雞球蟲毒力致弱方法及其在雞球蟲病弱毒活疫苗研發(fā)上的應(yīng)用

尹理君，廖申權(quán)，孫銘飛，宋忠峰1,，侯曉礁，李福元，呂敏娜，吳彩艷，李娟，林栩慧，蔡海明，胡俊菁，于林增，肖文婉，張健騑，戚南山 *，顧有方

(1. 安徽科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；3. 北京生泰爾科技股份有限公司，北京市中獸藥工程技術(shù)研究中心，北京 100260)

雞球蟲病是由一種或多種艾美耳球蟲引起的腸道寄生蟲病，可嚴(yán)重影響受感染雞群的增重和飼料轉(zhuǎn)化利用率，雛雞感染球蟲時(shí)可造成高發(fā)病率及致死率，愈后雞也存在生長(zhǎng)不良，生產(chǎn)性能下降等問題，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，據(jù)估計(jì)全球養(yǎng)雞業(yè)每年因雞球蟲病可造成超過30億美元的經(jīng)濟(jì)損失[1]。近年來，大規(guī)模集約化的飼養(yǎng)模式更加有利于雞球蟲的傳播與感染，導(dǎo)致雞球蟲病發(fā)病率顯著增高[2]。

自上世紀(jì)60年代，一些化學(xué)合成藥物、聚醚離子載體類藥物已被廣泛應(yīng)用于雞球蟲病的預(yù)防和控制，但因?yàn)榭骨蛳x藥的長(zhǎng)期使用及一些不合理用藥等情況，導(dǎo)致雞球蟲幾乎對(duì)現(xiàn)有抗球蟲藥均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，部分蟲株甚至產(chǎn)生不同程度的交叉耐藥現(xiàn)象[3]。雞球蟲耐藥蟲株的出現(xiàn)嚴(yán)重影響了抗球蟲藥物的使用效果，在田間蟲株耐藥性情況不清晰的情況下使用抗球蟲藥，極有可能造成雞球蟲病的大規(guī)模暴發(fā)。同時(shí)因抗球蟲藥的長(zhǎng)時(shí)間使用，導(dǎo)致的藥物殘留問題嚴(yán)重影響家禽產(chǎn)品質(zhì)量[4]。雞球蟲病活疫苗是目前可替代抗球蟲藥物防控雞球蟲病的重要方法之一，目前常用的雞球蟲病活疫苗主要包括強(qiáng)毒活疫苗和弱毒活疫苗。球蟲強(qiáng)毒活疫苗是由強(qiáng)毒且免疫原性好的蟲株，按一定的配比研制而成。強(qiáng)毒活疫苗由于其蟲株毒力較強(qiáng)，存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)，其使用存在一定的局限性[5]。而弱毒活疫苗是通過人為方法減弱艾美耳球蟲蟲株的致病性所得到的弱毒蟲株而制成的活疫苗，它可以降低對(duì)宿主的危害，穩(wěn)定性能好，安全性高，同時(shí)擁有著良好的免疫原性。目前關(guān)于雞球蟲病弱毒活疫苗的研制手段主要是通過理化致弱、雞胚傳代和早熟選育等方法，可獲得致病力弱、免疫原性好的弱毒蟲株[6]。鑒于國內(nèi)缺乏相關(guān)致弱方法的系統(tǒng)性綜述，本文旨在對(duì)球蟲強(qiáng)毒蟲株毒力的相關(guān)致弱處理方法及其在弱毒球蟲疫苗研制中應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行概述。

1 雞胚傳代致弱法

1.1 雞胚傳代的背景

國外學(xué)者Long[7]首先報(bào)道了柔嫩艾美耳球蟲能在發(fā)育的雞胚內(nèi)生長(zhǎng)，證明球蟲在雞胚中連續(xù)培養(yǎng)、傳代能導(dǎo)致雞胚適應(yīng)株的產(chǎn)生。于1972年Long首次用雞胚傳代方法對(duì)野生型強(qiáng)毒株球蟲進(jìn)行毒力致弱處理，培育出柔嫩艾美耳球蟲致弱株“TA株”。國內(nèi)最早由楊振中等[8]學(xué)者采用雞胚傳代的方法對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(上海天山株)進(jìn)行致弱處理，培養(yǎng)出了柔嫩艾美耳球蟲致弱蟲株，并于1984年完成了實(shí)驗(yàn)室研究，試制成弱毒活疫苗。Shirley[9]將毒害艾美耳球蟲卵囊脫囊后獲得的子孢子接種到雞胚，并通過雞胚反復(fù)傳代，培育出第一個(gè)雞胚適應(yīng)株球蟲，并發(fā)現(xiàn)該雞胚適應(yīng)株對(duì)雞的致病性明顯低于親本株，但仍保留了良好的免疫原性。樊生超等[10]用雞胚傳代的致弱方法將柔嫩艾美耳球蟲經(jīng)過32代雞胚傳代，得到柔嫩艾美耳球蟲實(shí)驗(yàn)蟲株，通過雞體毒力回歸試驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)蟲株與親本株相比，其毒力明顯降低，可用于制備雞球蟲病活疫苗的研究。謝明權(quán)等[11]用雞球蟲子孢子接種雞胚，采用加大接種劑量和增加接種胚數(shù)的方法，使球蟲逐漸適應(yīng)雞胚，傳至24代，培育柔嫩艾美耳球蟲體外繁殖雞胚適應(yīng)株。樊玉娟等[12]通過雞胚傳代對(duì)柔嫩艾美耳球蟲傳代條件進(jìn)行研究，探究出了柔嫩艾美耳球蟲的雞胚培養(yǎng)條件并建立了柔嫩艾美耳球蟲雞胚適應(yīng)株。

1.2 雞胚傳代的原理

雞胚傳代減毒的原理是通過人工措施使雞球蟲卵囊在體外達(dá)到脫囊效果，從而得到一定數(shù)量的子孢子，然后將子孢子接種到雞胚絨毛尿囊膜上繼續(xù)培養(yǎng)，繁殖得到更多的后代卵囊，將其孢子化后通過雞胚連續(xù)傳代多次，從而獲得對(duì)雞致病力大大降低、免疫原性好的“雞胚適應(yīng)株”[13]。其強(qiáng)毒株毒力得到致弱主要是由于第2代裂殖體從原來的黏膜固有層轉(zhuǎn)而全部寄生到了腸腺上皮細(xì)胞，對(duì)組織損傷較小。

1.3 雞胚傳代的優(yōu)勢(shì)與局限

通過雞胚傳代的方法獲得的雞胚適應(yīng)株，對(duì)雛雞的致病力減弱，可使雛雞抵抗強(qiáng)毒株的攻擊。但其致弱性能相對(duì)不穩(wěn)定，當(dāng)轉(zhuǎn)為雞體傳代時(shí)毒力返強(qiáng)較快。大批量生產(chǎn)商品化弱毒卵囊比較困難，如堆型、巨型艾美耳球蟲等流行性強(qiáng)的球蟲不易在雞胚中發(fā)育，生產(chǎn)全價(jià)致弱疫苗會(huì)受到很大限制。同時(shí)隨著雞胚傳代次數(shù)的增加，蟲體的免疫原性可能會(huì)減少或完全喪失，很難獲得既能保持良好的免疫力，又可以使毒力致弱的最佳蟲株[14]。

2 理化致弱法

2.1 理化致弱的背景

早在1991年國外學(xué)者Jenkins等[15]發(fā)現(xiàn)用15 Krad X-射線和12 Krad γ-射線分別處理堆型和巨型艾美耳球蟲卵囊，可明顯減弱卵囊毒力，并發(fā)現(xiàn)用輻射減毒的卵囊免疫接種仍可以誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。顧有方等[16]用重鉻酸鉀、氯化鈉、碳酸氫鈉、葡萄糖、氯化鉀、疊氮鈉和蒸餾水等制備了強(qiáng)毒雞球蟲致弱劑，可成功致弱柔嫩、堆型、早熟、巨型和毒害等艾美耳球蟲。劉春杰[17]用物理方法和化學(xué)方法將柔嫩艾美耳球蟲混合株致弱，首先將孢子化卵囊在一定功率不同超聲時(shí)間的超聲波作用下致弱，然后配制化學(xué)致弱劑，將孢子化卵囊和化學(xué)致弱劑攪拌混合均勻進(jìn)行致弱，獲得了柔嫩艾美耳球蟲致弱混合株。劉蕾[18]以紫外線照射對(duì)柔嫩艾美耳球蟲YL株進(jìn)行致弱，發(fā)現(xiàn)經(jīng)紫外線照射過的球蟲卵囊相比未經(jīng)過紫外線照射過的卵囊對(duì)雞體的影響較小，癥狀和病理變化較輕,且沒有死亡現(xiàn)象。李丹青等[19]采用雙重致弱的方法，由柔嫩、毒害和巨型三種艾美耳球蟲分離、純化、培養(yǎng)后的孢子化卵囊采用烷化劑類化學(xué)誘變劑進(jìn)行致弱后，又采用紫外線照射物理誘變因素再次進(jìn)行致弱，得到雙重致弱株，其誘變率高，毒力低，免疫效果穩(wěn)定。

2.2 理化致弱的原理

理化致弱強(qiáng)毒株主要是通過冷卻、加熱、離子輻射、超聲等物理或化學(xué)誘變劑等方式處理，使強(qiáng)毒株的毒力有所下降，從而達(dá)到減毒的目的。但因理化方法處理可能會(huì)造成卵囊的破壁、失活等，通過這些方式致弱處理可能是殺死了部分孢子化卵囊，減少了接種雞體卵囊的實(shí)際數(shù)量，而非真正降低了艾美耳球蟲的致病性，達(dá)到弱毒的效果。

2.3 理化致弱的優(yōu)勢(shì)與局限

通過理化致弱的方法產(chǎn)生的卵囊，毒力明顯減弱，用減毒的卵囊進(jìn)行免疫接種時(shí)，可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。但通過輻射處理得到的弱毒卵囊的裂殖發(fā)育階段幾乎完全中止，且隨著輻射代次增加，卵囊的致病性會(huì)恢復(fù)正常。

3 早熟卵囊選育法

3.1 早熟選育的背景

早熟選育的方法最早是由Jeffers[20]提出并建立了早熟蟲株的選育過程及相關(guān)研究方法的，隨后通過此方法成功選育出了柔嫩、堆型、毒害、早熟、和緩和巨型艾美耳球蟲等早熟弱毒品系。與親本株相比早熟株毒力顯著減弱，卵囊產(chǎn)量減少，內(nèi)源發(fā)育周期中第三代裂殖體幾乎完全缺失或數(shù)量減少。Shirley等[21]用分離出的布氏艾美耳球蟲單卵囊進(jìn)行雞體傳代，再用收取的潛隱期卵囊經(jīng)過27代早熟選育，得到了生活史明顯縮短的布氏艾美耳球蟲早熟品系。王時(shí)偉[22]通過選擇提前發(fā)育成熟的卵囊，獲得布氏艾美耳球蟲湯陰株的早熟株，經(jīng)16代選育，最小潛隱期從119 h減少到90 h。索勛[23]按照早熟系選育方法對(duì)和緩艾美耳球蟲涿州株進(jìn)行了早熟選育，經(jīng)石歧雜肉仔雞15次傳代后，潛隱期縮短了19 h，由親本株的96 h縮短至77 h，其選育出的和緩艾美耳球蟲涿州株早熟系在致病性與繁殖力上均較親本株弱，但保留了親本株的免疫原性。崔平等[24]通過對(duì)6株田間巨型艾美耳球蟲早熟選育，經(jīng)20次傳代,獲得了遺傳性狀穩(wěn)定，潛隱期由156 h縮短至132 h的巨型艾美耳球蟲早熟株。劉麗丹等[25]通過雞體對(duì)和緩艾美耳球蟲保定株連續(xù)11代的早熟選育后，獲得了潛隱期由97 h縮短至82 h的早熟系。

3.2 早熟選育的原理

雞球蟲感染產(chǎn)生的卵囊在雞體內(nèi)連續(xù)早熟選育傳代產(chǎn)生的蟲株，由于裂殖期的裂殖代數(shù)的減少使球蟲的生活周期可以快速完成，最后一代裂殖子的缺失或減少顯著降低早熟品系的致病力，使得早熟株不僅具有生命周期縮短的特點(diǎn)，而且具有明顯的毒力減弱的特征[26]。早熟選育法就是運(yùn)用此原理用單卵囊分離法獲得球蟲卵囊，卵囊孢子化后接種雛雞，收集感染后最先排出的卵囊，重復(fù)傳代，不斷選育獲得早熟品系[27]。早熟株致病力減弱的原因是第二代裂殖體沒有完全分化或在成熟時(shí)變得非常小，絕大多數(shù)只經(jīng)歷了1～3代的裂殖生殖，缺少完整的裂殖生殖階段，在宿主中完成內(nèi)生性發(fā)育比野生型親本蟲株更快，使之毒力變?nèi)酢?/p>

3.3 早熟選育的優(yōu)勢(shì)

早熟株與親本株相比潛隱期明顯縮短，致病力明顯降低[28]。早熟品系的致病性明顯低于強(qiáng)毒親本株，隨著連續(xù)數(shù)代的早熟選育，獲得的早熟株減毒作用保持穩(wěn)定；對(duì)于各種球蟲的選育，持續(xù)傳代，直到常規(guī)劑量下早熟品系對(duì)受感染雞群的體增重沒有影響或產(chǎn)生的影響非常微小。如Paracox-8疫苗，七種弱毒早熟株按照一定配比混合，對(duì)接種的雞群也不會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)。

早熟株有著良好的早熟特性，能保持較好的免疫原性。廖貴城等[21]等對(duì)布氏艾美耳球蟲進(jìn)行了20代早熟選育，其致病力與繁殖力均比親本蟲弱,而免疫原性不變，并保持了遺傳穩(wěn)定性。張志敏等[30]通過研究選育了柔嫩艾美耳早熟株，并對(duì)早熟株和其親本株卵囊的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早熟株的免疫原性要好于親本株。

4 致弱方法在雞球蟲病疫苗研發(fā)上的應(yīng)用

1951年，第一個(gè)適用于種雞和蛋雞的商品化雞球蟲病強(qiáng)毒活卵囊疫苗Coccivac-D在美國上市,次年其研發(fā)出含有堆型、巨型、變位和柔嫩艾美耳球蟲強(qiáng)毒株雞球蟲病活卵囊疫苗Coccivac-B。第二種商品化雞球蟲病活卵囊疫苗是1985年加拿大研發(fā)的Immucox-C1、Immucox-C2強(qiáng)毒活疫苗，Immucox-C1和Immucox-C2活疫苗均為未經(jīng)致弱的自然毒力株按一定劑量配制的強(qiáng)毒苗，兩者僅所含球蟲種類稍有差異。由荷蘭Intervet公司生產(chǎn)的強(qiáng)毒活疫苗Nobilis Cox包含有堆型、柔嫩和兩種巨型艾美耳球蟲，其通過飲水或噴霧接種肉雞。英國Houghton實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用早熟選育的致弱方法于1989年成功研制出第一個(gè)雞球蟲病弱毒活卵囊疫苗Paracox-5和Paracox-8，前者包含柔嫩、堆型、和緩和兩個(gè)不同的巨型艾美耳球蟲早熟品系，后者是一種全價(jià)疫苗，包含了柔嫩、堆型、早熟、毒害、和緩、布氏以及兩株不同免疫原性巨型艾美耳球蟲早熟品系。捷克公司以雞胚傳代和早熟選育相結(jié)合的方法，于1992年研制出Livacox-T、Livacox-Q弱毒活卵囊疫苗，Livacox-T含有堆型和巨型艾美耳球蟲早熟品系，同時(shí)含有柔嫩艾美耳球蟲雞胚適用品系，Livacox-Q與其相比增加了毒害艾美耳球蟲早熟品系[31]。由澳大利亞BioProperties公司通過早熟選育的方法研制生產(chǎn)的Eimeriavax弱毒活疫苗，包含了柔嫩、毒害、巨型和堆型艾美耳球蟲弱毒株，可通過滴眼的方法給予肉仔雞、蛋雞和種雞。中國從20世紀(jì)80年代開始研究雞球蟲病弱毒活疫苗的研發(fā)，最早由中國農(nóng)科院上海家畜寄生蟲病研究所生產(chǎn)的雞球蟲病三價(jià)活疫苗是通過理化雙重致弱的方法對(duì)柔嫩、毒害和巨型艾美耳球蟲自然毒力株進(jìn)行減毒，實(shí)現(xiàn)強(qiáng)毒株致弱的目的。由北京農(nóng)學(xué)院研制的雞球蟲病三價(jià)活疫苗是運(yùn)用早熟選育的方法進(jìn)行致弱處理的，其含有柔嫩、堆型和巨型艾美耳球蟲早熟品系，其研制的雞球蟲病四價(jià)活疫苗是包含柔嫩、堆型、巨型和毒害艾美耳球蟲早熟品系。正典生物技術(shù)有限公司以早熟選育技術(shù)于2007和2012年分別研發(fā)了雞球蟲病四價(jià)活疫苗和雞球蟲病三價(jià)活疫苗，其雞球蟲病四價(jià)活疫苗包含了柔嫩、巨型、毒害和堆型艾美耳球蟲四種早熟致弱品系，其雞球蟲病三價(jià)活疫苗與雞球蟲病四價(jià)活疫苗相比少了毒害艾美耳球蟲早熟致弱品系。齊魯青大生物制藥有限公司于2016年上市雞球蟲病三價(jià)活疫苗(商品名為球貝)，該疫苗由柔嫩艾美耳球蟲早熟弱毒株、巨型與堆型艾美耳球蟲自然弱毒株混合制成[32]。于2019年獲得新獸藥證書的廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所雞球蟲病四價(jià)活疫苗，是由柔嫩、毒害艾美耳球蟲早熟減毒株和堆型、巨型艾美耳球蟲自然弱毒株配比制成[33]，見表1。

表1 國內(nèi)外商品化球蟲疫苗

5 結(jié)語

目前，隨著現(xiàn)代養(yǎng)雞業(yè)規(guī)模化、集約化生產(chǎn)快速發(fā)展的同時(shí)，同樣伴隨著雞球蟲對(duì)各種抗球蟲藥產(chǎn)生耐藥性，藥物殘留及藥物生產(chǎn)成本高等問題，使用雞球蟲病免疫預(yù)防成為防控雞球蟲病的有效手段，其中雞球蟲病弱毒活疫苗有著致病力弱，穩(wěn)定性能好，安全性高，免疫原性好等優(yōu)點(diǎn)，使得球蟲致弱蟲株的選育成為弱毒疫苗研制的關(guān)鍵。由于雞胚傳代致弱和理化致弱的方法存在眾多局限性，而通過早熟選育的方法獲得的致弱蟲株具有致病力弱、免疫原性好、遺傳穩(wěn)定等諸多優(yōu)點(diǎn),因此多數(shù)學(xué)者更傾向于利用早熟選育法進(jìn)行球蟲致弱蟲株的選育。現(xiàn)階段雞球蟲病的防控面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，研制高效、安全的雞球蟲病活疫苗將為養(yǎng)雞業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展提供一定的保障。