一種優(yōu)化的提高質(zhì)粒產(chǎn)量的提取方法

王宗宇，張曉瑛，張小玲，楊永廣*，代相鵬*

(1. 吉林大學第一醫(yī)院人類疾病動物模型國家地方聯(lián)合工程實驗室，吉林 長春 130021；2. 吉林大學第一人民醫(yī)院器官再造與移植教育部重點實驗室，吉林 長春 130021)

質(zhì)粒(plasmid)是廣泛存在于生物界的環(huán)狀雙鏈DNA分子[1]。質(zhì)粒DNA作為最基本的基因載體工具，在分子生物學、生物化學與細胞生物學等學科中得到廣泛的應用[2]。質(zhì)粒載體含有3個共同的結構：復制子，選擇性標志和克隆位點，它們在質(zhì)粒的表達與復制中發(fā)揮重要作用[3]。

人們通過在質(zhì)粒中插入目的基因，構建重組質(zhì)粒，使目的基因在動物模型中表達，可以研究動物的生長發(fā)育、疾病發(fā)生等情況，如P53基因在犬乳腺惡性腫瘤中高表達[4]，VIPR-1基因在高產(chǎn)太行雞中高表達[5]。從分子與細胞層次上探究這些基因的作用機制就需要構建基因的重組質(zhì)粒，建立轉基因動物，以進行下一步的功能研究?，F(xiàn)在廣泛應用的基因編輯工具CRISPR/Cas9基因編輯技術，是以質(zhì)粒作為表達載體和基因修復序列的供體，從而實現(xiàn)精準地敲除、插入或替換基因組中特定的DNA序列，在瀕危物種保護、動物品種改良和基因功能研究與疾病的治療中發(fā)揮重要的作用[6]。

疫苗是一種預防多種病毒性疾病的有效且通用的方法。從200年前首次成功應用牛痘疫苗抵抗天花到現(xiàn)在，疫苗已大大減少了許多重要疾病對動物的影響。核酸疫苗是一種具有極大發(fā)展?jié)摿η野踩行У囊呙纭Ｊ紫韧ㄟ^質(zhì)粒構建編碼疫苗抗原的DNA，并通過多種途徑傳遞給受體，然后DNA被宿主細胞吸收并轉錄為mRNA，翻譯成疫苗蛋白，所表達的蛋白質(zhì)被宿主免疫系統(tǒng)識別為外源蛋白質(zhì)，并引發(fā)免疫反應從而在動物體內(nèi)發(fā)揮作用?，F(xiàn)在常用的核酸疫苗有貓免疫缺陷病毒疫苗、犬細小病毒疫苗、禽流感病毒疫苗等[7]?？贵w治療同樣是動物疾病治療的有效手段，而抗體制備時也需要構建重組質(zhì)粒作為抗原基因的載體，如制備非洲豬瘟病毒抗體等[8]。

獲得足夠量的質(zhì)粒是質(zhì)粒應用的重要一步。生物學試驗中質(zhì)粒的獲取方式主要是通過在大腸桿菌中擴增，從而獲取大量的含有目的基因的載體質(zhì)粒。其主要過程是對感受態(tài)細菌進行轉化，挑取克隆菌落，LB培養(yǎng)基中搖菌擴增和質(zhì)粒抽提[9]。目前科研工作者已經(jīng)開發(fā)出很多質(zhì)粒抽提的方案，包括堿裂解法、加熱法、WELCH法、Brij法等。其中薩姆布魯克提出的堿裂解法操作簡單、提取質(zhì)粒純度高、質(zhì)量好，是現(xiàn)今最為常用的質(zhì)粒DNA提取方法，但該方法存在用時過長等不足[10]。針對這個不足，人們對該方法不斷改良，嘗試對反應條件進行優(yōu)化以期縮短試驗用時，但仍然存在提取DNA所需時間較長，抽提的質(zhì)粒濃度不高等問題[11]。

基因工程相關的試驗需要高濃度及高純度的質(zhì)粒DNA。然而質(zhì)粒得率和質(zhì)量會因目前使用的商業(yè)化試劑盒的不同而有較大的差異，從而影響了質(zhì)粒載體的應用。低效率和低產(chǎn)量的質(zhì)粒提取會對人力、物力造成極大的浪費，因此開發(fā)和優(yōu)化新的質(zhì)粒提取方法從而提高質(zhì)粒產(chǎn)量和質(zhì)量是基因工程等領域中的一個值得重視的技術問題。

本試驗通過對商品試劑盒的質(zhì)粒提取程序進行兩步優(yōu)化，顯著提高了質(zhì)粒提取的產(chǎn)量，并且沒有影響質(zhì)粒的質(zhì)量。應用本試驗方法，可以節(jié)省人力與物力，有助于解決某些質(zhì)粒在細菌中拷貝數(shù)低和提取效率低的問題，為質(zhì)粒載體更好地應用于生命科學研究提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒載體和細胞系

試驗所用的質(zhì)粒有pCDNA3.0-HA-GCN5,pLenti-GFP-DOCK8,pCDNA3.0-HA-BIRC5,pCMV-Flag-SPOP,pCDNA3.0-HA-p300,pCDNA3.0-GFP-BRD2和pLenti-GFP。HEK293細胞系用DMEM+10%胎牛血清(FBS)在37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。豬成纖維(porcine fibroblast, PFF)細胞系用α MEM +15% FBS在38.5 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

試驗中用到的主要試劑包括質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN，12362)，抗HA-Tag抗體(BioLegend，MMS-101P)，抗Vinculin抗體(Sigma，V4505)，抗GFP抗體(Clontech，8371-2)，抗BRD2抗體(Proteintech，22236-1-AP)，高葡萄糖 DMEM培養(yǎng)基(Gibco，C11995500BT)，αMEM培養(yǎng)基(Gibco，12571063)，胎牛血清(Gemini，900-108)，瓊脂糖(Thermo，75510019)，DNA 上樣緩沖液(TaKaRa，9157)，LB Agar(Invitrogen，22700025)，Protease inhibitor cocktail (Roche, 04693159001)，Phosphatase inhibitor(Bimake，B15001)，細胞裂解液EBC buffer(50 mmol/L Tris pH=7.5, 120 mmol/L NaCl, 0.5% NP-40)，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(SDS 33.3 g，Glycerol 167 mL，DTT 25 g，ddH2O 500 mL)，ECL 發(fā)光液(Millipore，WBKLS0500)，TransStbl3 Chemically Competent Cell(Transgen，CD521-02)，P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit S(Lonza，V4XP-3032)。

1.3 質(zhì)粒提取

1.3.1 轉化

從-80 ℃冰箱中取出感受態(tài)細胞(TransStbl3 Chemically Competent Cell)迅速置于冰上，待感受態(tài)細胞融化后取25～50 μL于1.5 mL EP管中，加入100 ng質(zhì)粒并混合均勻，冰上放置30 min后于42 ℃水浴中60 s，迅速置于冰上2 min，加入無抗菌素的400 mL LB液體培養(yǎng)基于37 ℃，200 r/min搖床孵育1 h，取100 μL該LB均勻涂布于相應抗性的平板上，于37 ℃生化培養(yǎng)箱孵育過夜。

1.3.2 質(zhì)粒提取方法的優(yōu)化

用試劑盒進行質(zhì)粒提取，基本程序：取37 ℃ 孵育過夜的平板，用無菌槍頭刮取菌落，放入400 mL 含相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃培養(yǎng)搖菌過夜(10～20 h)。離心收集菌體，10 mL P1懸浮菌體，10 mL P2裂解菌體，10 mL P3中和菌體以釋放質(zhì)粒，離心收集包含質(zhì)粒的上清液(簡稱細菌裂解)，上清液過柱(簡稱過柱)，清洗液清洗2次柱子，用15 mL洗脫液從柱子上洗脫質(zhì)粒(簡稱洗脫)，加入10.5 mL的異丙醇沉淀質(zhì)粒，離心沉降質(zhì)粒后去掉上清液，70%乙醇洗1遍后用0.1×TE溶解質(zhì)粒，收集到1.5 mL離心管10 000 r/min離心2 min，取上清。

為了優(yōu)化質(zhì)粒提取方法，設計了下面的試驗：

組1(優(yōu)化)：在進行大量搖菌前，進行小管搖菌(優(yōu)化步驟1)，即取37 ℃孵育過夜的平板，用無菌槍頭刮取一些菌體，放入5 mL 含相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃孵育6 h。在加入異丙醇后置于-20 ℃冰箱過夜然后進行后面的離心操作(優(yōu)化步驟2)。

組2：只增加優(yōu)化步驟1，不實行優(yōu)化步驟2。

組3：不增加優(yōu)化步驟1，實行優(yōu)化步驟2。

組4(常規(guī))：不增加優(yōu)化步驟1，不實行優(yōu)化步驟2。

1.4 質(zhì)粒的濃度和雙酶切測定

用微量分光光度計(IMPLEN，NanoPhotometer P-Class)測定質(zhì)粒濃度，計算不同質(zhì)粒提取組中得到的質(zhì)?？偭浚涗汚260/A280和A260/A230值，用1%瓊脂糖凝膠電泳后，通過紫外照射檢測質(zhì)粒超螺旋情況，評判質(zhì)粒質(zhì)量。將提取的HA-BIRC5質(zhì)粒用EcoRⅠ與XhoⅠ進行了雙酶切，通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切效率。

1.5 質(zhì)粒的表達檢測

將2種方法提取的5 μg pLenti-GFP-DOCK8質(zhì)粒用Lipo2000(Invitrogen，11668019)根據(jù)說明書轉染到前1 d準備好的6 cm細胞培養(yǎng)皿中的HEK293細胞中，48 h后通過熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白(GFP)的表達情況。將2種方法提取的5 μg pLenti-GFP-DOCK8，2 μg HA-GCN5，2 μg HA-BIRC5和2 μg pLenti-GFP質(zhì)粒用Lipo2000(Invitrogen，11668019)根據(jù)說明書轉染到前1 d準備好的6 cm細胞培養(yǎng)皿中的HEK293細胞中，48 h后收集細胞進行免疫印跡試驗。將PFF細胞消化下來后，加入Lonza電轉液，用電轉儀(4D-Nucleofector Core Unit，Lonza)設置DT130電轉條件將2種方法提取的5 μg pLenti-GFP質(zhì)粒電轉到PFF中。

轉染或者電轉48 h后收集細胞，加入EBC蛋白裂解液(含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)裂解細胞后離心，取上清液用酶標儀測定蛋白濃度，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮5 min，樣品保存于-20 ℃。用SDS-PAGE分離后，加入相應的抗體后顯影檢測蛋白表達。

1.6 體內(nèi)泛素化試驗

將2 μg His-ub，2 μg GFP-BRD2，2 μg不同方法提取的Flag-SPOP 轉染到HEK293細胞中，36 h后加入20 μmol/L MG132處理6 h。細胞用裂解液A(6 mol/L guanidine-HCl, 0.1 mol/L Na2HPO4/PO4, 10 mmol/L imidazole[pH=8.0]) 裂解并進行超聲破碎。10 000 r/min離心后取上清液與鎳一三乙酸 (Ni-NTA) (QIAGEN) 在常溫孵育3 h。用裂解液A 洗滌2遍后，用液體A/TI (1體積buffer A和3體積buffer TI)洗滌2遍，然后用溶液TI(25 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L imidazole[pH=6.8])洗滌1遍后加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后進行免疫印跡。

1.7 體內(nèi)乙?；囼?/h3>

將HEK293細胞轉染0.5 μg Flag-P53，3 μg不同方法提取的HA-P300。細胞裂解后計算濃度取1 000 μg，用EBC蛋白裂解液將體積補至500 μL，加8 μL HA-beads (GE Healthcare)，20 μL 5 mol/L NaCl。4 ℃旋轉孵育3 h。用NETN buffer (20 mmol/L Tris, pH值8.0, 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA， 0.5% NP-40)洗滌4遍后加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后進行免疫印跡。

1.8 統(tǒng)計學分析

熒光顯微鏡圖片中的GFP熒光強度和Western blot結果的灰度等均由Image J軟件進行分析。

2 結果

2.1 質(zhì)粒提取方法的優(yōu)化

以pLenti-GFP為目的質(zhì)粒，用不同的方法對質(zhì)粒進行提取。如表1所示，與組4相比，組1至組3在一定程度上都提高了質(zhì)粒的產(chǎn)量，其中組1質(zhì)粒產(chǎn)量提高的最多，表明兩步優(yōu)化能得到最佳的質(zhì)粒提取效果。

表1 不同方法對質(zhì)粒提取效率的影響

2.2 不同方法提取的質(zhì)粒的產(chǎn)量的檢測

如表2所示，常規(guī)提取方法獲得的質(zhì)?？偭繛?.6～0.9 mg，而優(yōu)化提取方法獲得的質(zhì)?？偭繛?.8～1.2 mg。常規(guī)方法提取質(zhì)粒的A260/A280和A260/A230比值(A260/A280=1.90±0.05，A260/A230=2.40±0.3) 與優(yōu)化方法提取質(zhì)粒的A260/A280和A260/A230比值(A260/A280=1.90±0.05，A260/A230=2.40±0.2)無顯著差異。

表2 不同方法的質(zhì)粒提取效率

2.3 質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳和雙酶切

對2種方法提取的質(zhì)粒進行1%瓊脂糖凝膠電泳。結果表明，優(yōu)化方法和常規(guī)方法提取質(zhì)粒的超螺旋條帶沒有明顯區(qū)別(圖1A～1E)。2種方法提取的HA-BIRC5質(zhì)粒用EcoRⅠ與XhoⅠ進行了雙酶切，通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切效率，結果表明優(yōu)化方法沒有影響質(zhì)粒的酶切效率(圖1F)。

M. DNA Marker；1. 常規(guī)方法提取的質(zhì)粒；2. 優(yōu)化方法提取的質(zhì)粒。A. GFP-DOCK8；B. Flag-SPOP；C. HA-GCN5；D. HA-BIRC5；E. HA-P300；F. 質(zhì)粒HA-BIRC5雙酶切產(chǎn)物

2.4 質(zhì)粒的細胞內(nèi)表達效率的檢測

用熒光顯微鏡檢測pLenti-GFP-DOCK8在HEK293細胞中的表達，結果表明，優(yōu)化方法提取的質(zhì)粒表達升高(圖2)。免疫印跡試驗檢測pLenti-GFP-DOCK8(圖3A)、HA-GCN5(圖3B)、HA-BIRC5(圖3C)和pLenti-GFP(圖3D)質(zhì)粒在HEK293細胞的表達，結果表明優(yōu)化方法提取的質(zhì)粒的表達效率沒有降低。用熒光顯微鏡檢測pLenti-GFP質(zhì)粒在PFF細胞中的表達，結果表明2種方法提取的質(zhì)粒均能高效地轉染到PFF細胞中(圖4)。

圖2 熒光顯微鏡檢測pLenti-GFP-DOCK8在HEK293細胞中的表達

A. GFP-DOCK8; B. HA-GCN5; C. HA-BIRC5; D. pLenti-GFP

圖4 熒光顯微鏡檢測pLenti-GFP在PFF中的表達

2.5 質(zhì)粒生物學功能的檢測

乙酰化試驗、泛素化試驗和細胞內(nèi)降解試驗的結果表明，2種方法提取的散斑型BTB/POZ蛋白(speckle type BTB/POZ protein, SPOP)具有相似的促進底物布羅莫結構域蛋白2(bromodomain containing 2, BRD2)泛素化(圖5A)和降解的能力(圖5B)，2種方法提取的P300均能有效促進P53的乙?；?圖5C)。

A. Western blot檢測SPOP促進BRD2泛素化；B. Western blot檢測SPOP降解BRD2；C. 免疫共沉淀檢測P300促進P53乙?；?/p>

3 討論

質(zhì)粒DNA作為基因表達載體被廣泛應用在基因工程中。所有提取質(zhì)粒DNA的方法基本都包括培育菌體使質(zhì)粒擴增，回收細菌并使其裂解，分離并純化質(zhì)粒這3個基本步驟。目前關于質(zhì)粒提取的方法主要有堿裂解法、煮沸法、WELCH法等。質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量是影響質(zhì)粒應用的重要因素。而質(zhì)粒提取質(zhì)量與效率受到菌體濃度、培育時間、提取方法等多個因素的影響。因此，研究者們通過嘗試不同的方法對質(zhì)粒的提取條件進行改良，以期提高質(zhì)粒的提取產(chǎn)量，并縮短質(zhì)粒的提取時間。

薛仁鎬等[12]通過反應條件的改良，建立了一種極為快速的質(zhì)粒DNA堿裂解法，改良方法大大縮短了質(zhì)粒DNA制備時間，但質(zhì)粒得率較低。胡小青等[13]在低溫條件下進行質(zhì)粒提取，以增加質(zhì)粒抽提產(chǎn)量，并增加其在細胞中表達效率的方法，該方法發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒提取過程中各個步驟均對溫度敏感，低溫條件是增加質(zhì)粒產(chǎn)量的最優(yōu)選擇，但是操作過程需全程在4 ℃條件下進行，需要冷庫才能進行，時間也沒有得到明顯縮短。朱開春等[14]通過對在傳統(tǒng)的煮沸裂解法進行改進，并選擇質(zhì)粒保有率高、適合發(fā)酵的 TOP10 菌株，在70 ℃的裂解溫度下進行質(zhì)粒提取，從而簡化了抽提過程，縮短了提取時間，同時增加了質(zhì)粒 DNA 的提取效率。但缺點是煮沸法較易破壞質(zhì)粒 DNA 的結構，且不適用于沒有氯霉素處理的培養(yǎng)物。吳韶光等[15]對WELCH法進行了改進，去掉加RNase和酚:氯仿抽提步驟，使WELCH法更為簡捷、方便。但因為尚不清楚的原因，用這種方法粗提的質(zhì)粒DNA在4 ℃存放時，DNA常常自行降解。本研究通過綜合他人的試驗優(yōu)點，在常規(guī)的提取程序中增加了提前小管搖菌和異丙醇-20 ℃過夜孵育，其中小搖過程可能有助于細菌的擴增從而提高初始菌液的濃度，而異丙醇低溫過夜步驟可能降低質(zhì)粒DNA在異丙醇中的溶解度從而有助于質(zhì)粒的醇沉，使質(zhì)粒提取的產(chǎn)量提高了20%～40%，提取的質(zhì)粒經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳、雙酶切等試驗，顯示質(zhì)量并沒有降低。質(zhì)粒的生物學功能通過蛋白泛素化和乙?；囼炦M行了驗證。SPOP是一種Cullin3家族的E3泛素連接酶，SPOP與底物結合后對底物蛋白質(zhì)進行泛素化和降解。目前已經(jīng)知道的SPOP的底物有多種，課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，SPOP能夠結合、泛素化并降解BET(bromodomain and extra-terminal)蛋白質(zhì)家族BRD2、BRD3、BRD4等[16]。本試驗結果表明，優(yōu)化方法沒有降低SPOP促進底物泛素化和降解的能力。

雖然本研究優(yōu)化了質(zhì)粒的提取方法，但是質(zhì)粒產(chǎn)量仍然有待提高，后面應該在該方法的基礎上，進一步改進提取策略，以期更大地提高質(zhì)粒產(chǎn)量?？傊狙芯渴褂贸Ｒ娫噭┖?，通過優(yōu)化質(zhì)粒的提取步驟，提高了質(zhì)粒抽提效率，節(jié)省了時間和財力、物力，為進一步優(yōu)化質(zhì)粒提取方法和思路上提供重要的參考和指導，也為需要大量質(zhì)粒DNA的試驗，如腺相關病毒(AAV)介導的基因治療等降低了質(zhì)粒提取的成本。