不同質(zhì)粒電轉(zhuǎn)三種乳酸菌的比較研究

王巧惠，　王光強(qiáng)，　宋　馨，　夏永軍，　曹利瑞，　艾連中

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院， 上海 200093

不同質(zhì)粒電轉(zhuǎn)三種乳酸菌的比較研究

王巧惠，王光強(qiáng)，宋馨，夏永軍，曹利瑞，艾連中*

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院， 上海 200093

摘要：為比較研究不同質(zhì)粒針對(duì)不同乳酸菌的電轉(zhuǎn)效率的差異，分別以乳酸乳球菌NZ9000、干酪乳桿菌LC2W和植物乳桿菌WCFS1三種乳酸菌為受體，以七種不同質(zhì)粒為載體，進(jìn)行電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明在乳酸乳球菌NZ9000中，轉(zhuǎn)化效率最高的是pIB184質(zhì)粒，達(dá)到了1.53×107 cfg/μgDNA，在干酪乳桿菌LC2W中，pSIP403質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到了6.42×105 cfg/μgDNA，在植物乳桿菌WCFS1的電轉(zhuǎn)化中，是 pNZ44質(zhì)粒達(dá)到8.68×105 cfg/μgDNA的最高轉(zhuǎn)化效率。其中質(zhì)粒pIB184和pNZ44在三種菌株中均有較高的電轉(zhuǎn)化效率，超過了103 cfg/μgDNA，另一方面T-pAMS100、pSIP403、pSIP409三個(gè)質(zhì)粒在干酪乳桿菌與植物乳桿菌中的電轉(zhuǎn)化效率明顯高于乳酸乳球菌。不同質(zhì)粒針對(duì)不同乳酸菌的轉(zhuǎn)化效率為乳酸菌的高效電轉(zhuǎn)和表達(dá)載體的選擇與構(gòu)建提供了可行依據(jù)。

關(guān)鍵詞：乳酸乳球菌； 干酪乳桿菌； 植物乳桿菌； 電轉(zhuǎn)化； 質(zhì)粒

乳酸菌在凈化腸道、改善機(jī)體營養(yǎng)和維護(hù)宿主健康方面起到重要的作用，被公認(rèn)為是安全的，是食品級(jí)(food-grade)微生物，是優(yōu)良的載體微生物，早在20世紀(jì)90年代，國內(nèi)外學(xué)者就開始致力于乳酸菌分子生物學(xué)及作用機(jī)制的研究[1-2]。通過對(duì)乳酸菌的生物學(xué)性質(zhì)和代謝途徑的分子機(jī)制的研究，將外源基因轉(zhuǎn)入乳酸菌中，在分子水平上改善其發(fā)酵特性，乳酸菌作為安全性良好的宿主菌，在這方面已顯示出很大發(fā)展?jié)摿3]。隨著對(duì)乳酸菌表達(dá)調(diào)控元件了解的逐步深入，相繼出現(xiàn)了一批適用于乳酸菌的克隆載體、表達(dá)載體和整合載體，乳酸菌食品級(jí)高效表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其應(yīng)用已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一[4-6]。

另一方面由于乳酸菌屬于革蘭氏陽性菌，細(xì)胞壁較厚并具有剛性，對(duì)DNA分子進(jìn)入細(xì)胞有明顯的阻礙作用，采用經(jīng)典的熱激方法不能使外源DNA有效導(dǎo)入受體細(xì)胞，因而多采用電轉(zhuǎn)化方法。而乳酸菌電轉(zhuǎn)化方法受很多因素的影響，例如細(xì)胞弱化劑、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、電擊條件、質(zhì)粒濃度、質(zhì)粒本身等等。目前已有的研究多是在細(xì)胞弱化劑、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、電擊條件等方面研究一種或者多種菌株的電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化，例如郭紅敏[7]等的對(duì)德氏乳桿菌保加利亞亞種的電轉(zhuǎn)化方法的研究，范璟[8]等對(duì)植物乳桿菌 G63 電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化，格日勒?qǐng)D[9]等對(duì)干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)方法的研究等，而并沒有對(duì)質(zhì)粒本身對(duì)乳酸菌電轉(zhuǎn)化效率的影響作出比較分析。

目前，乳酸菌在細(xì)菌分類學(xué)上劃分為23個(gè)屬[10]，其中乳桿菌屬和乳球菌屬在生物分子上應(yīng)用廣泛。因此本文以乳酸乳球菌NZ9000、干酪乳桿菌LC2W和植物乳桿菌WCFS1為乳酸菌代表，以七種不同質(zhì)粒為載體，在確定3種乳酸菌電轉(zhuǎn)化方法的基礎(chǔ)上研究不同質(zhì)粒電轉(zhuǎn)不同菌株電轉(zhuǎn)化效率的差異性，為乳酸菌電轉(zhuǎn)化載體的選擇與構(gòu)建，食品級(jí)基因工程菌的選擇以及為乳酸菌分子生物學(xué)研究和基因工程技術(shù)發(fā)展，提供可行依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用的菌株與質(zhì)粒如表1所示。

表1　菌株與質(zhì)粒

1.1.2培養(yǎng)基

GM17培養(yǎng)基：用于乳酸乳球菌的活化、培養(yǎng)和活菌計(jì)數(shù)；MRS培養(yǎng)基：用于乳桿菌的活化、培養(yǎng)和活菌計(jì)數(shù)； SGM17培養(yǎng)基：含0.5 mol/L蔗糖，2.5% 甘氨酸的GM17培養(yǎng)基，用于乳酸乳球菌的感受態(tài)細(xì)胞制備；含1% 甘氨酸的MRS培養(yǎng)基，用于干酪乳桿菌的感受態(tài)細(xì)胞制備；SMRS培養(yǎng)基：含0.3 mol/L的蔗糖，3%甘氨酸MRS培養(yǎng)基，用于植物乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)；GM17MC恢復(fù)培養(yǎng)基：含有 2 mmol/L CaCl2，20 mmol/L MgCl2的 GM17培養(yǎng)基，用于乳酸乳球菌感受態(tài)細(xì)胞電轉(zhuǎn)化后的復(fù)蘇培養(yǎng)；SMRSMC恢復(fù)培養(yǎng)基：含0.5 mol/L的蔗糖、2 mmol/L CaCl2、20 mmol/L MgCl2的MRS培養(yǎng)基，用于干酪乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞電轉(zhuǎn)化后的復(fù)蘇培養(yǎng)；SMRS培養(yǎng)基：含0.3 mol/L的蔗糖的MRS培養(yǎng)基，用于植物乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞電轉(zhuǎn)化后的復(fù)蘇培養(yǎng)。

1.1.3緩沖液

溶液Ⅰ：0.5 mol/L蔗糖，10%甘油，用于重懸和洗滌乳酸乳球菌；溶液Ⅱ：0.5 mol/L蔗糖，10%甘油，0.05 mol/L EDTA，用于重懸和洗滌乳酸乳球菌；細(xì)胞預(yù)處理液：100 mmol/L乙酸鋰二水，10 mmol/L DTT，0.6 mol/L蔗糖，1 mL 1 mol/L的Tris-HCl母液，調(diào)節(jié)pH至7.5。用于乳酸乳球菌感受態(tài)細(xì)胞的預(yù)處理；10%甘油：用于重懸和洗滌干酪乳桿菌的感受態(tài)細(xì)胞；PEB緩沖液：0.4 mol/L蔗糖，1 mmol/L MgCl2，5 mmol/L KH2PO4，調(diào)節(jié)pH至7.3～7.4，用于重懸和洗滌植物乳桿菌。以上緩沖液均用雙蒸水配制。

1.1.4試劑與儀器

質(zhì)粒提取采用上海生工生物SanPre柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒；電轉(zhuǎn)化儀MicroPulse、電泳儀Powerpac basic、電泳槽、凝膠成像儀GelDocXR，均購自Bio-Rad公司；冷凍離心機(jī)，購自SiGMA公司；厭氧培養(yǎng)箱購自RUSKINN公司。

1.2方法

1.2.1感受態(tài)細(xì)胞的制備

1) 劃線培養(yǎng)活化菌株，乳酸乳球菌NZ9000是用GM17平板，30 ℃培養(yǎng)，干酪乳桿菌LC2W和植物乳桿菌WCFS1是用MRS平板，37 ℃培養(yǎng)，后續(xù)培養(yǎng)均參照上述溫度，在厭氧培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待菌落生長(zhǎng)至直徑1～2 mm大小。

2) 挑取劃線培養(yǎng)出的正常菌落，接種于各自液體培養(yǎng)基中，按各自培養(yǎng)溫度靜置培養(yǎng)12 h。

3) 取上述活化好的菌液按一定比例接種于各自液體培養(yǎng)液中，乳酸乳球菌NZ9000和干酪乳桿菌LC2W是按5%的比例，植物乳桿菌WCFS1是以2%比例，靜置培養(yǎng)12 h。

4) 取上述培養(yǎng)液，乳酸乳球菌NZ9000以5%比例轉(zhuǎn)接于含2.5%甘氨酸的SGM17培養(yǎng)液中，30 ℃靜置培養(yǎng)至菌液OD600=0.3～0.4；干酪乳桿菌LC2W以相同比例將培養(yǎng)液接種于含1%甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)至菌液OD600=0.7～0.8；植物乳桿菌WCFS1是以2%比例接種于含3%甘氨酸的SMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)至菌液OD600=0.3～0.4。

5) 上述菌液冰浴20 min，離心，棄上清，其中乳酸乳球菌109細(xì)胞用8 mL細(xì)胞預(yù)處理液重懸，室溫靜置30 min，離心，棄上清。

6) 三種菌分別用各自預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液重懸洗滌三次，其中乳酸乳球菌NZ9000是先用溶液Ⅰ洗滌，再用溶液Ⅱ洗滌，最后再用溶液Ⅰ洗滌。

7) 用各自預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液充分重懸菌體，按每管80 μL分裝于1.5 mL離心管中，-70 ℃超低溫冰箱保存。此處乳酸乳球菌NZ9000是用溶液Ⅰ重懸菌體。

注：以上所有離心條件均為4 ℃，5 000 r/min，10 min。

1.2.2電轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算

1) 從超低溫冷凍箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍10 min。

2) 每管感受態(tài)細(xì)胞中加入質(zhì)粒，輕柔混勻，轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的電擊杯中，輕敲電擊杯，確?；旌衔镞M(jìn)入電擊杯底部。

3) 調(diào)節(jié)電轉(zhuǎn)化參數(shù)(乳酸乳球菌NZ9000和干酪乳桿菌LC2W是2.0 KV，植物乳桿菌WCFS1是2.0 KV，4.0 ms)，電擊電轉(zhuǎn)化杯。

4) 迅速向電轉(zhuǎn)化杯中加入1 ml預(yù)冷的恢復(fù)培養(yǎng)基，混勻后轉(zhuǎn)移1.5 mL離心管中，于厭氧培養(yǎng)箱中靜置復(fù)蘇培養(yǎng)(乳酸乳球菌NZ9000是30 ℃，2 h；干酪乳桿菌LC2W和植物乳桿菌WCFS1是37 ℃，3 h)。

5) 取適量菌液涂布抗性平板，于厭氧培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h ～48 h。

以上感受態(tài)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化效率計(jì)算：

電轉(zhuǎn)化效率(cfg/μgDNA)=稀釋倍數(shù)×菌落數(shù)/質(zhì)粒DNA數(shù)量

2結(jié)果與討論

2.1轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

分別隨機(jī)挑取三種菌株抗性平板上的單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)提質(zhì)粒，酶切后進(jìn)行核酸凝膠電泳鑒定。結(jié)果如圖1。

為驗(yàn)證電擊轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)化子，文章對(duì)所有質(zhì)粒轉(zhuǎn)化三種乳酸菌的轉(zhuǎn)化子都進(jìn)行了篩選鑒定。電泳結(jié)果顯示，三種菌株電轉(zhuǎn)后的轉(zhuǎn)化子條帶與各自的原始質(zhì)粒一致(圖1)，可見所有質(zhì)粒都成功轉(zhuǎn)入到了三種乳酸菌中。

2.2電轉(zhuǎn)化效率的分析

質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化3個(gè)乳酸菌的電轉(zhuǎn)化效率如圖2所示。

實(shí)驗(yàn)用7種質(zhì)粒電轉(zhuǎn)3種乳酸菌，由圖2可知，所有質(zhì)粒都成功轉(zhuǎn)入了三種菌株中，可見這三種菌株的電轉(zhuǎn)化方法都是成功的。在乳酸乳球菌NZ9000的電轉(zhuǎn)化中，轉(zhuǎn)化效率最高的分別是pIB184、pIAβ3，各自達(dá)到了1.53×107cfg/μgDNA和2.52×106cfg/μgDNA，轉(zhuǎn)化效率最低的是T-pAMS100、pSIP403、pSIP409，低于101數(shù)量級(jí)，最高轉(zhuǎn)化效率和最低轉(zhuǎn)化效率相差高達(dá)106倍。

在干酪乳桿菌LC2W的電轉(zhuǎn)化中，轉(zhuǎn)化效率均較高，pMG36e、pIAβ3達(dá)到103cfg/μgDNA，其余均超過或者位于105cfg/μgDNA附近。

在植物乳桿菌WCFS1的電轉(zhuǎn)化中，所有質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率均達(dá)到了103cfg/μgDNA，其中轉(zhuǎn)化效率最高的是pNZ44，達(dá)到8.68×105cfg/μgDNA，轉(zhuǎn)化效率最低的是pMG36e，達(dá)到1.28×103cfg/μgDNA。

對(duì)各個(gè)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)三種菌株的電轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行比較，質(zhì)粒pIB184是最優(yōu)的適用于這三種菌株的電轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，其次則是pNZ44。質(zhì)粒T-pAMS100、pSIP403、pSIP409三者均在乳酸乳球菌NZ9000的電轉(zhuǎn)化中，效率低下，而在干酪乳桿菌LC2W和植物乳桿菌WCFS1的電轉(zhuǎn)化中，效率均超過104cfg/μgDNA，由此可以推測(cè)三種質(zhì)粒更適合于乳桿菌的電轉(zhuǎn)化。另一方面pSIP403和pSIP409為同一系列質(zhì)粒，兩者在三種菌株的電轉(zhuǎn)化中，電轉(zhuǎn)化效率相近，且pSIP403質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化效率始終高于pSIP409質(zhì)粒。

A：乳酸乳球菌轉(zhuǎn)化子鑒定圖；B：干酪乳桿菌轉(zhuǎn)化子鑒定圖；C：植物乳桿菌轉(zhuǎn)化子鑒定圖；1.原始pMG36e質(zhì)粒EcoRⅠ酶切；2. 電轉(zhuǎn)后提取pMG36e質(zhì)粒EcoRⅠ酶切；3. 原始pNZ44質(zhì)粒SacⅠ酶切；4. 電轉(zhuǎn)后提取pNZ44質(zhì)粒SacⅠ酶切；5. 原始pIAβ3質(zhì)粒EcoRⅠ酶切；6. 電轉(zhuǎn)后提取pIAβ3質(zhì)粒EcoRⅠ酶切；7. 原始pIB184質(zhì)粒EcoRⅠ酶切；8. 電轉(zhuǎn)后提取pIB184質(zhì)粒EcoRⅠ酶切9. 原始T-pAMS100質(zhì)粒EcoRⅠ酶切；10. 電轉(zhuǎn)后提取T-pAMS100質(zhì)粒EcoRⅠ酶切；11原始pSIP403質(zhì)粒NcoⅠ酶切；12. 電轉(zhuǎn)后提取pSIP403質(zhì)粒NcoⅠ酶切；13. 原始pSIP409質(zhì)粒NcoⅠ酶切；14. 電轉(zhuǎn)后提取pSIP409質(zhì)粒NcoⅠ酶切；M.Marker。

圖1三種菌的轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

圖2　質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化效率

本文乳酸乳球菌的電轉(zhuǎn)化方法是在任大勇[11]等方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改，借鑒Maria Papagianni[12]等人的細(xì)胞預(yù)處理方法，最后得出的最高電轉(zhuǎn)化效率達(dá)到107cfg/μgDNA。而任大勇[11]等的乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)化方法最高電轉(zhuǎn)化效率僅為104cfg/μgDNA，兩者相差103cfg/μgDNA，由此可見Maria Papagianni[12]等人的細(xì)胞預(yù)處理方法對(duì)提高乳酸乳球菌的電轉(zhuǎn)化效率是可行的。文章采用的干酪乳桿菌的電轉(zhuǎn)化方法是在任婧[13]、Nan Li[14]等人的方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改，采用的植物乳桿菌的電轉(zhuǎn)化方法是借鑒參考了Pascale Serror[15]、Plearnpis Luxananil[16]、 Sheng Yin[17]等人的電轉(zhuǎn)方法，二者最高電轉(zhuǎn)效率均高達(dá)105cfg/μgDNA。

質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化效率受到很多因素的影響，菌體的生物生理狀況、培養(yǎng)基組分、電擊參數(shù)、質(zhì)粒大小、質(zhì)粒濃度等等，除此外宿主與質(zhì)粒本身的特異性在電轉(zhuǎn)化效率中也具有著重要作用。以相同質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化不同乳酸菌或以不同質(zhì)粒電轉(zhuǎn)相同乳酸菌，其能否實(shí)現(xiàn)成功轉(zhuǎn)化的結(jié)果不盡相同，不同種類的乳酸菌其轉(zhuǎn)化效率相差甚遠(yuǎn)，如圖2中每種質(zhì)粒電轉(zhuǎn)3種菌株得到的電轉(zhuǎn)化效率是不相同的，另一方面7種質(zhì)粒電轉(zhuǎn)同一菌株，轉(zhuǎn)化效率也相差甚遠(yuǎn)，這表明宿主與質(zhì)粒都存在著各自的特異性。另一方面這種不穩(wěn)定性也許是因?yàn)橥庠促|(zhì)粒與內(nèi)源質(zhì)粒的不相容，或者是宿主的不同限制修飾系統(tǒng)，再或者是質(zhì)粒本身來源、復(fù)制方式的不同。

文中所用的宿主菌為乳酸乳球菌NZ9000、干酪乳桿菌LC2W、植物乳桿菌WCFS1均為乳酸菌?？紤]到質(zhì)粒來源是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素。大量研究表明相同條件下，用不同來源的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率差別很大，選擇適宜的質(zhì)粒是轉(zhuǎn)化成功與否的關(guān)鍵因素，如質(zhì)粒來自近緣種，其轉(zhuǎn)化效率通常較高，而異源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率較低。文中所用的7種質(zhì)粒均來源于乳酸菌種，pMG36e質(zhì)粒為pWV01復(fù)制子，pIB184、pIAβ3、T-pAMS100質(zhì)粒是pAMβ1復(fù)制子，pNZ44質(zhì)粒是pNZ系列質(zhì)粒，pSIP403、pSIP409質(zhì)粒是pSIP系列質(zhì)粒。其中pNZ系列質(zhì)粒和pSIP系列質(zhì)粒是乳桿菌穿梭質(zhì)粒，如圖2中，pNZ44、pSIP403、pSIP409三個(gè)質(zhì)粒在乳酸乳球菌NZ9000中的電轉(zhuǎn)效率均明顯低于在干酪乳桿菌LC2W和植物乳桿菌WCFS1中的電轉(zhuǎn)化效率。其中pSIP403、pSIP409質(zhì)粒在乳酸乳球菌NZ9000中的電轉(zhuǎn)效率低于101數(shù)量級(jí)，對(duì)Elisabeth S[18]等人的文獻(xiàn)進(jìn)行了論證，證實(shí)了pSIP403和pSIP409質(zhì)粒為乳桿菌穿梭質(zhì)粒。另一方面7種質(zhì)粒中，pMG36e、pIB184、pNZ44是組成型表達(dá)載體，而pSIP403、pSIP409質(zhì)粒是誘導(dǎo)型表達(dá)載體。針對(duì)不同載體與不同宿主菌之間的電轉(zhuǎn)化效率的研究，為后期乳酸菌載體的選擇與構(gòu)建、宿主菌的選擇提供了參考依據(jù)。

3結(jié)論

乳酸菌載體本身對(duì)乳酸菌的電轉(zhuǎn)化效率有很大的影響，不同的載體針對(duì)不同的乳酸菌有著不同的電轉(zhuǎn)化效率。實(shí)驗(yàn)在成功確定了三種菌株的電轉(zhuǎn)化方法基礎(chǔ)上，以7個(gè)質(zhì)粒為載體，以乳酸乳球菌NZ9000、干酪乳桿菌LC2W和植物乳桿菌WCFS1為受體，進(jìn)行電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，成功確定了3個(gè)菌株各自的較佳載體以及通用型載體，為3種菌株的進(jìn)一步的生物學(xué)性質(zhì)與代謝途徑的研究打下基礎(chǔ)，為不同乳酸菌的載體的選擇與構(gòu)建，為進(jìn)一步選擇與構(gòu)建乳酸菌通用型表達(dá)系統(tǒng)提供了可行的依據(jù)。

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Comparative studies on electricity transformation of three kinds of lactic acid bacteria using different plasmids

WANG Qiao-hui, WANG Guang-qiang, SONG Xin, XIA Yong-jun, CAO Li-rui, AI Lian-zhong

School of Medical Instrument and Food Engnieering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China

AbstractIn order to compare the electricity transformation efficiencies of different lactic acid bacterias using different plasmids, the Lactococcus lactis NZ9000, Lactobacillus casei LC2W and lactobacillus plantarum WCFS1 were chosen as the hosts, and seven kinds of plasmids as the vectors, to compare the difference in electricity transformation efficiency of different plasmids and different bacterial strains. The results showed that the pIB184 plasmid reached the maximum electricity transformation efficiency of 1.53×107 cfg/μgDNA in Lactococcus lactis NZ9000. The pSIP403 plasmid reached the maximum electricity transformation efficiency of 6.42×105 cfg/μgDNA in Lactobacillus casei LC2W. The pNZ44 plasmid reached the maximum electricity transformation efficiency of 8.68×105 cfg/μg DNA in lactobacillus plantarum WCFS1. Both plasmid pIB184 and pNZ44 had high efficiency of electricity transformation in the three strains and all of them were more than 103 cfg/μg DNA. On the other hand, three plasmids, T-pAMS100, pSIP403 and pSIP409 had higher efficiency of electricity transformation in Lactobacillus casei and lactobacillus plantarum than in Lactococcus lactis. These results provided foundation for selecting more efficient electricity transformation system and expression system.

Key wordsLactococcus lactis; Lactobacillus casei; lactobacillus plantarum; electricity transformation; plasmid

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31371809，31401670)。

作者簡(jiǎn)介：王巧惠(1990～)，女，研究生。E-mail：w1234098098@163.com。 *通訊作者: 艾連中(1976～)，男，教授，博士，食品生物技術(shù)。E-mail：ailianzhong@163.com。