)現(xiàn)：麻醉顯著減輕移植導(dǎo)管對子宮內(nèi)膜的損傷 (圖2B)，且沒有出現(xiàn)移植導(dǎo)管扎穿子宮壁的現(xiàn)象。

圖4　非手術(shù)胚胎移植導(dǎo)管影響小鼠胎兒發(fā)育Fig. 4　Nonsurgical embryo transfer catheter caused uterine injury and then impaired fetal development. For catheter, single insert in uterine horn slightly impaired fetal development (A, right horn), and three time inserts caused severe fetal death (B, left horn).

2.3胚胎在子宮內(nèi)的遷移運動

胚胎移入子宮后，隨著移植導(dǎo)管的后退，胚胎是否會溢出子宮角而遷移至子宮頸或者陰道內(nèi)，這是影響胚胎著床發(fā)育的重要因素。為了評估胚胎移入后在子宮內(nèi)的遷移狀況，我們利用移植導(dǎo)管將1%的臺盼藍染液移入36只假孕2.5 d的小鼠單側(cè)子宮，通過觀察染液在子宮內(nèi)的分布狀況而推測胚胎的遷移運動范圍。實驗發(fā)現(xiàn)：在36只小鼠中都存在染液伴隨移植導(dǎo)管后退而向后遷移的現(xiàn)象 (圖5A)：只有3只小鼠的染料靠近子宮中段，16只染料充滿子宮中后段，9只染料在子宮后段并且將子宮頸也染成了藍色，8只染料在整個子宮角均有分布。據(jù)此我們推斷，胚胎移入子宮后也會伴隨移植導(dǎo)管的后退而向后遷移，增加胚胎遷移至子宮頸和陰道的可能性，降低胚胎著床率。提高胚胎移入子宮后向卵巢方向遷移的可能性肯定會提高胚胎的著床和發(fā)育，不僅因為胚胎著床位置適宜，更重要的是靠近卵巢方向的子宮角沒有受到移植導(dǎo)管的損傷，正如圖2所示，移植管對子宮角的損傷大多都是在子宮系膜對側(cè)靠近子宮頸一端1/3處。

圖5　胚胎移植導(dǎo)管延遲退出抑制染料向子宮頸方向遷移Fig. 5　Migration of Trypan Blue dye to cervix was inhibited by delayed catheter withdrawal. After a mimical embryo transfer with trypan blue dye was completed, the dye can migrated to cervix while the catheter was immediately withdrawn from uterine horn (A). Contrary, the dye can significantly move to uterine oviduct end while the catheter was delayed to withdraw for three minutes from uterine horn (B).

2.4延遲移植導(dǎo)管退出促進胚胎向子宮卵巢端遷移

胚胎伴隨移植導(dǎo)管的后退而向后遷移很可能會影響胚胎的著床和發(fā)育，為了阻止胚胎向后遷移，當(dāng)注射胚胎后，將移植導(dǎo)管在子宮內(nèi)停留3 min，這樣可使胚胎因子宮收縮而向子宮角卵巢端遷移或者向移植導(dǎo)管內(nèi)遷移，遷移到移植導(dǎo)管內(nèi)的胚胎可再次被收集并移植另外受體小鼠，避免胚胎丟失。而遷移至子宮角卵巢端的胚胎由于不存在子宮內(nèi)膜損傷而促進了其著床和發(fā)育。通過32只假孕2.5 d小鼠染料模擬胚胎移植過程發(fā)現(xiàn)：延遲移植導(dǎo)管退出可顯著促進染料向子宮角卵巢端遷移 (圖5B)，相應(yīng)地也會促進胚胎向子宮角卵巢端遷移。

2.5假孕鼠天數(shù)影響非手術(shù)性小鼠胚胎移植

利用染料模擬非手術(shù)胚胎移植過程，優(yōu)化每個操作細節(jié)，減少移植導(dǎo)管對子宮的損傷，阻止胚胎伴隨移植導(dǎo)管的后退而后移，防止胚胎丟失或者著床位置異常，然后，在此基礎(chǔ)上，收集3.5 d小鼠囊胚分別移植假孕1.5 d、2.5 d、3.5 d和4.5 d受體小鼠，從表1可以看出，雖然不同天數(shù)假孕鼠都有仔鼠出生，但出生率差異顯著，其中，2.5 d假孕鼠受體的移植成功率最高，將206枚囊胚移植到30只假孕2.5 d小鼠子宮內(nèi)，有28只小鼠妊娠，妊娠率93.3%，共出生小鼠146只，出生率70.9%。作為對照組，利用手術(shù)法移植150枚囊胚至15只2.5 d受體子宮內(nèi)，13只小鼠妊娠，共出生113只小鼠，出生率75.3%。

表1　不同假孕鼠對非手術(shù)性小鼠胚胎移植的影響Table 1　 Influence of different pseudopregnant recipient mice on nonsurgical embryo transfer

3　討論

本研究綜合考慮移植導(dǎo)管、受體鼠、胚胎丟失、子宮損傷等因素，成功建立了高效簡便的非手術(shù)性小鼠胚胎移植技術(shù)。利用該胚胎移植導(dǎo)管，將自然妊娠3.5 d小鼠囊胚經(jīng)子宮頸移植假孕2.5 d受體小鼠子宮角，平均70.9%的囊胚能夠發(fā)育至成活新生仔鼠，與手術(shù)法胚胎移植技術(shù)相比，該方法簡便快捷、效率高、不易污染、費用低，且對小鼠損傷小，符合實驗動物倫理法則，而且，該方法還為研究大動物和人類非手術(shù)胚胎移植技術(shù)建立了合適的模型。

非手術(shù)性小鼠胚胎移植技術(shù)早在1951年就有報道[4]，其移植成功率始終徘徊在35%左右，且結(jié)果不穩(wěn)定，這嚴重限制了該技術(shù)的推廣應(yīng)用[5-10]。與2009年Green發(fā)明的名為NSET小鼠非手術(shù)胚胎移植器相比[10]，本研究的移植成功率 (70.9%) 顯著高于NSET的移植成功率(45%)。為了排除胚胎自身質(zhì)量對移植技術(shù)的影響，本研究僅將形態(tài)正常的自然妊娠3.5 d的小鼠囊胚移植到假孕鼠子宮角內(nèi)，沒有移植體外操作胚胎，如體外受精胚胎、體外培養(yǎng)培養(yǎng)、嵌合胚胎、冷凍和轉(zhuǎn)基因胚胎等。本研究以及前期研究表明：不論是體內(nèi)正常胚胎還是體外操作胚胎，非手術(shù)法和手術(shù)法胚胎移植的效率相當(dāng)，小鼠非手術(shù)法胚胎移植技術(shù)完全可以替代手術(shù)法胚胎移植技術(shù)[9-13]。除胚胎移植外，還可利用該技術(shù)向小鼠子宮移植其他試驗材料，如精液、藥物等[14-15]。

小鼠子宮內(nèi)膜非常脆弱，插入移植導(dǎo)管很容易造成內(nèi)膜損傷，導(dǎo)管經(jīng)過之處出現(xiàn)明顯的淤血劃痕，這必然影響胚胎著床[16-18]，甚至造成著床后的胚胎早期死亡。如果將移植導(dǎo)管的前端烤至鈍園，并結(jié)合移植手法和小鼠保定方法，即可最大限度減少子宮損傷。玻璃管和特氟龍管比較，后者比較軟，可以減少移植過程中對子宮的損傷。根據(jù)小鼠子宮平均長度和所選導(dǎo)管的材質(zhì)，確定移植導(dǎo)管長度為2.5 cm，若長度增加導(dǎo)致硬度不夠會使移植導(dǎo)管不易進入子宮頸口，若長度減小導(dǎo)致硬度加大會使移植導(dǎo)管刺穿子宮的幾率增加。根據(jù)小鼠子宮角在體內(nèi)的位置，將移植導(dǎo)管彎曲30°的弧度，顯著減小對子宮內(nèi)膜的損傷及刺穿子宮角的可能性。

受體鼠體重在28?30 g合適，其子宮較大，子宮壁較厚，移植管造成的損傷較小且刺穿子宮壁的可能性降低，有利于提高胚胎移植成功率。雖然假孕1.5、2.5、3.5、4.5 d的母鼠都可以作為受體，但以假孕2.5 d的受體成功率最高[19-20]。非手術(shù)法胚胎移植由于很難分辨小鼠左右子宮角，所以只是隨機單側(cè)子宮角移植。同時，也無法排除子宮畸形或者異常的受體小鼠。本研究所用小鼠為CD-1品系，每胎平均產(chǎn)仔12只，依此確定非手術(shù)法移植胚胎的數(shù)目為每只受體6?8枚。

移植過程中胚胎丟失是造成移植成功率低下的重要原因，經(jīng)過大量模擬研究發(fā)現(xiàn)：造成胚胎丟失的原因主要有三方面。一是由于子宮收縮蠕動將胚胎擠出子宮角造成丟失；二是由于移植導(dǎo)管后退而將胚胎帶出子宮角；三是由于子宮頸粘液堵塞移植導(dǎo)管導(dǎo)致胚胎丟失。本研究相應(yīng)地采用麻醉、延遲、疏通三種措施很好地解決了這些問題：受體鼠麻醉后減輕了子宮收縮并進而減輕移植導(dǎo)管對子宮造成的損傷；延遲移植導(dǎo)管退出子宮角阻滯了移入子宮角胚胎的后移；移植前先用另外一個不含胚胎的移植導(dǎo)管疏通子宮頸去除粘液，并且在移植導(dǎo)管的前端做一個1 mm的氣泡保護胚胎，減少了胚胎丟失。

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(本文責(zé)編陳宏宇)

A nonsurgical embryo transfer technique in mice

Xinchong Duan1, Yang Li1, Keqian Di2, Yong Huang3, and Xiangyun Li1
1 College of Animal Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei, China 2 Centre of Laboratory Animal Faculty of Medicine, Hebei University, Baoding 071001, Hebei, China 3 Institute of Animal Husbandry Engineering, Chongqing Academy of Animal Sciences, Chongqing 402460, China

Abstract:Although efficient nonsurgical transfer of embryos in mice would provide many advantages over a surgical method, the low success rate of nonsurgical transfer has hampered its acceptance and use. Here, a plastic catheter was usedto mimic embryo transfer process and then the transfer efficiency was evaluated by intrauterine trypan blue dye dispersion. Also 3.5-day blastocysts from natural pregnant mice were transferred through cervix into uterine horns. The results show that 70.9% of CD-1 mouse 3.5-day blastocysts transferred into unilateral uterine horns of pseudopregnant 2.5-day recipients can be developed to live newborns, and an efficient mouse nonsurgical embryo transfer technique was established. The technique was simple, rapid, inexpensive, unlikely to get contaminated, ethical and do not need specialized apparatus, and can completely replace surgical embryo transfer techniques. Moreover, the mouse nonsurgical embryo transfer technique provides a research model for human and other large animal embryo transfer.

Keywords:mouse, nonsurgical embryo transfer, blastocysts, uterine injury, embryo lost

DOI:10.13345/j.cjb.150333

Corresponding authors: Xiangyun Li. Tel: +86-312-7528459; E-mail: Lxyun@hebau.edu.cn