噴氣燃料中污染微生物檢測方法概況

楊　浩，　熊　云*，　朱　鵬，　和倩倩，　黃海龍

1. 中國人民解放軍后勤工程學院, 軍事油料應用與管理工程系， 重慶 401331；2. 浙江省寧波大學應用海洋生物技術教育部重點實驗室, 寧波 315211

噴氣燃料中污染微生物檢測方法概況

楊浩1，熊云1*，朱鵬2，和倩倩1，黃海龍2

1. 中國人民解放軍后勤工程學院, 軍事油料應用與管理工程系， 重慶 401331；2. 浙江省寧波大學應用海洋生物技術教育部重點實驗室, 寧波 315211

摘要：微生物污染不僅降解噴氣燃料，還嚴重威脅儲存和飛行安全。噴氣燃料中污染微生物的檢測是有效治理微生物污染的前提?；诖?，本文將噴氣燃料中污染微生物檢測方法分為傳統(tǒng)法、分析生物學法以及分子生物學方法，并對三種方法優(yōu)缺點進行了詳細介紹。最后對噴氣燃料中污染微生物檢測方法進行了展望。

關鍵詞：噴氣燃料； 微生物； 檢測方法； 傳統(tǒng)法； 分析生物學法； 分子生物學法

油庫日常管理中基本上是不可能做到貯藏設備的絕對光潔以及無水，因此基本上無法避免噴氣燃料中微生物的存在[1]。最早發(fā)現噴氣燃料微生物污染是在上世紀50年代，Bakanauskas發(fā)現飛機油箱中有微生物的存在，并影響了飛機正常飛行。兩年后，美國一架B-52轟炸機就因為微生物污染阻塞了過濾器而墜毀[2]。Gaylarde CC等發(fā)現噴氣燃料中微生物的存在會腐蝕貯藏設備、管道、氧化密封項圈，也會堵塞飛機過濾器等等[3]。根據美國1991年調查報道，每年僅由硫酸鹽還原菌造成的損失就有60億美元之多[4]。鑒于此，噴氣燃料微生物污染問題得到了廣泛的關注，并提出了許多解決方法。但是，噴氣燃料中污染微生物群落的鑒定是解決噴氣燃料微生物污染問題前提，對針對性解決貯藏設備腐蝕、油料管道堵塞等問題具有重要的指導意義。噴氣燃料中污染微生物的檢測方法也是隨著微生物檢測技術的發(fā)展而不斷改進，可分為傳統(tǒng)學方法、分析微生物學方法以及分子生物學方法。本文便從這三個方面對噴氣燃料中污染真菌檢測方法概況進行介紹，并對各方法的優(yōu)缺點進行了總結。

1傳統(tǒng)方法

1.1傳統(tǒng)方法應用

傳統(tǒng)方法多是先將微生物進行培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，再根據微生物形態(tài)學或者生態(tài)學特征、培養(yǎng)基理化變化以及特定的有性型分析來進行微生物種類鑒定。Darby RT等利用培養(yǎng)基方法對噴氣燃料中微生物進行分離鑒定，最后得到了主要污染真菌為枝孢霉(Hormoconisresinae)、擬青霉(Paecilomycesvarioti)、青霉(Penicillium)以及曲霉(Aspergillus)。Ferrari等利用培養(yǎng)基方法從JP-4樣品中分離出眾多種類的微生物，并總結出主要污染真菌為枝孢霉(Hormoconisresinae)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)以及硫酸鹽還原菌(Sulfate Reducing Bacteria)[5]。郭玲玲等利用不同的培養(yǎng)基從噴氣燃料微生物進行分離鑒定出了法式檸檬酸桿菌(Frenchcitricacidbacillus)、棒狀桿菌(corynebacterium)、麥芽桿菌(Maltbacillus)以及葡萄球菌(Staphylococci)等細菌，青霉菌(Penicillium)、木霉菌(Trichoderma)、曲霉菌(Aspergillus)和枝孢霉菌(Hormoconisresinae)等真菌[6]。袁祥波等利用傳統(tǒng)方法從噴氣燃料懸浮物中分離鑒定出枝孢霉菌，從而驗證了真菌是產生噴氣燃料懸浮物的主要原因之一[7]。

1.2傳統(tǒng)方法的局限性

傳統(tǒng)方法具有成本低、方便簡單的優(yōu)點，方法成熟，適用性范圍廣，是不可或缺的微生物鑒定方法。但是傳統(tǒng)方法基本上是建立在培養(yǎng)基基礎上的，這就要求被鑒定的微生物能夠在培養(yǎng)基中存活。但是Amann RI等發(fā)現自然環(huán)境中大約只有1%的微生物可以通過培養(yǎng)基的方法分離鑒定出來，表1列舉出了不同生境下可培養(yǎng)微生物的比例。另外，建立在培養(yǎng)基方法上的傳統(tǒng)方法因為需要對微生物進行培養(yǎng)，所以耗時長，難以滿足快速檢驗的需求[8]。

表1　不用生境下可培養(yǎng)微生物比例

2分析生物學方法

鑒于傳統(tǒng)方法的局限性，分析生物學法應運而生。這種方法主要是利用高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、質譜法(MS)以及氣質聯(lián)用的方法(GC/MS)來分析檢測微生物代謝產物、細胞中的脂肪酸、蛋白質 、多肽、多糖等，來進行微生物鑒定[9-11]。Fang J等利用GC/MS方法，通過對磷脂酯結合態(tài)脂肪酸分析，發(fā)現噴氣燃料中大量硫酸鹽還原菌的存在[12]。Jung等利用GC/MS檢測藤黃類諾卡菌代謝產物，來比較藤黃類諾卡菌代謝不同長度碳鏈烴的能力[13]。Rauch ME等利用氣相色譜法，通過分析脂肪酸甲酯鑒定出噴氣燃料中九個屬細菌，17種菌[14]。

分析生物學方法，實際上是借助化學分析的方法來進行微生物檢測，相對于傳統(tǒng)方法不需要對微生物進行培養(yǎng)，更加簡單、而且耗時短。另外，可以在幾個小時內快速定性或定量檢測出納克級別的微生物成分，所以可以用來快速鑒定微生物。但是，這種方法相比較來講，需要專門的操作人員，并且還需要配備相應的儀器，成本很高。并且分析生物學方法鑒定結果受微生物自身以及環(huán)境有關。不同的溫度、環(huán)境、微生物自身的胞齡都會或多或少的影響細胞脂肪酸的組成。即使嚴格按照儀器操作要求進行操作，數據庫中含有未知菌種與否會直接影響分析微生物脂肪酸結果的準確性。尤其當數據庫囊括的菌種匱乏的話，這種差異性會更大[15]。

3分子生物學方法

分子生物學方法是基于分子水平來研究生物生命活動及其科學規(guī)律，在微生物鑒定領域主要研究對象為微生物DNA和RNA。由于其具有準確性、靈敏度高、耗時短、特異性強、操作簡單等優(yōu)點，被廣泛利用在微生物檢測上[16]。在噴氣燃料微生物檢測方面的應用主要有聚合酶鏈式反應(PCR)方法，以及建立在PCR基礎上的16S、18S rDNA以及ITS基因測序方法。另外環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)和橫向流動試紙條快速檢測技術(LFD)相結合的LAMP-LFD檢測方法也出現在噴氣燃料微生物檢測領域[17-21]。

3.1PCR以及建立在PCR基礎上的檢測技術

Denaro T等利用傳統(tǒng)PCR和直接PCR方法在J-8樣品中分離鑒定出了之前沒有發(fā)現的28種菌，并且對比了直接PCR和傳統(tǒng)PCR在鑒別微生物方面的差異，發(fā)現直接PCR不需要對微生物進行培養(yǎng)，大大減少了操作步驟以及檢測周期，而且直接PCR檢測出微生物的數量一般是傳統(tǒng)PCR方法的4倍[17]。White等利用傳統(tǒng)PCR以及建立在PCR基礎上的變性梯度凝膠電泳(DGGE)方法對30個樣品進行微生物種群的鑒定分析，發(fā)現海洋桿菌屬(Marinobacter)、伯克氏菌屬(Burkholderia)以及鹽單胞菌屬(Halomonas)為主要的微生物種群[18]。Tardy-Jacquenod 等利用16S rDNA測序技術從水相樣品中分離鑒定出了21種硫酸鹽還原菌(Sulphate-reducing bacteria)[19]。袁祥波等利用18S rRNA技術特異性檢測噴氣燃料懸浮物中枝胞霉菌(Hormoconisresinae)，揭示了噴氣燃料懸浮物和真菌生長之間的關系[7]?；赑CR基礎上的16S、18S rRNA以及ITS測序相比較傳統(tǒng)方法以及分析生物技術具有特異性更強、更準確，尤其在微生物多樣性分析時具有更好的應用。

Rauch ME等對比GC-FAMEY法和16S方法鑒定噴氣燃料中微生物，發(fā)現GC-FAMEY法分離鑒定出來的一種需氧型細菌為英美地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，但是DNA測序卻發(fā)現該菌是短小芽孢桿菌Bacilluspumilus[15]。Harold W通過對比GC和16S rRNA方法發(fā)現，有些細菌GC方法沒有檢測出來，但是通過16S rRNA方法卻檢測出來[20]。這說明在菌種檢測上，分子生物學方法特異性和準確性要強于分析生物學方法。另外基因測序可以突破傳統(tǒng)方法的局限性，發(fā)現一些不能夠分離培養(yǎng)的微生物，這對研究微生物多樣性至關重要。

3.2LAMP方法的應用

LMAP是Notomi等人開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴增技術，相比于PCR技術具有特異性強、靈敏度該、操作簡單、不依賴專業(yè)設備，耗時短等優(yōu)點，近年來得到廣泛應用[21]。LFD是Kiatpathomchai設計的一種可以將LAMP擴增結果短時間內呈現在試紙條上的一種技術,這就簡化了LAMP產物檢測步驟，縮短了檢測時間，因此LAMP-LFD技術在微生物檢測方面得到了越來越多的應用[22]。和倩倩等首次利用LAMP-LFD方法對噴氣燃料中特征真菌枝孢霉(Hormoconisresinae)進行檢測，并跟PCR方法進行對比，發(fā)現不論特異性還是靈敏度，LAMP-LFD都比PCR方法強。而且用時只需35 min，遠遠低于PCR的3 h[23]。但是同樣因為LAMP方法擴增效率高，多組實驗同時進行，容易發(fā)生氣溶膠污染，出現假陽性[22]。

微流控技術的出現可以完美解決掉假陽性問題，并且還可以實現了LAMP反應的高通量檢測。微流控是一種精確控制和操控微尺度流體，尤其特指亞微米結構的技術。圖1為博奧生物有限公司開發(fā)的晶芯?RTisochipTM-A恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀及配套碟式芯片，擁有我國自主知識產權，而且在國際上也處于領先地位,。其碟式芯片實驗體系只需要1.5 μL,而普通LAMP方法反應體系為25 μL，大大減少了試劑以及模板使用量，節(jié)約了成本。碟式芯片具有24個通道，每個通道都設立緩沖區(qū)域，這樣就實現了多組實驗平行進行，而不會產生假陽性[24]。Zhou QJ等便利用晶芯?RTisochipTM-A恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀特異性檢測出10種水產生物致病菌。并且發(fā)現和傳統(tǒng)方法及PCR方法相比具有更高的靈敏度、特異性，而且操作簡單、耗時更短以及反應體系小的優(yōu)勢，可以用在微生物實時監(jiān)測上[25]。同時這些優(yōu)點正是部隊油庫噴氣燃料微生物檢測所需要的，因此完全可以將這種技術運用在噴氣燃料微生物檢測上。

圖1晶芯?RTisochipTM-A 恒溫擴增微流控芯片

核酸分析儀及配套碟式芯片

4國際航空運輸協(xié)會推薦的方法

國際航空運輸協(xié)會推薦了四種檢測飛機油箱中微生物的方法，為目前國際上運用最多的噴氣燃料污染微生物檢測方法[26]。根據原理可分為兩大類，傳統(tǒng)方法以及分子生物學方法。

4.1MicrobMonitor2?檢測方法

英國ECHA微生物學有限公司開發(fā)的Microb-Monitor2?裝置[26]，利用傳統(tǒng)方法，原理為在半固體營養(yǎng)培養(yǎng)基中加入顯色劑四氮唑紅(TTC)，若檢測燃料或水中含有微生物則在凝膠上會出現紅色的菌落，根據培養(yǎng)基上培養(yǎng)的微生物數量，可定量檢測燃料和水相中所有酵母菌、霉菌和細菌，如圖2。

圖2　使用MicrobMonitor2檢測噴氣燃料

4.2Easicult Combi檢測方法

芬蘭奧林診斷公司開發(fā)的Easicult Combi裝置，這種裝置只能檢測水相中的微生物，原理上和 MicrobMonitor2方法相似，都是利用傳統(tǒng)方法進行噴氣燃料中污染微生物的檢測，可做到半定量檢測霉菌、酵母菌和細菌[26]。和第一種方法不同的是Easicult Combi有標準微生物培養(yǎng)生長圖，鑒定時只需要將載片與標準圖對比即可，如圖3。

圖3　使用Easicult Combi檢測步驟

4.3HY-LiTE?JET A1燃料試驗

HY-LiTE?JET A1燃料試驗是德國默克集團開發(fā)出來的，利用分子生物學方法進行噴氣燃料中污染微生物的檢測，原理是通過測量樣品中ATP的含量來評估樣品中的活菌數，簡便快捷操作簡單[26]。Geva J等分別從22個軍用油相中提取樣品，分別利用測ATP熒光法和傳統(tǒng)法檢測燃料中微生物的量，發(fā)現燃料中菌落數在2 000 cfu/L～20 000 cfu/L之間時相關性達到0.96，而菌落數大于20 000 cfu/L時相關性變?yōu)?.54，菌落數小于2 000 cfu/L，相關性會更低，減小為0.25。所以，ATP熒光法用來評估噴氣燃料中微生物數量具有局限性，但是當菌落數在2 000 cfu/L～20 000 cfu/L之間時，準確率還是很高的[27]。但是HY-LiTE?JET A1燃料試驗即ATP熒光法只能告訴我們噴氣燃料中是否有微生物的存在，以及微生物的數量(這種方法根據Geva J等研究發(fā)現，不一定準確)，但是無法告訴我們是哪些微生物，即無法對污染微生物進行特異性檢測。

4.4FUELSTATTM resinae PLUS檢測方法

FUELSTATTM resinae PLUS方法[26]便解決了HY-LiTE?JET A1方法不能對噴氣燃料中微生物特異性檢測的缺點，這種方法本質上就是酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，是將酶催化的放大作用與特異性抗原抗體反應結合起來的一種微量分析技術，特異性強，準確率高的優(yōu)點。Gaylarde 等用酶聯(lián)免疫吸附法來鑒定航空煤油中的枝孢霉菌，發(fā)現這種方法準確性高，很少會和其他真菌有交叉反應[28]。但是這種方法容易出現假陽性反應、酶標板整體背景高以及吸光度數值偏高或偏低等問題，并且造成這些問題的原因很多，而且這種方法比較適合實驗室操作，很難應用在戶外使用[29]。

5展望

傳統(tǒng)方法，分析生物學方法以及分子生物學方法在實際運用中各有利弊，沒有一種方法可以適用于所有環(huán)境，滿足所有要求，應當根據實際需要選擇不同的方法進行污染微生物的鑒定，并且有些時候為了準確，會運用兩種或者三種方法進行比對以達到消除誤差的效果。油庫實地檢測要求檢測方法簡單、特異性強、耗時短，抗干擾能力強等，而和倩倩等人針對部隊實際需要開發(fā)的LAMP-LFD方法相對于傳統(tǒng)方法、分析生物學方法以及其他分子生物學方法相比，特異性更強、耗時更短，而且不需要依賴相對昂貴的專業(yè)儀器，因此利于現場實地快速檢測，值得推廣[23]。尤其是微流控技術的成熟應用，使得LAMP方法高通量特異性檢測噴氣燃料中污染微生物得以實現。另外，根據LFD試紙條檢測線亮度和LAMP擴增產物量之間的關系，可以發(fā)展LFD試紙條定量技術，這將是推動LAMP-LFD方法應用的另一個重要因素。假如LFD試紙條定量技術能夠成熟運用，將使得油庫噴氣燃料污染微生物實地定性定量快速檢測得以實現。

油罐中相對穩(wěn)定的微環(huán)境的形成，必然經歷了幾次微生物群落演替。因此建立準確微生物群落演替數據庫，對噴氣燃料污染微生物的防治具有重要意義。這樣當我們監(jiān)測到某種或者某幾種微生物出現的時候，根據微生物群落演替數據庫，我們就可以模擬出油罐中微生物接下來的變化，這就對我們針對性解決微生物污染提供了基礎。傳統(tǒng)方法以及分析生物學方法由于其本身的局限性，所以并不適合微生物群落演替的研究，而PCR、16S rRNA以及18S rDNA等方法不僅耗時長，操作復雜，而且分辨率低，在分析親緣關系近、變異小的物種時，會將多個鄰近基因型的樣本混為一體。新一代高通量測序技術(next-generation sequencing technology)的出現，大大縮短了測序時間，同時降低了成本，跨越了傳統(tǒng)分子生物學研究方法所不能逾越的鴻溝，使得對所有目標樣本進行全基因組測序和差異比較分析成為可能[30]。本課題組已經率先開展了此項工作，得到了一些進展，發(fā)現了之前許多噴氣燃料微生物研究未曾出現的微生物，并對噴氣燃料中微生物進行了歸屬。因此可以預見，新一代高通量測序技術(next-generation sequencing technology)在噴氣燃料微生物污染問題的解決上具有廣泛的應用前景。

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An outline of detection methods for microorganisms in jet fuel

YANG Hao1, XIONG Yun1, ZHU Peng2, HE Qian-qian1,HUANG Hai-long2

1. Dept. of Oil Application & Management Engineering，LEU，Chongqing 401311，China;2. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China

AbstractMicrobial contaminants in aviation fuel not only degrade the fuel, but also accelerate corrosion within the fuel tank and threaten flight safety. The detection of contaminating microorganism in jet fuel is the premise of effective treatment of microbial contamination. The methods for detecting the contamination in jet fuel are divided into traditional methods, analytical microbiology methods and molecular biology methods. The advantages and disadvantages of the three methods for detecting microrganisms in jet fuel and their developments were introduced.

Key wordsjet fuel; microorganism; detection methods; traditional methods; analytical microbiology methods; molecular biology methods

基金項目：總后勤部物資油料部重大項目“微生物對庫存噴氣燃料懸浮物的影響及防治技術研究” yx214L048。

作者簡介：楊浩(1991～)，研究生， 主要從事方向為噴氣燃料微生物污染方面的研究。E-mail：yanghaolyyz20@126.com。 *通訊作者: 熊云，教授，博士生導師。中國人民解放局后勤工程學院軍用油料應用教研室主任,曾獲部隊科技進步二等獎，主要從事軍用油品應用、油料節(jié)約研究。電話：023-8673142，E-mail：xyun241@126.com。