持續(xù)性根尖周炎根管外菌群分析

秦彥濤　馬琰　吳佩玲

[摘 要] 目的：分析持續(xù)性根尖周炎（Persistent periapical periodontitis，PRP）根管外菌群特點(diǎn)，明確根管外菌群在PRP發(fā)生、發(fā)展中扮演的角色。方法：我院擬行根尖手術(shù)的PRP患者中選取13例13顆患牙及10例10顆正畸拔除牙，使用Brown&Brenn染色進(jìn)行觀察及細(xì)菌培養(yǎng)。結(jié)果：正畸拔除牙染色結(jié)果均未見明顯異常。PRP患牙Brown&Brenn染色可見相互交織、聚集的革蘭陰性菌及革蘭陽性菌。13顆患牙共檢出根管外菌群86個，檢出菌種以兼性厭氧菌、專性厭氧菌、需氧菌為主，其中丙酸菌屬檢出率最高，構(gòu)成比為16.3%，其次為放線菌屬，構(gòu)成比為12.8%。結(jié)論：PRP存在根管外感染，其感染菌群以丙酸均屬、放線菌屬為主，在PRP發(fā)生發(fā)展過程中占據(jù)了重要地位。

[關(guān)鍵詞] 持續(xù)性根尖周炎；根管外菌群；細(xì)菌培養(yǎng)

中圖分類號：R781.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：2095-5200（2016）03-043-03

DOI：10.11876/mimt201603016

持續(xù)性根尖周炎（Persistent periapical periodontitis，PRP）是指原發(fā)性根尖周炎經(jīng)完善的根管治療后，根尖周病變未愈或出現(xiàn)新的根尖周病變[1]。根管外感染是導(dǎo)致PRP綿延不愈的主要原因，且根管預(yù)備、根管消毒及根管充填等前期治療過程往往導(dǎo)致根管外致病微生物群落發(fā)生變化以及局部微生態(tài)環(huán)境復(fù)雜度加劇[2]。因此，明確PRP根管外菌群構(gòu)成特點(diǎn)，是了解其作用機(jī)制、解釋治療失敗原因、指導(dǎo)根管感染預(yù)防和治療的關(guān)鍵[3]，目前國內(nèi)關(guān)于這一方向文獻(xiàn)較為缺乏。我們以13顆擬行根尖手術(shù)的PRP患牙及10顆正畸拔除牙為樣本進(jìn)行了前瞻性對照分析，具體如下。

1 一般資料

本研究患者均知情同意并簽署知情同意書。PRP患牙選取標(biāo)準(zhǔn)：1）參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)確診PRP，擬行外科手術(shù)或拔除治療[4]；2）根管治療次數(shù)≥2次，距離上次慢性根尖周炎治療時間≥2年；3）X線片可見根充止點(diǎn)距離根尖距離在0～2 mm內(nèi)，根管充填致密但根尖病損未見治愈，且根尖伴有直徑<1 cm的根尖暗影。排除合并根折、根管側(cè)穿或內(nèi)吸收、牙周病損與根尖病變連通以及入組前3個月內(nèi)有抗菌藥物使用史患者。

2 研究方法

2.1 樣本采集

正畸拔除牙樣本采集：將患牙拔除后立即置入含有0.9%滅菌生理鹽水的采樣瓶中，并迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗室超凈工作臺，以0.9%滅菌生理鹽水充分沖洗表面血污。術(shù)中操作嚴(yán)格遵循無菌原則。

PRP患牙樣本采集：術(shù)前囑患者使用0.12%氯己定漱口3 min，而后以2%利多卡因（含1：50000腎上腺素）局麻，使用1%碘酊行術(shù)區(qū)消毒。按照術(shù)前X線片示病變范圍，術(shù)中作弧形切口，將全厚瓣切開，使用滅菌低速手機(jī)及球鉆將根尖區(qū)頰側(cè)骨質(zhì)切除，使根尖病損區(qū)域暴露，而后使用無菌挖匙將根尖周圍肉芽組織完全挖除，暴露根尖。使用滅菌高速手機(jī)及金剛砂車針，沿牙長軸垂直方向截取根尖樣本，截取長度約為3 mm[5]。手術(shù)全程使用無菌生理鹽水降溫，取樣過程中嚴(yán)格避免唾液污染，并盡可能減少根尖組織與空氣的接觸[6]。分離樣本后的放置、轉(zhuǎn)移處理同正畸拔除牙樣本采集。

2.2 樣本觀察

細(xì)菌Brown&Brenn染色：將獲取的全部樣本使用2%戊二醛于4℃環(huán)境下固定48 h，使用無菌輪型金剛砂車針于超凈工作臺中截取樣本。截取完畢后，使用去離子水洗滌3次，注意洗滌操作需輕柔、緩慢，而后加適量去離子水，于-80℃冰箱中冷凍過夜，取出后置入冷凍干燥機(jī)中，48 h后以滅菌10% EDTA脫鈣液持續(xù)脫鈣35～40 d，每隔2～3 d更換一次脫鈣液。脫鈣完畢后，行脫水、石蠟包埋處理，自根尖向牙冠方向制備橫斷面連續(xù)組織切片，厚度為5 μm。使用細(xì)菌Brown&Brenn染色處理切片，置于光學(xué)顯微鏡下拍照、觀察[7]。

細(xì)菌培養(yǎng)：將樣本置于轉(zhuǎn)運(yùn)液中，加入滅菌玻璃珠（直徑3 mm），漩渦振蕩5 min，分離根管外微生物，以12000 r/min離心5 min，取沉淀物，使用細(xì)菌DNA提取試劑盒，利用16S rDNA克隆測序法對菌群特點(diǎn)進(jìn)行分析[8]。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌染色結(jié)果

染色結(jié)果顯示PRP患牙根尖區(qū)外表面可見明顯染色陽性的根管外生物膜包繞，并存在紅染革蘭陰性菌、紫染革蘭陽性菌相互交織或積聚成團(tuán)，周圍包繞大量基質(zhì)樣物質(zhì)，形態(tài)包括球菌、桿菌、放線菌及螺旋菌等，根管外生物膜厚度17～31 μm；部分PRP患牙根面可見牙骨質(zhì)吸收區(qū)，且吸收陷窩中積聚大量細(xì)菌，細(xì)菌侵入牙本質(zhì)但未累及牙髓腔。正畸拔除牙樣本染色僅見牙本質(zhì)及牙骨質(zhì)，顯黃染，未見紅染或紫染區(qū)域。

3.2 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

13顆患牙共檢出根管外菌群86個，檢出菌種以兼性厭氧菌、專性厭氧菌、需氧菌為主，其中丙酸菌屬（丙酸桿菌屬、丙酸丙酸鹽桿菌）檢出率最高，構(gòu)成比為16.3%，其次為放線菌屬，構(gòu)成比為12.8%，見表1。

4 討論

臨床上約有10%～20%的根尖周炎患者在接受規(guī)范的根管治療方案后，影像學(xué)仍可見持續(xù)性或進(jìn)行性擴(kuò)大的根尖周暗影，并伴有咬合痛等各類主觀不適癥狀，經(jīng)反復(fù)治療仍無法得到有效緩解[9]。根管系統(tǒng)內(nèi)和根尖孔外存在的微生物定植及感染是導(dǎo)致根管治療效果受限的主要原因[10]，定植于根管內(nèi)的細(xì)菌可自根尖孔侵入根管外，并于牙骨質(zhì)上形成生物膜結(jié)構(gòu)，影響常規(guī)機(jī)械和藥物性牙髓治療效果。

有研究應(yīng)用掃描電鏡[11]對PRP患牙進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，PRP患牙掃描電鏡可見明顯病變狀態(tài)及大量細(xì)菌定植。掃描電鏡可獲取準(zhǔn)確、清晰的形態(tài)學(xué)信息，能夠有效顯示生物膜表面結(jié)構(gòu)，但對生物膜內(nèi)細(xì)菌形態(tài)和分布的觀察作用十分有限，這主要與細(xì)菌在成熟生物膜結(jié)構(gòu)中常被大量基質(zhì)樣成分包繞有關(guān)[12]。因此，需采用其他方案進(jìn)一步判斷生物膜是否存在、明確生物膜結(jié)構(gòu)狀態(tài)[13]。本研究以細(xì)菌Brown&Brenn染色、DNA測序方法進(jìn)行對照研究。

細(xì)菌Brown&Brenn染色結(jié)果表明，正畸拔除牙樣本未見膠原纖維吸收、牙骨質(zhì)破壞等病損狀態(tài)，且未見紅染或紫染區(qū)域，與Wang等[14]研究結(jié)果相同，表明正畸拔除牙根管外無生物膜形成，亦不存在細(xì)菌感染。PRP患牙根管外可見大量革蘭陽性菌、革蘭陰性菌定植，并在生物膜的包繞下附著于根尖區(qū)外表面，且伴隨著根尖骨質(zhì)吸收、膠原纖維破壞甚至牙骨質(zhì)的暴露與吸收。Murad等[15]指出，生物膜的特殊結(jié)構(gòu)可將細(xì)菌包裹于胞外基質(zhì)中，將細(xì)菌與機(jī)體免疫防御因子及液體沖刷隔離開來，對細(xì)菌的繁殖、生長起到保護(hù)作用，且根管外生物膜常處于隱蔽位置，常規(guī)根管治療往往無法涉及這些部位，導(dǎo)致治療效果受限。此外，Tennert等[16]發(fā)現(xiàn)，處于胞外基質(zhì)的細(xì)菌可結(jié)合抗菌因子，在阻止抗菌因子向胞內(nèi)擴(kuò)散的同時增強(qiáng)生物膜的耐藥性，進(jìn)一步影響抗菌藥物發(fā)揮作用。上述機(jī)制可能是導(dǎo)致PRP綿延難愈的主要原因，Segura-Egea等[17]亦發(fā)現(xiàn)，病程越長、生物膜中細(xì)菌數(shù)量越高、細(xì)菌毒性越強(qiáng)及分布范圍越大的PRP患者，治療越困難且預(yù)后更差。我們通過擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列發(fā)現(xiàn)，PRP根管外菌群以放線菌屬和丙酸菌屬為主，與Van der Waal[18]等研究結(jié)論相仿。

本研究在解釋PRP發(fā)生機(jī)制的同時，也為PRP治療失敗的原因提出了參考，即根管外菌群的大量定植及生物膜的良好保護(hù)作用，由于條件所限，我們未能進(jìn)一步明確PRP根管外定植的具體菌群?？傮w而言，根管外菌群在PRP的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色，在今后的臨床治療中，可以將清除根管外菌群作為努力方向。

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