蛇床子三螺旋轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與表達分析

王希強, 尹登科, 儲　俊， 吳家文

(1． 安徽中醫(yī)藥大學 科研實驗中心 新安醫(yī)學教育部重點實驗室, 合肥 230038；2. 安徽中醫(yī)藥大學 藥學院, 合肥 230038)

蛇床子三螺旋轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與表達分析

王希強1, 2, 尹登科2, 儲俊1， 吳家文1

(1． 安徽中醫(yī)藥大學 科研實驗中心 新安醫(yī)學教育部重點實驗室, 合肥 230038；2. 安徽中醫(yī)藥大學 藥學院, 合肥 230038)

摘要研究的目的是克隆中藥蛇床子[Cnidium monnieri (L.) Cuss.]三螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Trihelix transcription factor，ttf)基因，誘導、鑒定其蛋白體外表達，并利用生物信息學方法分析該蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。主要采用RT-PCR方法擴增目的基因，連接到pMDTM19(Simple)-T克隆載體中，核酸序列鑒定正確后再將目的基因克隆到pET-22b(+)表達載體上，將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli BL21細胞中，以不同濃度的誘導劑誘導其表達，進一步利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡方法檢測目的蛋白的表達情況，并利用各種生物學軟件對目的蛋白進行生物信息學分析。結(jié)果獲得了ttf，構(gòu)建了該基因的克隆和表達重組質(zhì)粒，該基因在大腸桿菌BL21中能夠被誘導表達，Western Blot結(jié)果表明，在預計的分子質(zhì)量21 ku位置得到了目的蛋白；生物信息學分析表明，目的蛋白為可溶性蛋白，可能定位于細胞核和線粒體中；部分區(qū)域極有可能形成卷曲螺旋。研究首次成功體外克隆并在原核生物中表達了蛇床子三螺旋轉(zhuǎn)錄因子，并對其進行了系統(tǒng)的生物信息學分析，為進一步研究其結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞蛇床子；三螺旋轉(zhuǎn)錄因子；基因克??；蛋白質(zhì)表達；生物信息學

轉(zhuǎn)錄因子是一類能與基因啟動子區(qū)域中的順式作用原件發(fā)生特異性結(jié)合的核蛋白，通常也稱為反式作用原件，一般由寡聚化位點、核定位信號域、DNA結(jié)合域及基因調(diào)控域等功能區(qū)域組成[1,2]，其中DNA結(jié)合域特異性結(jié)合基因中的順式作用原件，從而精確調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯；基因調(diào)控域激活或者抑制基因表達；富含精氨酸和賴氨酸的核定位信號域主要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子出入核的過程[3]；寡聚化位點通常與DNA結(jié)合域協(xié)同作用。這些區(qū)域通過與特異DNA序列或蛋白分子伴侶結(jié)合調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程從而表現(xiàn)出特定的生物學功能。植物中已經(jīng)被鑒定出超過60種的轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)其DNA結(jié)合域的不同將轉(zhuǎn)錄因子主要分為B3家族、AP2/EREBP家族、bZIP家族、MYB家族以及三螺旋家族[4-8]。

三螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族基因由于其DNA結(jié)合域含有3個串聯(lián)的螺旋結(jié)構(gòu)域而得名，其保守蛋白結(jié)構(gòu)域就是由3個螺旋狀的蛋白結(jié)構(gòu)域兩兩形成環(huán)狀或折角的超二級結(jié)構(gòu)，功能主要表現(xiàn)在光應答、對生物脅迫和非生物脅迫具有應答反應以及對植物特定組織的發(fā)育進行調(diào)控等[5-7]。

三螺旋轉(zhuǎn)錄因子能與基因序列上的光應答元件GT發(fā)生特異性結(jié)合，故該基因家族也被稱為GT家族。三螺旋轉(zhuǎn)錄因子的亞家族分為：GT-1、GT-2、GT-3a、GT-3b、GT-4、GT-γ、ASIL1、ASIL2、SH4及SIP1等，這些亞家族至少含有一個三螺旋結(jié)構(gòu)域[6， 7]。其中GT-1和GT-2在擬南芥和水稻等模式植物中已經(jīng)被體外克隆[3]。

本實驗室采用Illumina HiSeq 2 500高通量測序獲得了沒有參考基因的中藥蛇床子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。我們提取了蛇床子葉的總RNA，采用RT-PCR方法以特定引物擴增目的基因ttf，并將此基因定向克隆到pMDTM19(Simple)-T載體，并進一步克隆到表達載體pET-22b (+)，利用IPTG(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside)進行誘導表達，摸索其最佳表達條件，為該基因大量表達和純化以得到高濃度的目的蛋白從而進一步研究其結(jié)構(gòu)和功能提供了很好的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1植物材料和試劑

野生蛇床子[Cnidiummonnieri(L.)Cuss.]植株采自安徽省桐城市，由安徽中醫(yī)藥大學王德群教授鑒定，根、莖、葉、花等新鮮樣品由滅菌的雙蒸水清洗后液氮快速冷凍，然后立即置于-80℃冰箱備用?？俁NA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒均購自合肥欣樂生物科技公司，高保真KOD-Plus DNA聚合酶購自日本TOYOBO公司，DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NdeⅠ均購自TaKaRa公司，His-tag抗體中的鼠抗(AM1010a)購自ABGENT公司，二抗(W402B)購自Promega公司，設(shè)計的引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.1.2實驗菌株和載體質(zhì)粒

分子克隆用的大腸桿菌E.coli菌株DH5α、表達菌株BL21、載體質(zhì)粒pET-22b (+)均由中國科學技術(shù)大學生命科學學院施蘊渝院士實驗室惠贈；實驗所用的pMDTM19(Simple)-T載體質(zhì)粒購自TaKaRa生物公司。

1.1.3實驗儀器

實驗用的主要儀器有凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)，DNA擴增儀(德國耶拿分析儀器股份公司)，核酸電泳儀(Amersham公司)，蛋白電泳儀，恒溫恒速搖床，超凈操作臺，恒溫水浴鍋，超精度電子天平，紫外-可見分光光度計均為國產(chǎn)產(chǎn)品。

1.2實驗方法

1.2.1蛇床子總RNA的提取及cDNA合成

采用OMEGA公司的Plant RNA Kit提取蛇床子的總RNA，分別在260 nm和280 nm處測其紫外吸收值并計算D260 nm/D280 nm，根據(jù)測定的結(jié)果將總RNA濃度調(diào)至200 ng/μL，再使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，凝膠電泳鑒定總RNA提取和cDNA合成的結(jié)果。

1.2.2蛇床子ttf引物的設(shè)計

基于目的基因蛇床子ttf的cDNA序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計一對特異性擴增引物：ttf-S：5′ CGAATCATATGATGAAGCAACAGTTTCCATATTAC 3′(35 bp)，ttf-A：5′ CGACTCGAGATTAGATTTATCTTCCCTTCTAAGC 3′(34 bp)，在上下游引物中分別插入了NdeⅠ和XhoⅠ的酶切位點，分別為5′ CATATG 3′和5′ CTCGAG 3′。

1.2.3蛇床子ttf的克隆

以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進行RT-PCR。50 μL PCR擴增體系中含10 μL的5×easypfubuffer緩沖液、1 μL 10 mmol/L dNTP mix、3 μL 4μmol/μL上下游引物、3 μL cDNA、0.4 μL easypfu高保真DNA聚合酶、29.5 μL ddH2O。PCR 擴增程序為94℃預變性3 min；94℃變性30 s，40℃退火30 s，72℃延伸75 s，共10個循環(huán)；隨后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸75 s，共25個循環(huán)。膠回收RT-PCR產(chǎn)物，并再次以回收RT-PCR產(chǎn)物為模板，用Taq酶代替pfu高保真DNA聚合酶進行PCR，體系不變。

1.2.4蛇床子ttf克隆重組質(zhì)粒構(gòu)建

用DNA凝膠回收試劑盒純化回收Taq酶PCR后的目的基因條帶，然后與克隆載體pMDTM19(Simple)-T 連接，采用pMDTM19(Simple)-T載體1 μL，回收的ttf7 μL，T4DNA連接酶1 μL，10×T4DNA連接酶緩沖液1 μL進行重組，16℃連接4 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，次日挑單克隆菌落進行擴大培養(yǎng)。首先利用目的基因ttf的上下游引物對菌落進行PCR初步鑒定，然后純化質(zhì)粒再次進行PCR 鑒定和NdeI /XhoI雙酶切鑒定，挑選鑒定正確的陽性重組子送至華大基因測序。

1.2.5蛇床子ttf原核表達重組質(zhì)粒構(gòu)建

將測序正確的重組pMD19-T-ttf質(zhì)粒和表達載體pET-22b(+)分別用NdeI 和XhoI雙酶切，膠回收ttf條帶與線性化的pET-22b(+)載體，T4DNA連接酶于16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)后進行菌落PCR初篩，質(zhì)粒PCR鑒定和NdeI/XhoI雙酶切進一步鑒定，再次將陽性重組子pET22b-ttf送樣測序。

1.2.6重組質(zhì)粒pET22b-ttf在大腸桿菌內(nèi)誘導表達

將重組質(zhì)粒pET22b-ttf轉(zhuǎn)化進感受態(tài)細胞BL21中，次日挑單克隆到10 mL LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，以250 r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)至D600 nm值為0.6～0.8時，加IPTG誘導表達蛋白(IPTG濃度分別為0、0.1、0.5和1 mmol/L)，在25℃或37℃、150 r/min條件下誘導其表達6 h。停止誘導表達后，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心5 min收集菌體，因為目的蛋白的等電點(pI)為7.85，所以選擇pH 6.5的PBS緩沖液(含500 mmol/L NaCl)2 mL重懸菌體，超聲破碎菌體(頻率750 Hz，超聲1 s，停3 s，超聲60次), 13 000 r/min高速離心后將上清和沉淀分離。進一步利用SDS-PAGE蛋白電泳分析和Western Blot方法檢測蛋白在上清或沉淀中表達情況。

1.2.7TTF蛋白Western Blot檢測

重組質(zhì)粒PET22b-ttf表達的目的蛋白C末端有His-tag(6個組氨酸標簽)，利用His-tag特異性抗體對樣品進行Western Blot檢測。將誘導表達的菌體破碎后離心，得到上清蛋白和沉淀蛋白分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，200 mA恒定電流轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜2 h，全脫脂奶粉(5 g/10 mL PBST)封閉3h，PBST洗3次(10 min/T)，4℃一抗孵育過夜，次日PBST洗3次(10 min/T)，室溫避光二抗孵育2 h，PBST洗3次(10 min/T)，暗室曝光。

1.2.8TTF蛋白生物信息學分析

通過序列翻譯軟件將蛇床子中的ttf開放閱讀框翻譯成氨基酸序列進行比對；通過Protparam在線分析軟件分析目的基因翻譯出的蛋白中氨基酸的帶電性、各氨基酸所含百分數(shù)，以及蛋白的親水-疏水性；通過InterProScan軟件分析ttf編碼的目的蛋白含有的各種基序及其結(jié)構(gòu)域；通過ExPASy在線軟件Coils預測目的蛋白卷曲螺旋結(jié)構(gòu)；通過SmartBlast在線軟件進行目的蛋白氨基酸序列比對和進化分析、二級結(jié)構(gòu)的預測和溶劑可接近性的分析。

2結(jié)果與分析

2.1蛇床子ttf克隆和鑒定

2.1.1蛇床子總RNA的提取及鑒定

利用植物RNA提取試劑盒提取蛇床子總RNA，然后立即做瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如圖1顯示，兩個提取的總RNA樣品中RNA的28s和18s和5s 3個亞基的條帶均清晰可見，樣品的紫外吸光度值D260 nm和D280 nm的比值為1.83，說明RNA提取純度較高且基本沒有降解。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.1.2蛇床子ttf的克隆

用提取的mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再對其進行RT-PCR，為了使克隆的目的基因末端帶上A堿基，以便更好地和T-vector連接，再次以純化的RT-PCR的基因產(chǎn)物為模板用Taq酶進行了PCR，2次均得到了比較清晰的目的條帶(約540 bp處，如圖2 所示)。

圖2 ttf的克隆

A：RT-PCR結(jié)果圖；B：Taq酶再次PCR結(jié)果圖。箭頭所指的是目的基因位置

2.1.3重組質(zhì)粒pMD19-ttf的構(gòu)建

純化Taq酶PCR產(chǎn)物中的目的基因條帶，然后與pMDTM19(Simple)-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，單克隆擴大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3A所示，質(zhì)粒條帶位置正確。以重組質(zhì)粒為模板進行PCR鑒定，得到的目的條帶在750 ku和500 ku之間，符合目的條帶540 bp大小(圖3B)。再用NdeI /XhoI兩種酶將質(zhì)粒樣品進行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖3C所示，目的基因條帶以箭頭示意，位置正確，而250 bp位置也有條帶是因為pMDTM19(Simple)-T載體中有NdeI酶切位點。送pMD19-ttf重組質(zhì)粒到華大基因測序，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序得到的cDNA序列完全一致。

2.1.4重組質(zhì)粒pET22b-ttf的構(gòu)建

用NdeI /XhoI雙酶切重組的質(zhì)粒pMD19-ttf，純化目的基因條帶，然后與用同樣雙酶切的表達載體pET22b(+)連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，單克隆擴大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4A所示質(zhì)粒條帶位置正確。同樣進行PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果如圖4B和4C所示，目的條帶位置正確。再次將陽性重組子pET22b-ttf送樣測序，測序結(jié)果證明重組質(zhì)粒正確無誤。

圖3 重組質(zhì)粒pMD19-ttf的純化和鑒定

A：重組質(zhì)粒電泳結(jié)果圖；B：目的基因PCR鑒定圖；C：重組質(zhì)粒酶切結(jié)果圖。箭頭所指的是目的基因位置

圖4 重組質(zhì)粒pET22b -ttf的純化和鑒定

A：重組質(zhì)粒電泳結(jié)果圖；B：目的基因PCR鑒定結(jié)果圖；C：重組質(zhì)粒酶切結(jié)果圖。箭頭所指的是目的基因位置

2.2重組質(zhì)粒pET22b-ttf的誘導表達

將測序正確的重組質(zhì)粒pET22b-ttf轉(zhuǎn)化到表達菌體BL21中，以不同的IPTG濃度分別在37℃和25℃進行誘導表達，然后進行SDS-PAGE電泳及Western Blot鑒定。目的蛋白條帶在大約21ku的位置，與TTF蛋白理論分子量相符，說明重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中成功表達(圖5)，且從圖中可以明顯看出，當IPTG的濃度為0.1 mmol/L時，無論在25℃還是37℃目的蛋白的表達量均多于其它條件；37℃誘導表達的蛋白量比25℃多；蛋白在沉淀中表達明顯多于上清。

2.3生物信息學分析結(jié)果

2.3.1ttf序列分析

重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明插入序列與ttf的ORF完全一致，cDNA經(jīng)序列翻譯工具(http://www.bio-soft.net/sms/index.html)翻譯出蛋白質(zhì)序列，兩者比對結(jié)果如圖6所示， cDNA序列含540 bp， 其編碼的蛋白質(zhì)含179個氨基酸。

2.3.2ttf編碼蛋白理化特性分析

Protparam (http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)序列分析表明ttf編碼的蛋白中谷氨酸 (E) 有29個、含量最高，占16.2%；蛋白理論分子質(zhì)量為21 254.7 u，等電點為7.85，含有36個負電荷氨基酸(Asp + Glu)，37個正電荷氨基酸(Arg + Lys)，這與它的等電點偏堿性是一致的。 此蛋白在280 nm處的摩爾消光系數(shù)為27 960 M-1cm-1，0.1%濃度(1 g/L)的Abs為1.315。蛋白質(zhì)在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為57.87，高于閾值40，屬于不穩(wěn)定蛋白。脂肪指數(shù)為39.89，總平均親水性(GRAVY)為-1.498，蛋白質(zhì)總體親水性較高。

圖5 不同溫度和不同濃度IPTG對TTF蛋白表達的影響

A：25℃蛋白表達的結(jié)果；B：37℃蛋白表達的結(jié)果。其中1和5分別為空白對照的上清和沉淀中目的蛋白；2和6分別為0.1 mmol/L IPTG誘導表達的上清和沉淀中目的蛋白；3和7分別為0.5 mmol/L IPTG誘導表達的上清和沉淀中目的蛋白；4和8分別為1 mmol/L IPTG誘導表達的上清和沉淀中目的蛋白

圖6 ttf cDNA序列和氨基酸序列

2.3.3TTF蛋白基元、結(jié)構(gòu)域和定位分析

Motif Scan(http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan/)分析顯示ttf編碼蛋白含有各種motif(基元)，包括一個酰胺化位點、1個N- 糖基化位點、2個cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點，3個酪蛋白激酶II磷酸化位點，5個蛋白激酶C磷酸化位點、3個N-蛋白質(zhì)豆蔻?；稽c；一個富含精氨酸區(qū)域, 一個富含谷氨酸區(qū)域，一個雙側(cè)核定位信號(NLS)序列，一個Ras結(jié)合區(qū)域，一個死亡結(jié)構(gòu)域 (表1)[9]。

PSORT (http://psort.hgc.jp/form.html) 預測TTF定位于核中的可能性為93.3%，定位于線粒體基質(zhì)空間的可能性為100%，與其轉(zhuǎn)錄因子的功能相一致[10]。

2.3.4TTF蛋白親水-疏水性分析

根據(jù)ProtScale Sever在線分析軟件，利用Hphob/Kyte&Doolittle的方法，對TTF蛋白的親水-疏水性進行分析。正值越大，疏水性越強；負值越小，親水性越強，如圖7所示最大正值為1.178，最小負值為-3.656，絕大多數(shù)氨基酸顯示親水性負值，提示該蛋白為親水性很強的蛋白。

表1 TTF蛋白基元及結(jié)構(gòu)域分析

圖7 TTF蛋白親水-疏水性分析

Fig 7 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of TTF

2.3.5TTF蛋白卷曲螺旋結(jié)構(gòu)預測與分析

利用http://www.expasy.org/tools/中的Coils分析工具，對TTF蛋白序列進行卷曲螺旋的傾向性預測，按照幾率大于50%就可能形成螺旋的規(guī)則，以window=14為試驗參數(shù)，Y111-R142，R144-A163很可能是卷曲螺旋，以window=21為試驗參數(shù)，E116-A167很可能是卷曲螺旋，而以window=28為試驗參數(shù), M108-E175很可能是卷曲螺旋；三種試驗參數(shù)幾率都大于50%的區(qū)域 E116-R142(24AA)，R144-A163(20AA)，這兩段區(qū)域形成卷曲螺旋的可能性極大 (圖8)。這與SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)網(wǎng)站預測的115～167(53AA)為Coiled-coil區(qū)域結(jié)果基本一致。

圖8 TTF蛋白卷曲螺旋結(jié)構(gòu)分析

2.3.6TTF同源蛋白序列比對和進化分析

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的SmartBlast對ttf編碼蛋白進行序列比對[11]，根據(jù)最好的3個比對的結(jié)果以及兩個目前研究最清楚的兩個物種得到5個同源性較高的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在NCBI中的登記號，根據(jù)功能的歸類，來源的物種以及與ttf比對的分析見表2。這些同源蛋白的氨基酸序列比對結(jié)果見圖9。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi)，ttf與芝麻的三螺旋轉(zhuǎn)錄因子聚在一起，表明其與芝麻的親緣關(guān)系最近(圖 10)。

表2 TTF同源蛋白比對結(jié)果分析

2.3.7TTF二級結(jié)構(gòu)預測和溶劑可接近性分析

利用ExPASy中的Predict Protein(http://www.predictprotein.org/)對TTF蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果表明1、138為蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域；21、32～38、62～68、67、80、82～84為DNA結(jié)合區(qū)域；8～28、52～56、63～72、85～176為螺旋區(qū)。蛋白溶劑可接近性分析表明82.68%的氨基酸暴露在溶劑中，13.41%的氨基酸被埋藏在內(nèi)部，可以推測目的蛋白是可溶性的[12-17](圖11)。

圖9 TTF同源蛋白的氨基酸序列比對

圖10 ttf的進化樹分析

圖11 TTF蛋白二級結(jié)構(gòu)和溶劑可接近性分析

3結(jié)論與展望

植物的抗逆性是多基因控制的，寒冷、旱澇、高鹽等脅迫因素是影響植物生長發(fā)育以及形態(tài)的重要因素。三螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族基因的功能主要是對生物脅迫和非生物脅迫具有應答反應，也對植物特定組織的發(fā)育進行調(diào)控等。本研究首次成功地將蛇床子三螺旋轉(zhuǎn)錄因子基因克隆到原核表達載體pET-22b (+)上，然后將重組質(zhì)粒pET-22b-ttf轉(zhuǎn)化到E.coliBL21細胞中，利用IPTG進行誘導，目的基因得到了成功表達。Western Blot結(jié)果表明，0.1 mmol/L IPTG誘導表達蛋白效果最好，37℃條件下表達量較多。利用Protparam軟件分析了蛇床子ttf表達的蛋白質(zhì)的氨基酸組成、分子量、等電點、穩(wěn)定性等特性，TTF蛋白含有179個氨基酸殘基、理論分子質(zhì)量為21 254.7u，等電點為7.85；TTF蛋白為可溶性蛋白，但在溶液中不穩(wěn)定。利用Motif Scan分析了該蛋白質(zhì)的各種基元，包括各種活性位點和結(jié)構(gòu)域；PSORT預測了該蛋白質(zhì)主要定位于細胞核和線粒體中；Predict Protein二級結(jié)構(gòu)預測該蛋白質(zhì)中規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)主要是卷曲螺旋，Coils軟件預測E116-R142、 R144-A163兩段區(qū)域形成卷曲螺旋的可能性極大；根據(jù)NCBI的比對結(jié)果進行進化分析表明ttf與芝麻的親緣關(guān)系最近。生物信息學分析表明，TTF應該屬于GT-3類，其中GT-3a特異性地結(jié)合DNA核心序列5′-GTTAC-3′，親緣關(guān)系很近的GT-3a和GT-3b能形成同源或異源二聚體，且主要在植物的花蕾和根中表達。本研究為進一步研究蛇床子TTF蛋白的結(jié)構(gòu)、生物學功能以及蛇床子中草藥的抗逆性奠定了理論和實驗基礎(chǔ)。

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Cloning and expression analysis of trihelix transcription factor gene in Cnidium monnieri

WANG Xi-qiang1， 2, YIN Deng-ke2, CHU Jun1, WU Jia-wen1

(1. Key Laboratory of Xin′an Medicine, Ministry of Education;2. School of Pharmacy, Anhui University of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230038, China)

AbstractThe aim of this study is to clone the Trihelix transcription factor (ttf) gene in a Chinese medicinal plant Cnidium monnieri(L.) Cuss. and express it in E.coli cells, followed by bioinformatic analysis. The ttf cDNA was amplified by RT-PCR from Cnidium monnieri(L.)Cuss, and plasmid pMD19-T-ttf was constructed by TA cloning. The cDNA fragment was subcloned to pET-22b(+), and recombinant plasmid pET-22b-ttf was verified by restriction endonuclease analysis and DNA sequencing. The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21, and pET-22b-ttf fusion protein was expressed with induction of IPTG at different concentrations, and then illustrated by sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Western-Blot assay revealed that fusion protein could be identified by His-tag antibody. The fusion protein was about 21 ku as expected. The molecular characteristics such as physiochemical properties, conserved domain, and sub-cellular localization of the TTF protein were determined using a series of bioinformatic tools. ttf was cloned and recombinant plasmid pET-22b-ttf was constructed, and then the fusion protein was expressed successfully, which will lead to the further study of the structure and function of ttf.

Key wordsCnidium monnieri (L.) Cuss.； Trihelix transcription factor； gene clone； protein expression; bioinformatic analysis

收稿日期：2015-12-22；修回日期：2016-01-13

基金項目：安徽省自然科學基金項目(1608085MH177)；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目(gxyqZD2016139)；安徽省2015年度留學人員科技活動擇優(yōu)資助項目；安徽中醫(yī)藥大學自然科學研究基金項目(2015zr017, 2015zr018)；安徽中醫(yī)藥大學人才引進科研項目(2015RC002)

作者簡介：王希強，碩士，研究方向為中藥分子生物學，E-mail：xqwang547@163.com； 通信作者：吳家文，教授，博士，研究方向為中藥分子生物學，E-mail：wujiawen@ahtcm.edu.cn。

中圖分類號Q71;Q344+.13

文獻標識碼A

文章編號2095-1736(2016)03-0024-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.03.024